實驗五-大蒜SOD制備

1、SOD實驗申請實驗題目：實驗原理：利用丙酮沉淀法，從大蒜汁中分離提取SOD實驗原料：新鮮蒜瓣約20g 實驗儀器：離心機超聲波細(xì)胞破碎分光光度計輔助儀器：電子天平、圓底燒瓶、燒杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研實驗試劑：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5) 緩沖液、氯仿、乙醇、預(yù)冷丙酮、活性測定緩沖液參考書目:1李永利，張眾.鄰苯三酚自氧化法測定活性J.中國衛(wèi)生檢驗2000,12,10(6):6732孫永君.大蒜中SOD的提取研究J.化學(xué)與生物工程.2005,(10):23253鄒芝芳，劉佳佳.三種大蒜中提取SOD的對比研究J.食品科學(xué)2004,34(5)4張麗

2、，羅麗萍，谷力.大蒜SOD的分離純化及其低溫脅迫下的酶活性J.吉首大學(xué)學(xué)報.2003,24(4)qtw-5操作記錄：制備大蒜SOD實驗記錄操作說明及結(jié)果記錄:校正天平后，取新鮮蒜瓣20gJ可以數(shù)組合并進行。組織搗碎機處理10min。J合并破碎者，需要先分開，再進行相關(guān)操作。力口入 50mM NaPi buffer （ pH7.8） （91.5+8.5） 150ml磷酸緩沖液，攪拌均勻。超聲破碎（5s+10s）40 times （冰水浴）J攪拌浸提10min先用紗布過濾，再用漏斗過濾，得濾液J 60 c熱變性20min過濾或離心去除沉淀，彳#上清液，測體積 V1另取適量體積的（20ml）濾液，加

3、2倍體積的 氯仿-乙醇（3 : 5）,于分液漏斗中振蕩 5min。分離上層水相，加入等體積的預(yù)冷丙酮。J攪拌15分鐘，使沉淀完全。4000rpm,15min 離心，收集沉淀J注意先稱離心管質(zhì)量將沉淀稱重，得產(chǎn)品，計算收率。部分沉淀用活性測定緩沖液溶解，用于 SOD活性檢測，計算總的酶活與得率。實驗結(jié)果與分析數(shù)據(jù)整理：1、空離心管質(zhì)量：第組4.131g第組4.056g粗體物與容器質(zhì)量：第組4.265g第組4.223g產(chǎn)品質(zhì)量：第組 4.265-4.131=0.134g第組 4.223-4.056=0.167g2、冰丙酮沉淀SOD冰丙酮加入溶液中后出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，在10000rpm下高速離心

4、出現(xiàn)淡黃色沉淀。3、鄰苯三酚自氧化抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作鄰苯三酚自氧化速率測定表1:試齊測量管空白管Tris-HCl PH8.0 100mmol/L4.54.5ddHO2.22.5PH8.7磷酸緩沖溶液2.02.0鄰苯三酚 3mmol/L（用 10mmol/L HCl 配0.30.0制）酶活力測定表2:試齊測量管空白管Tris-HCl PH8.0 100mmol/L4.54.5ddHO2.22.5酶溶液2.00.0PH8.7磷酸緩沖溶液0.02.0鄰苯三酚 3mmol/L（用 10mmol/L HCl 配0.30.0制）吸光度測定數(shù)據(jù)：浸提溫度條件：室溫時間吸光度鄰苯三酚自氧化酶活抑制鄰苯三酚自氧化

5、0.00.0660.0690.50.0840.0811.00.0980.0921.50.1050.1002.00.1150.1112.50.1220.1193.00.1280.1283.50.1350.1344.00.1420.1404.50.1440.1495.00.1490.152由于0-3s之間的吸光值與時間基本符合線性關(guān)系，所以去0-3s間數(shù)據(jù)做曲線得:鄰苯三酚自氧化標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y 0.0199x 0.0727 R2=0.9627酶活抑制鄰苯三酚自氧化方程:y 0.0194x 0.0709 R2=0.9963鄰苯三酚自氧化速率A0=0.0199加入SOD后鄰苯三酚自氧化速率 A=0.

