抗生素微生物檢定法

1、抗生素微生物檢定法抗生素微生物檢定法本法系在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理設(shè)計(jì)，通過檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法?？股匚⑸餀z定包括兩種方法，即管碟法和濁度法。 測(cè)定結(jié)果經(jīng)計(jì)算所得的效價(jià)，如低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%時(shí)，應(yīng)調(diào)整其估計(jì)效價(jià)，重新試驗(yàn)。 除另有規(guī)定外，本法的可信限率不得大于5%。 第一法：管碟法 本法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。 菌懸液的制備 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）懸液：取枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501的營(yíng)

2、養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在3537培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65加熱30分鐘，備用。 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）懸液：取短小芽孢桿菌CMCC（B）63202的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照上述方法制備。 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）懸液：取金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）懸液：取藤黃微

3、球菌CMCC（B）28001的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在2627培養(yǎng)24小時(shí)，或采用適當(dāng)方法制備的菌斜面，用培養(yǎng)基或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。 大腸埃希菌（Escherichia coli）懸液：取大腸埃菌CMCC（B）44103的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）懸液：取啤酒酵母菌（ATCC 9763）的V號(hào)培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于號(hào)培養(yǎng)基瓊脂斜面上。在3235培養(yǎng)24小時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下置含有滅菌玻璃珠的

4、試管中，振搖均勻，備用。 肺炎克雷伯菌（Klebosiella Pneumoniae）懸液：取肺炎克雷伯菌CMCC（B）46117的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用無菌水將菌苔洗下，備用。 支氣管炎博德特菌（Bordetella Bronchiseptica）懸液：取支氣管炎博德特菌CMCC（B）58403的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3235培養(yǎng)24小時(shí)。臨用時(shí)，用無菌水將菌苔洗下，備用。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存，應(yīng)照標(biāo)準(zhǔn)品說明書的規(guī)定。臨用時(shí)照表1的規(guī)定進(jìn)行稀釋。 標(biāo)準(zhǔn)品的品種、分子式及理論計(jì)算值見表2。 供試品

5、溶液的制備：精密稱（或量）取供試品適量，用各品種項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解后，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量照表1的規(guī)定稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛取?表1 抗生素微生物檢定試驗(yàn)設(shè)計(jì)表 兩性霉素B雙碟的制備，用菌層15ml代替兩層。 乙酰螺旋霉素?？箼z定培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為8.08.2。 含3%氯化鈉。 加0.3%葡萄糖。表2 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品品種與理論值雙碟的制備：取直徑約90mm、高1617mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基（照表1）20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至4850（芽孢可至60），加入規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（能得清晰的抑菌圈為度。二劑

6、量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在1822mm，三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在1518mm），搖勻，在每1雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置水平臺(tái)上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置不銹鋼小管（內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm）4個(gè)（二劑量法）或6個(gè)（三劑量法），用陶瓦圓蓋覆蓋備用。 檢定法 二劑量法：取照上述方法制備的雙碟不得少于4個(gè)，在每1雙碟中對(duì)角的2個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余2個(gè)小管中分別滴裝相應(yīng)的高低兩種濃度的供試品溶液；高、低濃度

7、的劑距為2:1或4:1。在規(guī)定條件下培養(yǎng)后，測(cè)量各個(gè)抑菌圈的直徑（或面積），照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（附錄-）中的（2.2）法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。 三劑量法：取照上述方法制備的雙碟不得少于6個(gè)，在每1雙碟中間隔的3個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度（S3）、中濃度（S2）及低濃度（S1）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余3個(gè)小管分別滴裝相應(yīng)的高、中、低三種濃度的供試品溶液；三種濃度的劑距為10.8。在規(guī)定條件下培養(yǎng)后，測(cè)量各個(gè)抑菌圈的直徑（或面積），照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（附錄-）中的（3.3）法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。 第二法：濁度法 本法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小

8、，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。 菌懸液制備 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）懸液：取金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。 大腸埃希菌（Escherichia coli）懸液：取大腸埃希菌CMCC（B）44 103的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537培養(yǎng)2022小時(shí)。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用。 白色念株菌（Candida albicans）懸液：取白色念株菌CMCC（F

