第十二章高效液相色譜ppt課件

1、n n高效液相色譜法高效液相色譜法 n高效液相色譜法高效液相色譜法HPLCHPLC是是2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代末年代末7070年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。析的重要手段。n它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、因而具備速度快、效率高、靈

2、敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相柱經(jīng)典液相柱色譜裝置色譜裝置高效液相色譜儀高效液相色譜儀例：分離例：分離20種氨基酸種氨基酸柱長(zhǎng)：柱長(zhǎng)：170 cm柱徑：柱徑：0.9 cmF：30 mL/ht分離分離: 20 h經(jīng)典柱色經(jīng)典柱色譜譜HPLCt分離：分離：1 h高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法 液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜與氣相色譜的比較 液相色譜與氣相色譜的比較液相色譜與氣相色譜的比較 （l氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)

3、近80的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。 液相色譜能完成難度較高的分離工作，因?yàn)椋阂合嗌V能完成難度較高的分離工作，因?yàn)椋?氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過(guò)程，與樣品分子無(wú)親和作用，樣品分子只與固定相相互平衡過(guò)程，與樣品分子無(wú)親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，作用。而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的

4、液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。 液相色譜固定相類(lèi)型多，如離子交換色譜和排阻色液相色譜固定相類(lèi)型多，如離子交換色譜和排阻色譜。等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜可選擇余地小的。譜。等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜可選擇余地小的。 液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。有利于色譜分離條件的選擇。 （4 4液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的

5、檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。充的。 目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類(lèi)、植物色素、高聚物、氨基酸、多糖類(lèi)、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 適用范圍廣；適用范圍廣； 分離性能好；分離性能好； 分析速度快；分析速度快；流動(dòng)相可選擇性范圍寬；流動(dòng)相可選擇

6、性范圍寬；靈敏度較高；靈敏度較高；色譜柱可反復(fù)使用；色譜柱可反復(fù)使用；流出組分容易收集；流出組分容易收集；平安。平安。類(lèi)類(lèi) 型型主要分離機(jī)理主要分離機(jī)理主要分析對(duì)象或應(yīng)用領(lǐng)域主要分析對(duì)象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附色譜吸附能，氫鍵吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜分配色譜疏水分配作用疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜凝膠色譜溶質(zhì)分子大小溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測(cè)定高分子分離，分子量及其分布的測(cè)定離子交換色譜離子交換色譜庫(kù)侖力庫(kù)侖力無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子分析無(wú)機(jī)離子、有機(jī)離子分析離子排斥色譜離子排斥色譜Do

7、nnanDonnan膜平衡膜平衡有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜疏水分配作用疏水分配作用離子性物質(zhì)分析離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水作用色譜疏水分配作用疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜手性色譜立體效應(yīng)立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜親和色譜生化特異親和力生化特異親和力 蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析應(yīng)用應(yīng)用 由于由于HPLC分離分析的高靈分離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因而，在

8、工業(yè)、科學(xué)研究，尤因而，在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多是通過(guò)等分析，大多是通過(guò)HPLC來(lái)來(lái)完成的。完成的。 右圖是各種右圖是各種HPLC方法的應(yīng)方法的應(yīng)用范圍及對(duì)象用范圍及對(duì)象極性增極性增加加不溶于不溶于水水溶于水溶于水非極性非極性離子離子非離子極性非離子極性吸附吸附反向分反向分配配分配分配正向分正向分配配離子交離子交換換尺寸排尺寸排阻

9、阻凝膠滲凝膠滲透透凝膠過(guò)凝膠過(guò)濾濾分分子子量量一一 液相色譜速率理論液相色譜速率理論uDdCDdCuDCudCDdCHMpmsfsMdpmMpe)()1(2212CuAH 流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響流動(dòng)相流速對(duì)板高的影響 小顆粒填料，填充均勻；小顆粒填料，填充均勻； 選擇較低的流動(dòng)相流速；選擇較低的流動(dòng)相流速； 選擇粘度小的溶劑作流動(dòng)相，改善傳質(zhì)。選擇粘度小的溶劑作流動(dòng)相，改善傳質(zhì)。 修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途徑途徑二二 液相色譜中的柱外譜帶展寬液相色譜中的柱外譜帶展寬1貯液罐(濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì))2高壓泵輸液泵）3進(jìn)樣裝置4色譜柱分別5檢測(cè)器分析6廢液出口或組分收集器

