第三章原料的預(yù)處理ppt課件

1、第一節(jié)生物材料靶部位的預(yù)處理 生物體內(nèi)的生化成分包括動(dòng)物、植物及微生物在新陳代謝時(shí)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核酸、多糖、脂類、脂肪酸以及各種初生代謝物和次生代謝物等，這些物質(zhì)與生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等學(xué)科的發(fā)展息息相關(guān)，并促進(jìn)化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)等行業(yè)的快速發(fā)展。生物材料的選擇與培養(yǎng)、生物反應(yīng)液的澄清與過濾、細(xì)胞的破碎與TP的提取、初級(jí)分離等預(yù)處理工作是生化成分有效分離的前提與基礎(chǔ)，直接涉及分離純化的時(shí)效性。一、生物材料的準(zhǔn)備（一） 生物材料的選取與要求 對(duì)于糖、脂、蛋白質(zhì)、核酸、酶等生化成分，動(dòng)物、植物和微生物都可以作為提取和制備的原料，所選用的材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的TP來確定?？傮w來說

2、，主要遵循的原則為：選擇有效成分含量高的新鮮材料；來源豐富易得；制造工藝簡(jiǎn)單易行；成本比較低；綜合利用價(jià)值高，經(jīng)濟(jì)效益好等。1.選擇有效成分含量 (1)生物品種：根據(jù)TP的分布，選擇富含有效成分的生物制品是選材的關(guān)鍵。 (2)合適的組織器官：如免疫球蛋白從血液或富含血液的胎盤組織中提??；制備胃蛋白酶只能選用胃為材料等。 (3)生物的生長(zhǎng)期：生物的生長(zhǎng)期對(duì)有效成分的含量影響很大。2.雜質(zhì)情況 難于分離的雜質(zhì)會(huì)增加工藝的復(fù)雜性，嚴(yán)重影響回收率、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。選材時(shí)，應(yīng)避免與TP性質(zhì)相似的雜質(zhì)對(duì)純化過程的干擾。如胰臟中含有性質(zhì)較為相近的磷酸單酯酶和磷酸二酯酶，兩者難于分開，因此一般不選用胰臟為原料

3、制備磷酸單酯酶，而改用前列腺為原料，因?yàn)樗缓辛姿岫ッ福僮骱?jiǎn)單易行。3.來源 選用來源豐富的材料，盡量不與其他產(chǎn)品爭(zhēng)原料。最好能一物多用，綜合利用。例如，健康男性的尿液可以生產(chǎn)尿激酶、激肽釋放酶、蛋白酶抑制劑、睡眠因子等；用豬心生產(chǎn)細(xì)胞色素c和輔酶Q12；用胰臟制備胰島素和胰酶、胰島素和胰高血糖素、彈性蛋白酶和激肽釋放酶等。（二生物材料的采集與保存生物材料保存的主要方法有：速凍、凍干、有機(jī)溶劑脫水，制成丙酮粉，浸存于甘油和丙酮中等 1.動(dòng)物材料 利用動(dòng)物作為原料來提取所需物質(zhì)，同一種物質(zhì)在不同的生物體中或同一生物體的不同組識(shí)中含量差異很大。而且純化的難易程度也可能差異較大，所以根據(jù)需要，

4、合理取材十分重要。2.植物材料 以植物為原料作為提取物，要視植物材料采收是否具有代表性。如從大田或試驗(yàn)田以及實(shí)金器皿中收取植物材料作為原始樣品，再按原始樣品種類例如植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等分別選出平均樣品，然后根據(jù)目的要求和樣品種類特征，采用適當(dāng)?shù)姆椒◤闹羞x出供提取的材料，同時(shí)還要注意植物的季節(jié)性。對(duì)于藥用植物要求更高。3.微生物材料用微生物作為原料來提取所需物需滿足以下要求：不是致病菌，不產(chǎn)生毒素，要經(jīng)過毒理學(xué)試驗(yàn)；不易突變退化，不易感染噬菌體；產(chǎn)量高；能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)；注意生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶、蛋白質(zhì)、核酸的含量都較高。二、生物材料靶部位的預(yù)處理（