9、）98 001的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于10ml號(hào)培養(yǎng)基中，置3537培養(yǎng)8小時(shí)，再用號(hào)培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度，備用。 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存，應(yīng)照標(biāo)準(zhǔn)品說明書的規(guī)定。臨用時(shí)照表3的規(guī)定進(jìn)行稀釋。 標(biāo)準(zhǔn)品的品種、分子式及理論計(jì)算值見表2。 供試品溶液的制備：精密稱（或量）取供試品適量，照各品種項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行供試品溶液的配制。 表3 抗生素微生物檢定濁度法試驗(yàn)設(shè)計(jì)表含試驗(yàn)菌液體培養(yǎng)基的制備：臨用前，取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（3537培養(yǎng)34小時(shí)后測(cè)定的吸光度在0.30.7之間，且劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1），加入到各規(guī)定的液體培養(yǎng)基中，混合，使在試驗(yàn)條件下能

10、得到滿意的劑量-反應(yīng)關(guān)系和適宜的測(cè)定濁度。已接種試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基應(yīng)立即使用。 檢定法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：除另有規(guī)定外，取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量-反應(yīng)線性范圍內(nèi)，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標(biāo)準(zhǔn)品溶液選擇5個(gè)劑量，劑量間的比例應(yīng)適宜（通常為1：1.25或更?。┰嚻犯鶕?jù)估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量溶液選擇中間劑量，每一劑量不少于3個(gè)試管。在各試驗(yàn)管內(nèi)精密加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，再分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液各1.0ml，立即混勻，按隨機(jī)區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測(cè)量的濁度值（通常為4小時(shí)），在線測(cè)定或取出立即加入甲醛溶液（13）0.5ml

11、以終止微生物生長(zhǎng)，在530nm或580nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管的吸光度。同時(shí)另取2支試管各加入藥品稀釋劑1.0ml，再分別加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，其中一支試管與上述各管同法操作作為細(xì)菌生長(zhǎng)情況的陽性對(duì)照，另一支試管立即加入甲醛溶液0.5ml，混勻，作為吸光度測(cè)定的空白液。照標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)和效價(jià)計(jì)算。 抗生素微生物檢定法標(biāo)準(zhǔn)曲線法的計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法的計(jì)算及可靠性檢驗(yàn)1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)品的各濃度lg值及相對(duì)應(yīng)的吸光度列成表4。 按下圖公式（1）和（2）分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸系數(shù)（即斜率）b和截距a，從而得到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程（3）：回歸系數(shù)：b= (1

12、)截距：a= (2)直線回歸方程：Y=bX+a (3)2.回歸系數(shù)的顯著性測(cè)驗(yàn) 判斷回歸得到的方程是否成立，即X、Y是否存在著回歸關(guān)系，可采用t檢驗(yàn)。 假設(shè)H0：b=0，在假設(shè)H0成立的條件下，按下圖公式（4）（6）計(jì)算t值。 估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差：Sy.x= (4)回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤：= （5）t= (6) 式中 為標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)際吸光度；Y為估計(jì)吸光度由標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程（3）計(jì)算得到； 為標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際吸光度的均值； 為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際濃度lg值； 為抗生素標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際濃度lg值的均值。 對(duì)于相應(yīng)自由度（2n-4）給定的顯著性水平（通常 =0.05），查表得t/2（n-2），若tt/2（n-2），則拒絕H0

13、，認(rèn)為回歸效果顯著，即X、Y具有直線回歸關(guān)系；若tt/（2-n），則接受H0，認(rèn)為回歸效果不顯著，即X、Y不具有直線回歸關(guān)系。 3.測(cè)定結(jié)果的計(jì)算及可信限率估計(jì) 3.1抗生素濃度lg值的計(jì)算 當(dāng)回歸系數(shù)具有顯著意義時(shí)，測(cè)得供試品吸光度的均值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程（3），按方程（7）計(jì)算抗生素的濃度lg值?？股氐臐舛萳g值：X0 （7）3.2抗生素濃度（或數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換值）可信限的計(jì)算按公式（4）和（8）計(jì)算得到的抗生素濃度lg值在95%置信水平（=0.05）的可信限。X0的可信限： FL=X±t/2（n-2）·· （8）式中 n為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度數(shù)乘以平行測(cè)定數(shù)；

