elisa結(jié)果影響因素 ppt課件

1、ELISAELISA測(cè)定結(jié)果影響因素測(cè)定結(jié)果影響因素2022-4-17主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、 ELISA簡(jiǎn)介二、ELISA試驗(yàn)結(jié)果影響因素 ELISA簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介ELISA( EnzymeLinked Immunosorbnent Assay )是酶聯(lián)接免疫吸附測(cè)定的簡(jiǎn)稱。是一種免疫學(xué)測(cè)定方法，主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)液體標(biāo)本中目的蛋白性質(zhì)、功能及含量。ELISA實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學(xué)活性并能相互特異性結(jié)合。l抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)二抗結(jié)合，l加入合適的底物，在酶的作用下顯色，l顏色深淺與特異性抗體成比例關(guān)系，l可進(jìn)行定性和定量分析?？乖贵w反應(yīng)

2、的抗原抗體反應(yīng)的特異性特異性 +酶高效催化反應(yīng)的酶高效催化反應(yīng)的專一性專一性ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)方法抗原測(cè)定方法抗原測(cè)定方法抗體測(cè)定方法抗體測(cè)定方法雙抗體夾心法雙抗體夾心法 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法 雙抗原夾心法雙抗原夾心法競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法 間接法間接法主要操作流程主要操作流程+ +已知抗體已知抗體包被于載體表面包被于載體表面加待檢物加待檢物無抗原與抗體結(jié)合無抗原與抗體結(jié)合- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E已知抗體已知抗體包被于載體表面包被于載體表面加待檢物加待檢物抗原與抗體結(jié)合抗原與抗體結(jié)合加酶標(biāo)抗體加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合與抗原結(jié)合加酶作用的底物加酶作用的底物產(chǎn)生顏色產(chǎn)生顏色加酶標(biāo)

3、抗體加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合與抗原結(jié)合加酶作用的底物加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色不產(chǎn)生顏色雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原ELISA結(jié)果判定結(jié)果判定1.定性測(cè)定定性測(cè)定(1)肉眼觀察：比較檢測(cè)孔與對(duì)照孔的顏色。肉眼觀察：比較檢測(cè)孔與對(duì)照孔的顏色。(2)陽性判定值法陽性判定值法(cut-offvalue，CO值值)：一般為陰性對(duì)：一般為陰性對(duì)照的平均照的平均A值加一個(gè)常數(shù)，標(biāo)本值加一個(gè)常數(shù)，標(biāo)本A值值CO值即為陽性。值即為陽性。(3)抑制率法：在競(jìng)爭(zhēng)抑制法中結(jié)果可用抑制率表示。抑制率法：在競(jìng)爭(zhēng)抑制法中結(jié)果可用抑制率表示。抑制率抑制率()(陰性對(duì)照陰性對(duì)照A-待測(cè)待測(cè)A)陰性對(duì)照陰性對(duì)照AX100,一

4、般以抑制率一般以抑制率50為陽性為陽性2.半定量測(cè)定半定量測(cè)定結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進(jìn)行進(jìn)行ELISA檢測(cè)，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為檢測(cè)，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為該標(biāo)本的該標(biāo)本的“滴度滴度”。3.定量測(cè)定定量測(cè)定用己知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行用己知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測(cè)定，與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果測(cè)定，與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或活性單位表示。以絕對(duì)量或活性單位表示。ELISA結(jié)果判定結(jié)果判定結(jié)果判定方法的選擇：間接法和夾心法間接法和夾心法ELSIA（陽性孔呈色

5、深于陰性孔（陽性孔呈色深于陰性孔)競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA（陽性孔呈色淺于陰性孔）（陽性孔呈色淺于陰性孔）1.定性結(jié)果可以用肉眼判定 2.陽性判定值3.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值 1.陽性判定值法2. 抑制率法3.不可用肉眼判斷結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素 ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些錯(cuò)誤結(jié)果。引起錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：1、標(biāo)本因素 2、試劑因素 3、操作因素 4、環(huán)境因素。 結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素標(biāo)本因素標(biāo)本因素內(nèi)源性物質(zhì)內(nèi)源性物質(zhì)類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子補(bǔ)補(bǔ)體體嗜異性抗體嗜異性抗體自身抗體自身抗體

