熒光定量PCR技術(shù)-講座ppt課件

1、實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)的技術(shù)的原理、運(yùn)用及實(shí)際原理、運(yùn)用及實(shí)際(Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCRReal time Quantitative PCR 基 本 原 理themegalleryCompany name 根本原理根本原理themegalleryCompany nameReal-time qPCR的定量原理的定量原理2Real-time qPCR的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法3Real-time qPCR的根本概念的根本概念1Real-time qPCR的解析方法的解析方法4Real-time qPCR的

2、計(jì)算方法的計(jì)算方法5Real-time qPCR的定義的定義themegalleryCompany name實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)： 利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，經(jīng)過(guò)Ct值和規(guī)范曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。 Real-time PCR儀 ABI7500PCR：根本原理：根本原理Denaturation: 94 96CAnnealing: 50 65CExtension: 70 75C根本要素：根本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or TthemegalleryCompany name

3、 與普通與普通PCRPCR的比較的比較S形曲線，具有平臺(tái)效應(yīng)形曲線，具有平臺(tái)效應(yīng)終點(diǎn)檢測(cè)法終點(diǎn)檢測(cè)法反響效率差別的累積使反響效率差別的累積使終點(diǎn)定量幾乎不能夠終點(diǎn)定量幾乎不能夠不同濃度的起始模板經(jīng)不同濃度的起始模板經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增后到達(dá)某一定擴(kuò)增后到達(dá)某一定值時(shí)所需求的循環(huán)數(shù)來(lái)值時(shí)所需求的循環(huán)數(shù)來(lái)計(jì)算起始模板量計(jì)算起始模板量 定量原理定量原理themegalleryCompany name理想的PCR反響： X=X0*2n實(shí)踐的PCR反響： X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反響的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率 定量原理定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物到達(dá)閾值線時(shí):

4、XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)到達(dá)閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) Ct+ log M (3) log(1+Ex) Ct=- log X0 + log M Ct=-klogX0+b themegalleryCompany namethemegalleryCompany name 每個(gè)模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多， CT 值越小。確定初始模板的濃

5、度確定初始模板的濃度 定量原理Ct=-klogX0+bCt=-klogX0+breal-time qPCR使確定模板初始數(shù)量成為能夠使確定模板初始數(shù)量成為能夠11實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR中的三個(gè)概念中的三個(gè)概念擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線 (primary curve) (primary curve)熒光閾值熒光閾值threshold)threshold)CT CT 值值(Cycle Threshold)(Cycle Threshold) 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線 (primary curve) (primary curve)themegalleryCompany name熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件

6、熒光檢測(cè)元件擴(kuò)增曲線：隨著PCR反響的進(jìn)展，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷添加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，搜集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光增長(zhǎng)曲線圖橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)Cycle；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 themegalleryCompany name 熒光閾值熒光閾值threshold)是在擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在PCR反響指數(shù)擴(kuò)增階段恣意位置上，但普通熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反響前3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)規(guī)范偏向的10倍。閾值線閾值線 原那么：1要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值； 2同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段 CT 值值(Cycle Threshold)themeg

7、alleryCompany nameCtCt值的定義：值的定義： PCR PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)到擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) value themegalleryCompany nameCtCt值的特點(diǎn)：值的特點(diǎn)：一樣模板進(jìn)展一樣模板進(jìn)展9696次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct Ct值那么極具重現(xiàn)性值那么極具重現(xiàn)性 檢測(cè)方法檢測(cè)方法themegalleryCompany name非特異性熒光標(biāo)志：非特異性熒光標(biāo)志： SYBR Green I SYBR Green I特異

8、性熒光標(biāo)志：特異性熒光標(biāo)志：水解探針：水解探針： TaqMan TaqMan非水解探針：非水解探針：Molecular beaconMolecular beacon 17 解析方法解析方法規(guī)范曲線分析規(guī)范曲線分析融解曲線分析融解曲線分析絕對(duì)定量和相對(duì)定量絕對(duì)定量和相對(duì)定量themegalleryCompany nameTm值值確認(rèn)PCR反響的特異性融解曲線分析融解曲線分析themegalleryCompany name融解曲線分析，單一峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確融解曲線分析融解曲線分析themegalleryCompany name