14、M為供試品的平行測(cè)定數(shù)；X0為根據(jù)線性方程計(jì)算得到的抗生素的濃度lg值； Y0為抗生素供試品吸光度的均值。3.3 可信限率的計(jì)算：按公式（9）計(jì)算得到的抗生素濃度（或數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換值）的可信限率?？尚畔蘼蔉L%×100% （9）式中 X0應(yīng)以濃度為單位。其可信限率除另有規(guī)定外，應(yīng)不大于5%。 3.4供試品含量的計(jì)算：將計(jì)算得到的抗生素濃度（將1g值轉(zhuǎn)換為濃度）再乘以供試品的稀釋度，即得供試品中抗生素的量。 二劑量法或三劑量法：除另有規(guī)定外，取大小一致的已滅菌的試管，在各品種項(xiàng)下規(guī)定的劑量反應(yīng)線性范圍內(nèi)，選擇適宜的高、（中、）低濃度，分別精密加入各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液1.0ml，二劑量的

15、劑距為2：1或4：1，三劑量的劑距為1：0.8。同標(biāo)準(zhǔn)曲線法操作，每一濃度組不少于4個(gè)試管，按隨機(jī)區(qū)組分配將各試管在規(guī)定條件下培養(yǎng)。照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（附錄）中的（2.2）法和（3.3）法進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)及效價(jià)計(jì)算。 培養(yǎng)基及其制備方法 · 培養(yǎng)基I 胨5g；瓊脂1520g；牛肉浸出粉3g；水1000ml；磷酸氫二鉀3g 除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH值使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.88.0或6.56.6，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 胨6g；葡萄糖1g；牛肉浸出粉1.5g；瓊脂1520g；酵母浸出粉6g；水1000

16、ml 除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH值使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.88.0或6.56.6，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 胨5g；磷酸氫二鉀3.68g；牛肉浸出粉1.5g；磷酸二氫鉀1.32g；酵母浸出粉3g；葡萄糖1g；氯化鈉3.5g；水1000ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.07.2，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 胨10g；葡萄糖10g；氯化鈉10g；瓊脂2030g；枸櫞酸鈉10g；水1000ml 除瓊脂和葡萄糖

17、外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，在109加熱15分鐘，于70以上保溫靜置1小時(shí)后濾過，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.06.2，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 胨10g；瓊脂1520g；麥芽糖40g；水1000ml 除瓊脂和麥芽糖外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過，加麥芽糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.27.4，按需要分裝，在115滅菌30分鐘，趁熱斜放使凝固成斜面。 · 培養(yǎng)基 胨8g；磷酸二氫鉀1g；牛肉浸出粉3g；葡萄糖2.5g；酵母浸出粉5g；瓊脂152

18、0g；氯化鈉45g；水1000ml；磷酸氫二鉀3.3g 除瓊脂和葡萄糖外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.27.4，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 胨5g；枸櫞酸鈉10g；牛肉浸出粉3g；瓊脂1520g；磷酸氫二鉀7g；水1000ml；磷酸二氫鉀3g 除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.56.6，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 酵母浸出粉1g；瓊脂1520g；硫酸銨1g；磷酸鹽緩沖液（pH6.

19、0）1000ml；葡萄糖5g 混合上述成分，加熱溶化后濾過，在115滅菌30分鐘。 · 培養(yǎng)基 蛋白胨10g；氯化鈉5.0g；酵母膏2.0g；葡萄糖10.0g；牛肉浸出粉1.0g；水1000ml 除葡萄糖外，混合上述成分，加熱溶化后濾過，加葡萄糖溶解后，搖勻，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為6.5，在115滅菌30分鐘。 · 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 胨10g；肉浸液1000ml；氯化鈉5g 取胨和氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)PH值為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)PH值使滅菌后為7.2±0.2，在115滅菌30分鐘。 · 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 胨10g；瓊脂1520g；氯化鈉5g；肉浸液1000ml 除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)pH使比最終的pH值略高0.20.4，加入瓊脂，加熱溶化后濾過，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.27.4，分裝，在115滅菌30分鐘，