10、 7記錄裝置高壓泵高壓泵流動(dòng)相流動(dòng)相溶劑溶劑廢液廢液色譜柱色譜柱進(jìn)樣口進(jìn)樣口檢測(cè)器檢測(cè)器一一 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)要求要求輸出壓力高輸出壓力高平穩(wěn)、脈沖小平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調(diào)流量穩(wěn)定可調(diào)耐腐蝕耐腐蝕1 高壓泵高壓泵 恒流泵特點(diǎn)是在一定操作恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)，與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)，如往復(fù)式柱塞泵、注射式螺旋如往復(fù)式柱塞泵、注射式螺旋泵；泵； 恒壓泵是指能保持輸出壓力恒恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，如氣

11、動(dòng)泵。性差，如氣動(dòng)泵。2 梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置通過(guò)改變流動(dòng)相的組成來(lái)調(diào)整通過(guò)改變流動(dòng)相的組成來(lái)調(diào)整組分的組分的k k值，改變分離因子值，改變分離因子值，值，以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分以達(dá)到最短時(shí)間內(nèi)得到最佳分離的目的。離的目的。梯度洗脫梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫的特點(diǎn)的特點(diǎn)分配比變化范圍寬的分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品應(yīng)采取復(fù)雜樣品應(yīng)采取梯度洗脫方式分離梯度洗脫方式分離3 貯液瓶及流動(dòng)相貯液瓶及流動(dòng)相1) 對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2) 適用于所選擇的檢測(cè)器。適用于所選擇的檢測(cè)器。3) 化學(xué)惰性好，以

12、免破壞固定相?；瘜W(xué)惰性好，以免破壞固定相。4) 低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。5) 純度高。溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。純度高。溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。對(duì)流動(dòng)相溶劑對(duì)流動(dòng)相溶劑的一般要求的一般要求二二 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)二二 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通閥進(jìn)樣六通閥進(jìn)樣 裝置裝置自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器 三三 色譜柱色譜柱內(nèi)徑：內(nèi)徑：45 mm，柱長(zhǎng)：，柱長(zhǎng)：1050 cm；柱填料粒徑柱填料粒徑3 10m 分離柱分離柱四四 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)溶質(zhì)型檢測(cè)器溶質(zhì)型檢測(cè)器總體檢測(cè)器總體檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器示差折光檢

13、測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器介電常數(shù)檢測(cè)器紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器1 紫外吸收檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器(a) 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(b) 二極管陣列檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器氘燈氘燈光柵光柵流通池流通池測(cè)量光電二極管測(cè)量光電二極管參比光電二極管參比光電二極管2 二極管陣列檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器兩種檢測(cè)器的色譜圖兩種檢測(cè)器的色譜圖(a)：可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；：可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；(b)：二極管陣列檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器(b)(a)nm254 紫外檢測(cè)器靈敏度高，精密度及線性范圍較好紫外檢測(cè)器靈敏度高，精密度及線性范圍較好 ，可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵摗?/p>

14、 流動(dòng)相選擇有限制。流動(dòng)相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)溶劑溶劑CS2氯仿氯仿 四氫四氫呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截紫外截止波長(zhǎng)止波長(zhǎng)/nm380245212210 1902051873 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器靈敏度高，選擇靈敏度高，選擇性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脫。洗脫。 4 示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器利用組分與流動(dòng)利用組分與流動(dòng)相的折射率之差進(jìn)相的折射率之差進(jìn)行檢測(cè)。行檢測(cè)。 通用性好，靈敏通用性好，靈敏度較低，不適用于度較低，不適用于梯度洗脫。梯度洗脫。5 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器6 電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器 電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器

15、安培檢測(cè)器安培檢測(cè)器7 質(zhì)譜檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器五五 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)脫氣裝置脫氣裝置 梯度洗脫梯度洗脫 再循環(huán)再循環(huán) 恒溫恒溫 餾分收集餾分收集及處理及處理分離原理分離原理msccK K不僅與固定相的不僅與固定相的種類(lèi)有關(guān)，也與流種類(lèi)有關(guān)，也與流動(dòng)相的種類(lèi)有關(guān)動(dòng)相的種類(lèi)有關(guān)液液分配色譜液液分配色譜液液色譜液液色譜鍵和相色譜鍵和相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因可將各種極性的官能團(tuán)鍵合到載體表面，因此它適用于種類(lèi)繁多樣品的分離。此它適用于種類(lèi)繁多樣品的分離。缺點(diǎn)缺點(diǎn)特點(diǎn)特點(diǎn)硅膠為基體，利用硅膠表面的硅醇基硅膠為基