6、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗體醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗體交叉反應(yīng)物交叉反應(yīng)物外源性物質(zhì)外源性物質(zhì)標(biāo)本溶血標(biāo)本溶血標(biāo)本污染標(biāo)本污染貯存過久貯存過久凝集不全凝集不全采血管中添加物采血管中添加物 標(biāo)本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素標(biāo)本因素標(biāo)本因素內(nèi)源性物質(zhì)：內(nèi)源性物質(zhì)：（1類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子與與ELISA系統(tǒng)中的捕捉抗體及酶標(biāo)記二抗的系統(tǒng)中的捕捉抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，導(dǎo)段直接結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。致假陽性結(jié)果。解決辦法是：用解決辦法是：用F(ab)2替代完整的替代完整的IgG；標(biāo)本用；標(biāo)本用聯(lián)有熱變性聯(lián)有熱變性63，10minIgG的固相

7、吸附劑處理將熱變性的固相吸附劑處理將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；檢測(cè)抗原時(shí)，可以用加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基乙醇巰基乙醇等加入到標(biāo)本等加入到標(biāo)本稀釋液中，使稀釋液中，使RF降解。降解。（2補(bǔ)體補(bǔ)體ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其其FC段的補(bǔ)體段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，使分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來，使C1q可以將二者連可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：用接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：用EDTA稀釋標(biāo)本；稀釋標(biāo)本；用用53，10min或或56，

8、30min加熱血清使加熱血清使C1q滅活。滅活。（3嗜異性抗體嗜異性抗體人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物如鼠等人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物如鼠等Ig(s)結(jié)合的天然結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動(dòng)性。解決辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過量的動(dòng)物物Ig(s)，但加入，但加入量不足或亞類不同時(shí)無效。量不足或亞類不同時(shí)無效。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素標(biāo)本因素標(biāo)本因素（4嗜靶抗原的自身抗體嗜靶抗原的自身抗體抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與抗甲狀腺球蛋

9、白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。解決的辦法：測(cè)定前用理化方法將其解離。解決的辦法：測(cè)定前用理化方法將其解離。（5醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig(s)抗體抗體鼠源性鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使病人體體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬

10、傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig(s)抗體。這些病人抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig(s)。（6交叉反應(yīng)物質(zhì)交叉反應(yīng)物質(zhì)類地高辛、類類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)原時(shí)，假如交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定，假如交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定

11、簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素標(biāo)本因素標(biāo)本因素外源性物質(zhì)：外源性物質(zhì)：（1標(biāo)本溶血標(biāo)本溶血紅細(xì)胞溶解釋放的血紅蛋白具有過氧化物酶活性，在以辣根過紅細(xì)胞溶解釋放的血紅蛋白具有過氧化物酶活性，在以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的氧化物酶為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，故標(biāo)本采測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，故標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)避免溶血。集時(shí)應(yīng)避免溶血。（2標(biāo)本受細(xì)菌污染標(biāo)本受細(xì)菌污染菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，同溶血標(biāo)本一樣，可菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，同溶血標(biāo)本一樣，可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。（3標(biāo)

12、本保存不當(dāng)標(biāo)本保存不當(dāng)標(biāo)本放置時(shí)間過長(zhǎng)一天以上），會(huì)使抗原或抗體免疫活性減標(biāo)本放置時(shí)間過長(zhǎng)一天以上），會(huì)使抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。弱，亦可出現(xiàn)假陰性。冰箱中久存的標(biāo)本，血清中冰箱中久存的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚可聚合成多聚體、體、AFP可形成二聚體，在間接法可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過深、甚至至假陽性；為克服上述干擾，假陽性；為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清測(cè)定的血清標(biāo)本宜為新鮮采集標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4，1周后測(cè)定周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低

