測序分析常見問題整理學習教案

1、會計學1測序分析測序分析(fnx)常見問題整理常見問題整理第一頁，共31頁。四色圖譜四色圖譜(tp)：每一種顏色對應一：每一種顏色對應一種堿基種堿基ATCG第1頁/共31頁第二頁，共31頁。 影響影響(yngxing)(yngxing)測序質量的主要測序質量的主要因素因素第2頁/共31頁第三頁，共31頁。 一、引物對測序結果一、引物對測序結果(ji gu)(ji gu)的影響的影響第3頁/共31頁第四頁，共31頁。合成時部分引物合成時部分引物多多一個堿基一個堿基合成時部分引物合成時部分引物少少一個堿基一個堿基 現象：每個峰后面有個同樣熒光信號的小“尾巴”。 原因：合成(hchng)時引物多一個

2、堿基。 對策：重新合成(hchng)引物 現象：每個峰前面有個同樣熒光信號的小“尾巴”。 原因(yunyn)：合成時引物多一個堿基。 對策：重新合成引物第4頁/共31頁第五頁，共31頁。引物（模板引物（模板(mbn)）不純）不純 現象：整個峰圖噪音都比較高。（區(qū)別與小片段的干擾） 原因(yunyn)：引物（模板）純度太低，含有較多雜質 對策：建議使用HPLC（柱子純化）或PAGE 純化的測序引物。脫鹽純化的引物純度較低，適合做普通PCR，但不建議用來測序。第5頁/共31頁第六頁，共31頁。模板模板(mbn)上沒有引物結合位點上沒有引物結合位點 現象：沒有特異性的測序峰圖 原因：引物無法結合模板

3、 對策重新(chngxn)設計引物第6頁/共31頁第七頁，共31頁。引物二聚體引物二聚體 現象：前面100多bp噪音高，后面(hu mian)正常（引物二聚體片段小大在100bp左右） 原因：引物二聚體未去除干凈 對策：割膠純化第7頁/共31頁第八頁，共31頁。雙引物結合雙引物結合(jih) 現象：從一開始（區(qū)別于非單克?。┚统霈F兩套峰 原因(yunyn)：模板有兩個引物結合位點，同時和兩個引物結合 對策：重新設計單個引物第8頁/共31頁第九頁，共31頁。 二、模板二、模板(mbn)(mbn)對測序結果的對測序結果的影響影響第9頁/共31頁第十頁，共31頁。噪音信號高噪音信號高終止峰PCR正常

4、終止后面的噪音峰PCR正常終止正常模板正常模板(mbn)與噪音與噪音第10頁/共31頁第十一頁，共31頁。模板模板(mbn)不純（非特異性不純（非特異性PCR產物）產物） 現象(xinxing)：每個峰下面都有其它顏色 原因：PCR主帶與雜帶混在一起測序 對策：凝膠電泳回收主帶，重新測序割膠割膠(gjio)純化純化第11頁/共31頁第十二頁，共31頁。點突變點突變(tbin)（SNP）突變突變(tbin)點點如果模板如果模板(mbn)有單核苷酸（堿基）突變（有單核苷酸（堿基）突變（SNP），測序圖形中其他的位點一般都是單一的），測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現重

5、疊峰峰形，然后突然在某一個位點出現重疊峰(如圖中箭頭所示如圖中箭頭所示)。 第12頁/共31頁第十三頁，共31頁。移碼突變移碼突變(tbin)在450bp處因點突變導致(dozh)移碼，在528bp處又因點突變恢復第13頁/共31頁第十四頁，共31頁。雜合子雜合子(hz)雜合雜合(z h)變點變點雜合信號處的套峰強度(qingd)大小相等，都相當于正常峰值的一半。第14頁/共31頁第十五頁，共31頁。非單克隆非單克隆特征：左邊清晰，右邊全部特征：左邊清晰，右邊全部(qunb)像雜合子像雜合子原因：挑克隆時兩個質?；煸谝黄鹪颍禾艨寺r兩個質?；煸谝黄饘Σ撸盒绿艨寺?，重新制對策：新挑克隆，重新制

6、DNA第15頁/共31頁第十六頁，共31頁。 三、純化三、純化(chn hu)(chn hu)對測序結果對測序結果的影響的影響第16頁/共31頁第十七頁，共31頁。染料染料(rnlio)峰峰特征：染料峰位于(wiy)序列的前100bp左右，是殘余的A、T、C、G、4個BigDye峰，其不影響其它序列的可靠性。第17頁/共31頁第十八頁，共31頁。酒精酒精(jijng)峰峰特征：酒精峰位于序列(xli)的200bp-300bp堿基之間，圖譜被“透明”抬高，其同樣不影響其它序列(xli)的可靠性。第18頁/共31頁第十九頁，共31頁。熒光熒光(ynggung)物質污染物質污染 現象：紅色峰異常高。

7、 原因：未知大分子熒光物質污染，恰好是紅色，被軟件誤認為紅色峰。 對策：依次(yc)更換水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細管；清洗或更換膠引導塊、針筒。第19頁/共31頁第二十頁，共31頁?！搬斪俞斪?dng zi)”峰峰 現象：四色并存突然拔起的尖峰(jin fn)，峰形銳利。 原因：毛細管內有氣泡、灰塵、尿素結晶等，對激光全反射。 對策 灌膠時，避免氣泡產生； 上樣前，樣品先離心； 毛細管、檢測窗口保持清潔； 膠內有尿素結晶時，注意不要吸進注射器； 樣品純化干凈。第20頁/共31頁第二十一頁，共31頁。有機物污染有機物污染(wrn)（瀑布效應）（瀑布效應） 現象：基線從高處突然下降。 原因：

8、有機物進入毛細管，受激發(fā)產生一定波長(bchng)的熒光，抬高基線。 對策：依次更換水、緩沖液、甲酰胺、測序膠、毛細管；清洗或更換膠引導塊、針筒。第21頁/共31頁第二十二頁，共31頁。 四、困難四、困難(kn nn)(kn nn)模板對測序結模板對測序結果的影響果的影響第22頁/共31頁第二十三頁，共31頁。特殊特殊(tsh)結構結構第23頁/共31頁第二十四頁，共31頁。Poly結構結構(jigu)Poly在序列(xli)的前端對信號影響較小, Poly在序列(xli)的后端對信號影響較大。Poly-G/poly-C 很容易導致信號(xnho)中斷和信號(xnho)亂。第24頁/共31頁第

9、二十五頁，共31頁。高高GCPoly-G/poly-C 是高是高GC的一種，很容易的一種，很容易(rngy)導致信號衰減。導致信號衰減。局部高局部高GC一般會導致信號一般會導致信號(xnho)中斷和亂峰。中斷和亂峰。第25頁/共31頁第二十六頁，共31頁。重復重復(chngf)序列序列GT 重復導致重復導致(dozh)信號衰減信號衰減A/G重復重復(chngf)導致信號衰減導致信號衰減或信號亂或信號亂第26頁/共31頁第二十七頁，共31頁。回文結構回文結構其他其他(qt)復雜的二級結構也會導致衰減復雜的二級結構也會導致衰減第27頁/共31頁第二十八頁，共31頁。 四、機器因素四、機器因素(yn s