6、0194SOD活性（/ml）（A。A）/A。100% 反應(yīng)體積50%樣品體積稀釋倍數(shù)(0.0199 0.0194)/0.0199 100% 95050%11.31 /ml數(shù)據(jù)分析:從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以看出加入 SOD的吸光度直線斜率略小于未計入酶溶液之前，說明SOD對鄰苯三酚自氧化現(xiàn)象有抑制作用。但從實驗結(jié)果分析，抑制作用不明顯，直線斜率改變不大。也反映出分離提取的SOD屯度不高，提取效率較低，分析有以下幾點原因：1、在浸提步驟中，前兩組采用60 c水浴浸提，浸提效率較高，抑制效果較為明顯；本組實驗采用室溫條件下浸提，浸提時間較短，浸提不夠充分，提取效率較低，抑制效果不明顯，與前兩組形成明顯差異。

7、也說明60下水浴浸提為更為優(yōu)化的SO求取工藝。2、 鄰苯三酚自氧化試劑的自氧化速率較快，不易保存。所以實驗所用的該試劑應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，以保證試劑純度。二本實驗中的鄰苯三酚試劑配制時間較長，部分試劑已完成自氧化過程，試劑純度低，活性差，對實驗結(jié)果造成一些影響。3、 本實驗操作中采用超聲波破碎技術(shù)，但是試驗中超聲波破碎儀的破碎效果不明顯，對實驗結(jié)果造成一些影響。操作總結(jié)：1 、無論是手動攪拌還是機械攪拌，注意攪拌速度的控制。攪拌過快，過于劇烈，會使部分蛋白變性，影響SOD的得率值。2、SOD是一種熱穩(wěn)定性很好的酶。當(dāng)溫度低于80c時，短時間的熱處理酶活力不會有明顯的變化，而一般雜蛋白卻在高于55時就易

8、變性沉淀，因此對大蒜抽提液進行短時間的熱處理以達到去除雜蛋白的目的。3、鄰苯三酚試劑要在最后加入，并立即進行比色。若耽擱時間過長，試劑顯色程度會發(fā)生變化，表現(xiàn)在吸光值上就是測定不準(zhǔn)。4、用丙酮沉淀法可以很方便地從大蒜汁中分離制得粗品SOD,能把大部分雜蛋白如粘多糖去除 , 但這種方法的缺陷就是要使用大量的有機溶媒, 難以規(guī)模化制備。原理總結(jié)：1、概述超氧化物歧化酶（SOD）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子（O 2-）進行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的SOD,通qW-6織或細(xì)胞破碎后，可用 pH7.8磷酸緩沖液提取出。

9、由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。植物葉片在衰老過程中發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下降、葉綠素降解、光合作用降低及內(nèi)源激 素平衡失調(diào)等。這些指標(biāo)在一定程度上反映衰老過程的變化。近來大量研究表明，植物 在逆境脅迫或衰老過程中，細(xì)胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。過剩 自由基的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時會導(dǎo) 致植物細(xì)胞死亡。鄰苯三酚在堿性條件下可迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產(chǎn)物,在325nmW最大吸收峰。鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物在40s-3min這段時間，生成物與時間有較好的線性關(guān)系。顏色深一 SOD逐漸增多

10、一顏色淺，即酶活力越大，顏色越淺。2、SOD!化反應(yīng)機理SODJ耐熱性較強，在65 c以下溫度對酶活影響很小，但溫度一旦高于70 c，酶活力則下降很快。提取植物 SOD勺最適宜溫度為5565c ,最適宜的熱變性時間為 15 min。大部分蛋白質(zhì)的變性溫度為 55 C ,可以利用SOD 口雜蛋白變性溫度的差異進行熱 變性實現(xiàn)初SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)，能催化超氧負(fù)離子發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶 類。由于該酶能有效清除機體內(nèi)超氧自由基，從而有效地預(yù)防活性氧對生物品的毒害作用，因而具有抗輻射、抗腫瘤及延緩機體衰老等功能，在保健品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中有重要的應(yīng)用價值。研究表明，外源SOD具有保護DNA

11、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的作用，使其免遭 超氧負(fù)離子的破壞，對輻射有防護作用。步分離，且不引入雜質(zhì)。SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類型的SOD: Mn SOD和Cu.Zn SOD,它們可催化下列反應(yīng)：SOD 4 20,- +2WA+6大蒜SOD的價值大蒜所含化學(xué)成分十分復(fù)雜, 含有揮發(fā)油、多種氨基酸、維生素、糖及豐富的蛋白質(zhì) , 并含有多種礦物質(zhì)及微量元素。研究證明大蒜具有卓越的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、提高機體免疫功能、降血糖、解毒等功效。近年來將大蒜用于農(nóng)、林、牧、漁方面防治病蟲害和提高產(chǎn)量的研究也有很大進展。大蒜被美國時代?？扑]為現(xiàn)代人十大最健康的食品之一。我國是世界大蒜種植的第一