13、溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素標(biāo)本因素標(biāo)本因素（4標(biāo)本凝集不全標(biāo)本凝集不全在沒有促凝劑和抗凝劑的情況下，正常血液采集后在沒有促凝劑和抗凝劑的情況下，正常血液采集后1.52h開始凝開始凝固，固，1824h完全凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取完全凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)

14、行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完全，蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮匝逯胁辉儆欣w維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮浴楸苊馍鲜龈?。為避免上述干擾作用，血液標(biāo)本采集后最好使其充分凝固再分離血清，或標(biāo)本采集擾作用，血液標(biāo)本采集后最好使其充分凝固再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?。管中加入適當(dāng)?shù)?/p>

15、促凝劑。（5標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響抗凝劑如肝素，抗凝劑如肝素，EDTA）、酶抑制劑如）、酶抑制劑如NaN3可抑制可抑制ELISA系系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性及分離膠等均對(duì)統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性及分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作測(cè)定有一定干擾作用。用。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素標(biāo)本因素標(biāo)本因素1.許斌等.ELISA檢測(cè)HBsAg影響因素的探討. 臨床檢驗(yàn)雜志.2000.VoI.18.No.4表 1 內(nèi)外源物質(zhì)的干擾結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素試劑因素試劑因素試劑的選擇試劑的選擇試劑的選擇是保證血液檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)試劑的選擇是保證血液檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵要素。不同廠家的試劑在使用效果上存

16、鍵要素。不同廠家的試劑在使用效果上存在差異。要選購知名度相對(duì)高、信譽(yù)可靠在差異。要選購知名度相對(duì)高、信譽(yù)可靠的試劑。的試劑。重視試劑質(zhì)量同時(shí)有效地進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)重視試劑質(zhì)量同時(shí)有效地進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控以及參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)?？匾约皡⒓邮议g質(zhì)量評(píng)價(jià)。特別是室間質(zhì)特別是室間質(zhì)評(píng)可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)本身不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，評(píng)可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)本身不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異，了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異，幫助校正幫助校正使結(jié)果具有可比性。使結(jié)果具有可比性。試劑盒中陰性對(duì)照的質(zhì)量尤為重要，試劑盒中陰性對(duì)照的質(zhì)量尤為重要，當(dāng)陰性對(duì)照吸光度當(dāng)陰性對(duì)照吸光度（OD值較高，夾心法值較高，夾心法易產(chǎn)生假陰性，易產(chǎn)生假陰性

17、，而競(jìng)爭(zhēng)抑制法易產(chǎn)生假陽而競(jìng)爭(zhēng)抑制法易產(chǎn)生假陽性。性。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素試劑因素試劑因素試劑的準(zhǔn)備試劑的準(zhǔn)備1.觀察外包裝，有無漏液，注意效期等。觀察外包裝，有無漏液，注意效期等。2.仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。行操作。3.操作前將試劑在室溫下平衡操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘，保分鐘，保證酶等液體的初始反應(yīng)溫度及活性劑的溶解。證酶等液體的初始反應(yīng)溫度及活性劑的溶解。液體溫度 吸頭溫度的 移取的液體體積會(huì) 偏大液體溫度 吸頭溫度的 移取的液體體積會(huì) 偏小結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素 加樣加樣 溫育時(shí)間和溫度溫育時(shí)間和

18、溫度 洗板洗板 顯色顯色 比色比色結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素l加樣加樣l加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)如有氣泡，抗原抗體不能和產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)如有氣泡，抗原抗體不能有效地結(jié)合會(huì)導(dǎo)致弱陽性甚至假陰性。有效地結(jié)合會(huì)導(dǎo)致弱陽性甚至假陰性。l每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。l加酶結(jié)合物、加底物，應(yīng)使加液量準(zhǔn)確均一，加酶結(jié)合物、加底物，應(yīng)使加液量準(zhǔn)確均一，加液過程迅速完成。滴加時(shí)，除了要注意滴加加液過程迅速完成。滴加時(shí)，除了要注意滴加的角度垂直外，滴加的速度也很重要。滴加太的