16、體，利用硅膠表面的硅醇基(Si一一OH)與有機(jī)分與有機(jī)分子之間成鍵子之間成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類(lèi)即可得到各種性能的固定相。一般可分三類(lèi)（1疏水基團(tuán)疏水基團(tuán) 如不同鏈長(zhǎng)的烷烴如不同鏈長(zhǎng)的烷烴C8和和C18和苯基等；和苯基等；（2極性基團(tuán)極性基團(tuán) 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；（3離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán) 如陰離子交換基團(tuán)：胺基，季銨鹽；陽(yáng)離如陰離子交換基團(tuán)：胺基，季銨鹽；陽(yáng)離子交換基團(tuán)：磺酸等。子交換基團(tuán)：磺酸等。2. 鍵合相色譜法分類(lèi)鍵合相色譜法分類(lèi)反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜:常用固定相：常用固定相：C18常用流動(dòng)相常用流動(dòng)相甲醇甲醇-水水乙腈乙

17、腈-水水反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜疏溶劑分離機(jī)制疏溶劑分離機(jī)制固定相極性固定相極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性離子性鍵合相色譜離子性鍵合相色譜 將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠將各種離子交換基團(tuán)化學(xué)鍵合到硅膠基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色基質(zhì)表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類(lèi)同。譜類(lèi)同。 3.化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn) 存在著雙重分離機(jī)制：存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；低覆蓋率：吸附為主； 反相鍵合相色譜

18、反相鍵合相色譜:常用流動(dòng)相常用流動(dòng)相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜:極性大的先流出，極性小的后流出極性大的先流出，極性小的后流出正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜:極性小的先流出，極性大的后流出極性小的先流出，極性大的后流出一一 吸附色譜法吸附色譜法1 分離原理分離原理nadnadadSXSXK X + nSadXad+SnKad值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。 2 固定相固定相硅膠強(qiáng)極性硅膠強(qiáng)極性氧化鋁弱極性氧化鋁弱極性活性炭非極性活性炭非極性分子篩強(qiáng)極性分子篩強(qiáng)極性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑固體吸附劑3 流動(dòng)相流動(dòng)相(洗脫劑洗脫劑) 越

19、大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸越大，表明流動(dòng)相溶劑分子對(duì)吸附劑的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附附劑的親和能力越強(qiáng)，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來(lái)。劑上將被吸附的溶質(zhì)洗脫下來(lái)。 。 溶劑分子在單位吸附劑表面上的溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能吸附自由能。 溶劑強(qiáng)度參數(shù)溶劑強(qiáng)度參數(shù)硅膠固定相分離苯，甲苯，硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯乙苯，丙苯，丁苯流動(dòng)相：流動(dòng)相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水飽和的正庚烷水飽和的正庚烷改變流動(dòng)相的改變流動(dòng)相的組成可改變分離組成可改變分離的選擇性的選擇性4 應(yīng)用應(yīng)用具有不同官能團(tuán)的化合物具有不同官

20、能團(tuán)的化合物具有相同官能團(tuán)，但數(shù)量不同的具有相同官能團(tuán)，但數(shù)量不同的化合物化合物異構(gòu)體異構(gòu)體例：幾種取代位置不同的硝基例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：的滯留順序：鄰位鄰位間位間位對(duì)對(duì)位位鄰硝基苯胺鄰硝基苯胺間硝基苯胺間硝基苯胺對(duì)硝基苯胺對(duì)硝基苯胺適合分離的物適合分離的物質(zhì)質(zhì)一一 離子交換色譜法離子交換色譜法陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換陽(yáng)離子交換陰離子交換陰離子交換+RSO3-H+H+RSO3-M+M+RNR3+Cl-+X-RNR3+X-Cl-1 分離原理分離原理2 固定相固定相陽(yáng)離子：陽(yáng)離子：SO3H(強(qiáng)強(qiáng))CO2H(弱弱)陰離子：陰離子：N+R3(強(qiáng)強(qiáng))NH2 (弱弱)基基質(zhì)質(zhì)合成樹(shù)脂合成樹(shù)脂纖維素纖維素硅膠硅膠離子交換劑離子交換劑3 流動(dòng)相流動(dòng)相水相緩沖液水相緩沖液+有機(jī)改性劑有機(jī)改性劑調(diào)節(jié)選擇性的調(diào)節(jié)選擇性的主要參數(shù)主要參數(shù)鹽種類(lèi)及濃度鹽種類(lèi)及濃度pH值值各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序： FOHCOOCHHCOOClSCNBrCrONOIOCSO324324