5、一動(dòng)物材料的預(yù)處理：對(duì)于動(dòng)物組織，必須選擇有效成分含量豐富的臟器、組織為原料，并先進(jìn)行絞碎、勻漿、去脂肪、去皮筋等處理。（二植物樣品的預(yù)處理 1.種子樣品的處理： 首先去除雜質(zhì)，后進(jìn)行研磨、粉碎，過80-100目篩，混合均勻保存，貼上注有采樣地點(diǎn)、特性、日期和采樣人等內(nèi)容的標(biāo)簽，若長(zhǎng)期保存還要用蠟封，在容器中放入一點(diǎn)樟腦或?qū)ξ欢燃妆健?2根、莖、葉、果實(shí)樣品的處理：對(duì)于剛采回的新鮮樣品，一般要經(jīng)過凈化、殺青、烘干或風(fēng)干一系列前處理。凈化：從產(chǎn)地采回的新鮮樣品常常沾有泥土等雜質(zhì)，應(yīng)用柔軟濕布擦干凈，勿用水沖洗大量樣品的提取除外）；殺青：為使樣品的化學(xué)成分不發(fā)生轉(zhuǎn)變或損耗，需及時(shí)中止樣品中酶的活

6、性，將樣品在105的烘箱中殺青15-20 min；烘干：樣品經(jīng)過殺青之后，可自然風(fēng)干，也可立即降低烘箱溫度，維持在70-80直到樣品烘干為止，一般8-12 h。（三微生物樣品的預(yù)處理隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大多數(shù)自然界存在的有機(jī)物都可以通過微生物發(fā)酵獲得，尤其是蛋白質(zhì)、酶、核酸等物質(zhì)。因?yàn)槲⑸锞哂蟹N類多、繁殖快、容易培養(yǎng)、代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn)，若從微生物發(fā)酵液中提取TP，第一步就是對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，以改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，提高從懸浮液中分離固形物的速度，提高固形物分離器的效率；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入處理后的某一項(xiàng)中多數(shù)是液相）；取出發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步驟的操作。第二節(jié)生物反應(yīng)液的預(yù)處理生物反

7、應(yīng)液中的雜質(zhì)很多，其中有些雜質(zhì)不僅影響提取物的質(zhì)量和提取率，同時(shí)對(duì)后續(xù)的分離、提取和精制有較大影響。一、無機(jī)離子的去除發(fā)酵液中的無機(jī)離子主要有Ca2+、Mg2+和Fe2+等。Ca2+草酸鈉Mg2+ 三聚磷酸鈉Fe2+ 黃血鹽二、雜蛋白質(zhì)的去除（一沉淀法 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，它的穩(wěn)定性與所帶的電荷有關(guān)。大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)(pH4. 0-5. 5)，但是僅靠調(diào)節(jié)pH還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀，必須與其他方法共用。 （二變性法變性蛋白質(zhì)的溶解度較小，容易形成沉淀而除去。蛋白質(zhì)具有熱敏感性，一般在70-80發(fā)生不可逆變性，有的甚至在50就會(huì)變性。（三凝聚和絮凝要從出發(fā)酶液中獲得澄清酶液就

8、需要過濾或離心，為了加快過濾速度，提高分離效果，出發(fā)酶液需要通過凝聚和絮凝技術(shù)處理，改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其凝結(jié)成較大顆粒。 凝聚(agglomeration)指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定，膠體粒子間因相互碰撞而產(chǎn)生凝聚的現(xiàn)象。 絮凝(flocculation)則是指在某些高分子絮凝劑通常為含有極性官能團(tuán)的聚合物的架橋作用下，將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小的絮凝團(tuán)的過程。聚丙烯酰胺類衍生物、聚丙烯酸類陰離子絮凝劑（四吸附法利用某些吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用，也可以除去雜蛋白質(zhì)。例如，在枯草芽抱桿菌發(fā)酵中，常常加入氯化鈣和