9、初始模板量的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)Ct值呈線性關(guān)系，就可以制造以起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)的規(guī)范曲線。熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)初始模板量對(duì)數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)規(guī)范曲線循環(huán)數(shù)規(guī)范曲線.未知未知10410310610510210規(guī)范曲線分析規(guī)范曲線分析計(jì)算樣品的起始拷貝數(shù)知基因拷貝數(shù)的規(guī)范品建立規(guī)范曲知基因拷貝數(shù)的規(guī)范品建立規(guī)范曲線線關(guān)鍵： DNA的準(zhǔn)確定量themegallery絕對(duì)定量絕對(duì)定量Sample2522表達(dá)量表達(dá)量校正樣品量校正樣品量?jī)?nèi)參內(nèi)參beta-actin、GAPDH基因、基因、 rRNA等看等看家基因家基因在細(xì)胞中的表達(dá)在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組

10、中量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境要素影響受環(huán)境要素影響較小較小目的基因目的基因/內(nèi)標(biāo)基內(nèi)標(biāo)基因，均一化為每因，均一化為每個(gè)細(xì)胞或基因組個(gè)細(xì)胞或基因組對(duì)應(yīng)的目的基因?qū)?yīng)的目的基因數(shù)量數(shù)量以各自樣本中內(nèi)參基由于規(guī)范，比較不同樣本中目的以各自樣本中內(nèi)參基由于規(guī)范，比較不同樣本中目的基因的相對(duì)表達(dá)豐度基因的相對(duì)表達(dá)豐度23相對(duì)定量的數(shù)據(jù)處置相對(duì)定量的數(shù)據(jù)處置Ct CtPfaffl ModificationVandesompele Method非均一化的非均一化的需求后續(xù)的需求后續(xù)的均一化均一化以內(nèi)參基因作以內(nèi)參基因作為規(guī)范為規(guī)范目的樣品的相目的樣品的相對(duì)定量經(jīng)過(guò)內(nèi)參對(duì)定量經(jīng)過(guò)內(nèi)參基因

11、的相對(duì)定量基因的相對(duì)定量進(jìn)展均一化進(jìn)展均一化只需一個(gè)內(nèi)參只需一個(gè)內(nèi)參基因基因假設(shè)擴(kuò)增效率假設(shè)擴(kuò)增效率為為100%擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率不同不同只需一個(gè)只需一個(gè)內(nèi)參基因內(nèi)參基因擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率不同不同多個(gè)內(nèi)參多個(gè)內(nèi)參基因基因簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜 比較Ct法 2 -CtFold induction = 23 = 8themegalleryCompany namesample內(nèi)參內(nèi)參目的基因目的基因Tissue #1: 2122Tissue #2: 20 241st Delta Ct #1:22-21 = 1 Ct #2:24-20 = 42nd Delta Ct:4-1 = 3相對(duì)定量方法相對(duì)定量方法 Ct存在

12、的問(wèn)題存在的問(wèn)題themegalleryCompany name成立條件：假設(shè)擴(kuò)增效率為成立條件：假設(shè)擴(kuò)增效率為100%滿足條件：滿足條件：1內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率接近內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率接近 2內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率為內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率為90%-110%相對(duì)定量方法相對(duì)定量方法 實(shí) 驗(yàn) 流 程themegalleryCompany name 應(yīng)應(yīng) 用用 v定量 基因表達(dá)程度檢測(cè)v定量 基因拷貝數(shù)檢測(cè)v多色標(biāo)志 SNP檢測(cè)v高精度溶解曲線分析HRM- SNPv高精度溶解曲線分析HRM- DNA甲基化分析 基因表達(dá)程度檢測(cè)基因表達(dá)程度檢測(cè) themegalleryC

13、ompany name樣本處置樣本處置RNA提取提取qPCR數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析實(shí) 驗(yàn) 流 程逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 樣本處置與樣本處置與RNA提取提取v外界刺激 可檢測(cè)的表達(dá)改動(dòng)v樣品分開(kāi)定義環(huán)境 裂解、固定細(xì)胞vTrizon v裂解液 氰酸胍，異硫氰酸呱， SDSv液氮vRNA保管液 v小心DNA污染！v運(yùn)用DNase v以RNA作PCR陰性對(duì)照 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游運(yùn)用：能否檢測(cè)其它基因？下游運(yùn)用：能否檢測(cè)其它基因？Abundant RNA的干擾：的干擾：mRNA or total RNA？檢測(cè)靈敏度能否足夠？檢測(cè)靈敏度能否足夠？能否會(huì)有二級(jí)構(gòu)造干擾？能否會(huì)有二級(jí)構(gòu)造干擾？ 一