19、角度垂直外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象。象。l有些測(cè)定需用稀釋的血清，應(yīng)保證稀釋液與血有些測(cè)定需用稀釋的血清，應(yīng)保證稀釋液與血清混合均勻。清混合均勻。l結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素 曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶(zone of equivalence)。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，形成的沉淀物最多，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比(optimalratio)。鉤狀效應(yīng)：即鉤狀效應(yīng)：即HOOK效應(yīng)效應(yīng),是指由于抗原抗體比例是指由于抗原抗體比例不合適而

20、導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過量叫做不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過量叫做前帶效應(yīng)；抗原過量叫做后帶效應(yīng)。前帶效應(yīng)；抗原過量叫做后帶效應(yīng)。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素正常情況下的雙抗體夾心法ELISA反應(yīng)一步法抗原過量時(shí)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)特點(diǎn)：不易發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的影響：強(qiáng)陽性 假陰性解決方法：標(biāo)本稀釋結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素2王珂等.ELISA法測(cè)梅毒螺旋體抗體鉤狀效應(yīng)2例分析.中國誤診學(xué)雜志.2019Vol8No.33.表表2不同血清稀釋度下的不同血清稀釋度下的S/OD值值OD值為值為0.105）項(xiàng)目項(xiàng)目原倍原倍1:21:41:81:161:321:641:1281:25

21、6標(biāo)本10.923.778.1112.2515.2417.8816.3410.887.58標(biāo)本20.632.594.835.8210.037.495.783.952.60l溫育成敗關(guān)鍵）溫育成敗關(guān)鍵）l每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式，其中溫度和每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間是重要因素。溫育時(shí)間是重要因素。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素3.劉運(yùn)保.操作因素對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué).2019.Vol.16.No.4表3 不同孵育條件對(duì)結(jié)果的影響4許萍等.不同溫育環(huán)境ELISA檢測(cè)抗HCV的比較.臨床檢驗(yàn)雜志.2019.Vol.20.Mo.3A.1、2、3

22、全部在雅培鼓風(fēng)式恒溫系統(tǒng)溫育B.1、2、3全部在水浴恒溫箱溫育C.1、2干式3水浴D.1、2水浴3干式E.1水浴2、3干式F.1干式2、3水浴G.1水浴2干式3水浴H. 1干式2水浴3干式1.反應(yīng)板中加待檢樣品3760min2.加酶標(biāo)記物3760min3.加底物溶液3730min表表4不同溫育條件下的檢測(cè)結(jié)果不同溫育條件下的檢測(cè)結(jié)果結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素l邊緣效應(yīng)l 使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)生“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫置于37溫箱(非水浴)

23、，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。l 所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。 另外，酶標(biāo)板也是一個(gè)比較重要的因素，選擇質(zhì)量好一點(diǎn)的板能一定程度減少板內(nèi)誤差。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素51.許斌等.ELISA檢測(cè)HBsAg影響因素的探討. 臨床檢驗(yàn)雜志.2000.VoI.18.No.4結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素l洗板洗板l在在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。ELISA就就是靠洗滌來達(dá)

24、到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。結(jié)果影響因素結(jié)果影響因素操作因素操作因素l顯色顯色l有研究報(bào)道按有研究報(bào)道按A、B液的順序分別滴加液的順序分別滴加和將和將A、B液混合后滴加，檢測(cè)結(jié)果有顯著差液混合后滴加，檢測(cè)結(jié)果有顯著差異異,中值陽性和高值陽性分別平均下降了中值陽性和高值陽性分別平均下降了33.6%和和30.0%2。lOPD鄰苯二胺底物顯色一般在室溫鄰苯二胺底物顯色一般在室溫或或37反應(yīng)反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行。光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行。lTMB四甲基聯(lián)苯胺受光照