9、磷酸氫二鈉，兩者本身生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體和其他不溶性離子吸附并包裹在其中而沉淀出來。三、色素及其他物質(zhì)的去除發(fā)酵液中的色素可能是微生物生長(zhǎng)代謝過程分泌的，也可能是培養(yǎng)基帶來的，色素物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的多樣性增加了脫色的難度。工業(yè)上應(yīng)用的價(jià)廉而有效的脫色劑是活性炭?；钚蕴棵撋臋C(jī)制是吸附，它既能吸附色素，也能吸附部分酶。第三節(jié)發(fā)酵液的澄清與過濾微生物發(fā)酵液中除了酶和其他代謝產(chǎn)物外，還存在大量的菌體和培養(yǎng)基殘?jiān)?，如不?jīng)過固液分離，而將其中的菌體和殘?jiān)堪ㄔ诿钢苿┲?，這樣根本就談不上任何程度的純化。若用于食品工業(yè)，不僅會(huì)影響食品風(fēng)味，而且影響食品安全，損害人體健康。 固液分離的主要方法是離

10、心分離和過濾，對(duì)微生物酶發(fā)酵液進(jìn)行的固液分離，國(guó)內(nèi)外常用的設(shè)備是轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機(jī)、離心沉降分離機(jī)和板框壓濾機(jī)。 一、影響發(fā)酵液過濾的因素 發(fā)酵液的過濾速度與菌種、各種發(fā)酵條件等因素有關(guān)。菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間。 二、過濾技術(shù)的種類1.根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小，過濾可分為粗濾、微濾、超濾和反滲透四大類。過濾介質(zhì)有多種，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和各種高分子膜等。2.根據(jù)過濾機(jī)制的不同，過濾可以分為澄清和濾餅兩種。0.1g/100mL3.此外，根據(jù)過濾對(duì)產(chǎn)生推動(dòng)力的條件不同，粗濾又可分為常壓過濾、離心過濾、加壓過濾和減壓過濾四種。三、過濾性能優(yōu)化的途徑在生產(chǎn)中常常會(huì)遇到難以過濾的發(fā)酵

11、液，因此需要通過改善過濾性能來提高過濾速度。除了采用絮凝和凝聚等方法外，還可以采用稀釋、加熱等方法降低發(fā)酵液的黏度，或通過加入助濾劑、酶降解等方法，也可以改善發(fā)酵液的過濾性能。助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，從而提高濾速。硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖等。使用助濾劑的方法有兩種：在過濾介質(zhì)表面鋪一層助濾劑；把助濾劑加到發(fā)酵液中。非TP之間的反應(yīng)第四節(jié)細(xì)胞破碎與靶物質(zhì)初步分離一、細(xì)胞破碎 生物體內(nèi)的生化成分種類繁多，存在于不同部位。如青霉素酰化酶、堿性磷酸酶、乙醇脫氫酶等，必須在分離純化前先將細(xì)胞破碎，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物釋放到液相中，才能進(jìn)行提純。不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使

12、用的破碎方法和條件也不同。破碎組織細(xì)胞的方法有很多，依照原理分為機(jī)械破碎法、物理破碎法、化學(xué)破碎法和酶學(xué)破碎法四類。 （一機(jī)械破碎法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力使細(xì)胞破碎的方法稱為機(jī)械破碎法。機(jī)械法的處理量大，組織細(xì)胞破碎速度較快；易因發(fā)熱，導(dǎo)致樣品中活性物質(zhì)的局部變化。1.組織搗碎機(jī)破碎法2.研磨破碎法3.勻漿破碎法高速勻漿器（二物理破碎法 利用溫度、壓力、超聲波和滲透壓等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細(xì)胞的破碎。常用的物理破碎法有反復(fù)凍融法、壓力差破碎法、超聲波和微波破碎法等。 1.反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法是一種利用溫度的變化，通過細(xì)胞的熱脹冷縮