14、步法還是兩步法？一步法還是兩步法？?jī)刹椒ǎ?步驟多但靈敏多樣。cDNA可長(zhǎng)期保管檢 測(cè)多個(gè)基因。便于反響優(yōu)化。引薦：任務(wù)的初期階段 RealSYBR RealSYBR 二步法熒光定量二步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX RealSYBR RealSYBR 一步法熒光定量一步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX RealSuper RealSuper 二步法熒光定量二步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX一步法：簡(jiǎn)便、快捷但只做一個(gè)基因，一旦一步法：簡(jiǎn)便、快捷但只做一個(gè)基因，一旦失敗失敗 難

15、以查找緣由。難以查找緣由。 引薦：任務(wù)的成熟階段引薦：任務(wù)的成熟階段 RealSuper RealSuper 一步法熒光定量一步法熒光定量PCRPCR試劑盒試劑盒/With ROX/With ROX Master mix的優(yōu)化的優(yōu)化vHotstarv化學(xué)修飾，低溫下酶活抑制強(qiáng)，熱復(fù)活需10分鐘vFast Hotstarv抗體或oligo修飾，熱復(fù)活僅需幾十秒 CW0696 CW0704熱啟動(dòng)DNA聚合酶 反響條件優(yōu)化反響條件優(yōu)化內(nèi)參基因內(nèi)參基因單一特異性產(chǎn)物單一特異性產(chǎn)物反響效率反響效率90%-110% 反響條件優(yōu)化反響條件優(yōu)化目的基因目的基因單一特異性產(chǎn)物單一特異性產(chǎn)物反響效率接近內(nèi)參基因反

16、響效率接近內(nèi)參基因反響效率盡量高反響效率盡量高 內(nèi)參基因內(nèi)參基因 高豐度高豐度 ACTB，GAPDH中等豐度中等豐度 beta2M低豐度低豐度 HPRT136擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)原那么擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)原那么二級(jí)構(gòu)造二級(jí)構(gòu)造頸環(huán)構(gòu)造頸環(huán)構(gòu)造片段長(zhǎng)度片段長(zhǎng)度75-200bp最正確長(zhǎng)度最正確長(zhǎng)度80-120bp有限的二級(jí)構(gòu)造有限的二級(jí)構(gòu)造二級(jí)構(gòu)造的預(yù)測(cè)二級(jí)構(gòu)造的預(yù)測(cè)用用mFold /mfold/applications引物防止位于頸引物防止位于頸環(huán)構(gòu)造上環(huán)構(gòu)造上總原那么與普通總原那么與普通PCRPCR一樣一樣 二級(jí)構(gòu)造二級(jí)構(gòu)造themegalleryCompany nam

17、ev擴(kuò)增產(chǎn)物的二級(jí)構(gòu)造引物防止位于頸環(huán)構(gòu)造上引物防止位于頸環(huán)構(gòu)造上themegalleryCompany name引物的位置themegalleryCompany name556065溫度對(duì)二級(jí)構(gòu)造的影響themegalleryCompany name實(shí) 踐themegalleryCompany name實(shí) 踐內(nèi)參基因的規(guī)范曲線的繪制與數(shù)據(jù)分析themegalleryCompany name樣本：293T細(xì)胞株 人提取方法：Trizon RNA 提取試劑 CWBIO 公司 CW0580闡明書(shū)2106 個(gè)細(xì)胞總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖RNA提取themegalleryCompany name逆轉(zhuǎn)

18、錄：HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒 CWBIO 公司 CW0744闡明書(shū)取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)展電泳體系：2 TaqMasterMix 10ulGAPDHF引物10um0.5ulGAPDHR引物10um0.5ulcDNA 1u參與滅菌水至20 ul。逆轉(zhuǎn)錄themegalleryCompany name模板 cDNA模板稀釋倍數(shù)10000倍1000倍100倍10倍引物內(nèi)參基因引物 模板模板反響體系的配置反響體系的配置cDNA 模板 2.0l正向引物F(10M) 0.5l反向引物R (10M 0.5lREALSYBR Mixture(2) 10.0lddH2O 7.0lTotal 20.0lthemegalleryCompany name留意：1、為了防止加樣誤差，做預(yù)混體系 2、充分混勻，如有氣泡短暫離心themegalleryCompany name95 5min95 10-15sec60 20-30secPlate readGo to 2 for 39 cycles moreMelting curve analysis: from 72 to 95, read every 0.2