13、作用來破碎細(xì)胞的物理方法。生物組織經(jīng)冷凍后，一方面細(xì)胞膜的疏水鍵破裂，細(xì)胞的親水性增加；另一方面細(xì)胞結(jié)成冰晶，細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞突然膨脹而破裂。 2.干燥法可采用多種方法使細(xì)胞干燥，如空氣干燥法、真空干燥法、噴霧干燥法和冷凍干燥法等。干燥法使細(xì)胞壁膜間的結(jié)合水喪失，細(xì)胞滲透壓改變。當(dāng)用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)就很容易被抽提出來?？諝飧稍锓ㄟm用于酵母，真空干燥法適用于細(xì)菌，冷凍法適用于不穩(wěn)定的酶。 3壓力差破碎法通過壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。常用的方法有高壓沖擊、突然降壓及滲透壓變化等方法。 （1)高壓沖擊法是在結(jié)實(shí)的容器中裝入細(xì)胞

14、和冰晶、石英砂等混合物，然后用活塞或沖擊錘施以高壓沖擊，壓力可達(dá)50500 MPa,從而使細(xì)胞破碎。 (2)突然降壓法又稱為爆炸式降壓法。該方法是將細(xì)胞懸浮液裝入高壓容器，通入氮?dú)饣蚨趸?，加?50 MPa，振蕩幾分鐘，使氣體擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，然后驟然排出氣體，使壓力驟降至常壓，導(dǎo)致細(xì)胞迅速膨脹而破碎。(3)滲透壓破碎法是一種較溫和的細(xì)胞破碎法。將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)到平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者轉(zhuǎn)入滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹而破裂。 4改進(jìn)高壓法改進(jìn)高壓法Xpress法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至3025形

15、成冰晶，利用500 Mpa以上的高壓沖擊，將冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞由于冰晶的磨損變脆而破碎。該方法的細(xì)胞破碎率高，碎片的粉碎程度低，活性的保留率高，但是不適用于提取對(duì)冷凍融解敏感的酶。5超聲波破碎法通過超聲波使細(xì)胞膜產(chǎn)生空穴的作用而使細(xì)胞破碎。超聲波的頻率對(duì)細(xì)胞破碎的效果沒有顯著影響，通常采用的頻率是1525 kHz，所破碎細(xì)胞的程度除與輸出功率和破碎時(shí)間密切相關(guān)外，還受細(xì)胞濃度、溶液黏度、pH、溫度以及離子強(qiáng)度等因素的影響，使用時(shí)需根據(jù)細(xì)胞的種類和酶的特性而加以選擇。 6. 微波破碎法微波破碎細(xì)胞專利技術(shù)是基于微波加熱的選擇性、瞬時(shí)性和高效性，控制適宜的微波條件而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎。其原

16、理是將含水分的微生物菌體及植物組織置于一定強(qiáng)度的微波場(chǎng)中處理，使細(xì)胞受熱，水分汽化，內(nèi)壓增大而導(dǎo)致細(xì)胞破碎。（三化學(xué)破碎法 某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來，這種處理方法稱為化學(xué)滲透法或化學(xué)破碎法。常用的化學(xué)試劑是有機(jī)溶劑和表面活性劑。（四酶學(xué)破碎法即生物學(xué)法） 通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到破碎細(xì)胞的方法稱為酶學(xué)破碎法，或稱為酶促破碎法。這是一種應(yīng)用較廣泛的方法，其原理是利用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁組分間的特殊化學(xué)鍵，從而達(dá)到破碎細(xì)胞的目的。酶溶法可

17、分為外加酶法和自溶法兩種。 1.外加酶法 外加酶法就是根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿?，破壞?xì)胞壁，并在低滲透壓的溶液中使細(xì)胞破裂。其中溶菌酶( lysozyme)的應(yīng)用最廣，能專一地分解細(xì)胞壁上肽聚糖蛋白分子的1，4糖苷鍵，主要對(duì)象為革蘭氏陽性細(xì)菌。該法的優(yōu)點(diǎn)在于專一性強(qiáng)，條件溫和，但是費(fèi)用較貴，一般只適用于小規(guī)模研究。 2.自溶法自溶法(autolysis)是一種特殊的酶溶方式，所需的溶胞酶由生物細(xì)胞自身產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)胞在一定的pH和適宜的溫度條件下保溫一段時(shí)間后，即可通過細(xì)胞自身存在的酶系將細(xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋出，其效果取決于自溶條件。二、TP的選擇性釋放細(xì)胞破碎的目的是要得到一

18、種或多種TP。因細(xì)胞內(nèi)存在著許多生物物質(zhì)，有的放矢地選擇性釋放TP,而使其他物質(zhì)盡量少的釋放出來就顯得十分重要。如利用化學(xué)滲透法選擇性釋放TP圖10-2）。 選擇性釋放TP的一般原則如下： (1)僅需破壞或破碎TP存在的靶位點(diǎn)。當(dāng)TP存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用酶學(xué)破碎法、反復(fù)溶凍法等較溫和的方法；當(dāng)TP存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用較為強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法。 (2)選擇性溶解TP。當(dāng)TP與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合時(shí)，一方面調(diào)整溶液的離子強(qiáng)度、pH或添加表面活性劑、螯合劑等與TP有親和性的試劑，使TP溶解釋放；另一方面注意溶液的性質(zhì)，使其他雜質(zhì)不易釋放。三、TP的提取 提取是指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚碓?/p>

19、料，并從原材料中把有效成分分離出來的過程。經(jīng)過預(yù)處理和細(xì)胞破碎的原材料，可用緩沖液、稀酸、稀堿或有機(jī)溶劑等抽提有效成分，甚至還可以用蒸餾水直接抽提。理想的抽提溶液一般應(yīng)具備如下特點(diǎn)：對(duì)有效成分溶解度大而破壞性??；對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很??；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。抽提的原則是“少量多次”，即對(duì)于等量的用于抽提的溶液，分多次抽提比一次抽提效果要好。 四、TP的初級(jí)分離 TP的初級(jí)分離是指清除大量非TP。常用的方法主要有沉淀法、超濾法和透析法等。（一沉淀法 沉淀法也稱溶解度法，其純化生物成分的基本原理是：根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異，如蛋白質(zhì)分子表面疏水集團(tuán)和親水集團(tuán)之間比例的差異等，來改變?nèi)芤旱?/p>

20、pH、極性、離子強(qiáng)度和金屬離子等，使抽提液中有效成分的溶解度發(fā)生改變，從而分離出有效成分。（二超濾法 超濾法是通過在溶液的表面施加一定的壓力，并通過一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的純化方法。在一定壓力下，溶液中的溶劑和小分子可透過選擇性薄膜，而大分子則受阻而被截留。（三透析法 透析法是指將待處理的溶液放于具有半透膜性質(zhì)的玻璃紙袋中，然后將紙袋放在水中或適當(dāng)?shù)碗x子強(qiáng)度的緩沖液中，無機(jī)鹽及一些小分子的代謝產(chǎn)物，由于擴(kuò)散作用通過半透膜而被去除,TP則仍然保留在袋中。 五、預(yù)處理應(yīng)用范例 （一從乳牛胸腺中提取胸腺素從乳牛胸腺中提取胸腺素的基本過程是：對(duì)所選取的新鮮、健康乳牛胸部的胸腺去脂肪、去結(jié)締組織和去血污后，用無菌水洗滌，經(jīng)20冷凍保存，剪碎，加滅菌生理鹽水，勻漿，再于20反復(fù)凍融，用HCI調(diào)節(jié)pH，室溫抽提并離心，取上清液，調(diào)pH至中性，置80水浴保溫20 min，然后驟冷離心，收集上清液