12、大國, 產(chǎn)量和出口量均居世界前列。因此研究開發(fā)利用大蒜資源具有重要意義。目前我國傳統(tǒng)工業(yè)大多從動物的血液和內(nèi)臟器官中提取SOD但這類原料來源有限，成分復(fù)雜，且在儲存、運輸?shù)确矫娲嬖谥T多不便，因此容易導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜化，使生產(chǎn)成本大幅度上升。近來的研究發(fā)現(xiàn)，大蒜細(xì)胞中含有豐富的Cu、Zn-SOD,其分子量約為 32000，與從牛血等動物血紅蛋白中所提取的SOD 十分接近，, 用大蒜提取可使生產(chǎn)成本顯著降低, 而且生產(chǎn)工藝也能得到很大簡化, 這對于擴大生產(chǎn)規(guī)模、實現(xiàn)SOD 的廣泛應(yīng)用十分有利，而且其它各項性能也來源豐富、易于處理而使生產(chǎn)成本大大降低，而且生產(chǎn)工藝也能得到很大的簡化，這對于擴大生產(chǎn)規(guī)

13、模，實現(xiàn)SOD 的廣泛應(yīng)用將是十分有益的。實驗問題：1 、為什么要從植物中提取SOD？初步驗證階段。國外SOD 主要應(yīng)用于醫(yī)療、保健方面，有以動物血液及內(nèi)臟為原料制取 SOD 的報導(dǎo)，但存在著成本高、含有致熱因子等缺陷，因此，適用范圍極為有限。尤其是近年來受“瘋牛病”的影響，許多國家和地區(qū)抵制以動物血液及內(nèi)臟為原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在國際市場上極為緊缺。從植物，特別是人們?nèi)粘＝?jīng)常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取SOD ，使用安全性非常高，避免了可能發(fā)生的交叉感染。利用全新的生物技術(shù)從植物中提取SOD,具qtw-9有明顯的社會和經(jīng)濟效益，市場前景廣闊。從植物中提取SO

14、D 的主要工藝流程為:植物f打漿-超濾分離-有機溶劑去雜-柱層析精制-超濾濃縮-冷凍干燥-產(chǎn)品2、用Tric-HCl 而不用磷酸緩沖液的原因因為反應(yīng)物連苯三酚在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下能自氧化。而SOD 活力的測定是依靠SOD 抑制連苯三酚的自氧化實現(xiàn)的。磷酸緩沖液pH 大約為 7 點多，無法提供連苯三酚自氧化需要的堿性環(huán)境。3、鄰苯三酚加入量對測量的影響鄰苯三酚的濃度是決定其自氧化速率高低的一個主要因素，濃度越高，自氧化速度越快，相同單位的SOD 對鄰苯三酚自氧化的抑制程度就越小，從而使得測量結(jié)果越低。所以為使結(jié)果具有可重復(fù)性，必須嚴(yán)格控制測定液中鄰苯三酚的終濃度保持相同。實驗補充材料（

15、一般）酶的分離純化方法:提取原則a.相似相溶。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì) 易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑 中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合 或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。b.遠離等電點的pH值，溶解度增加。酶的提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.020.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的 酶堿溶液提取PH8

16、12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基 團的酶1沉淀分離 沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶 液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原埋鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通 過在酶液中添加一定濃度的中性鹽使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉 淀從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不向的兩性電解質(zhì)有小向的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)

17、在有機溶劑中的溶解度不向，通過添加一定 量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分 離選擇性變性沉淀 法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響 所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸錢、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和 磷酸鈉等。其中以硫酸錢最為常用。在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升 高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降 低。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同 時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面

18、的水膜破壞，qtw-13也使其溶解度降低而沉淀析出。 醇、甲醇等常用于酶的沉淀分離的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙2離心分離 離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物 質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特 性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。蛋白質(zhì)分子在離心畤，其分子量、分子密度、組成、形狀 等，均會影響其沉降速率,沉降保系數(shù) 即用來描述此沉降性質(zhì)；其單位為S （Svedberg unit）。每一種的沉降系數(shù)與其分子密度或分子量成正比。不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分H。3、過濾與膜分離過濾是借

19、助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾的分類及其特性（根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同）類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾> 2m酵母、霉菌; 動物細(xì)胞、植 物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔 陶逢、燒結(jié)金屬等微濾0.2 2 d m細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?0.2 科 m病毒、生物大分子等超濾膜反滲透< 20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M 行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯睛、醋酸纖維素、賽 璐玲以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也

20、可以采用動物膜等。膜分離過程 中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆 粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。微濾，推動力是壓力差，分離機理為篩分超濾，同上納濾，同上，分離機理為優(yōu)先吸附和表面電位反滲透，同上，分離機理為優(yōu)先吸附和溶解擴散4層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分物理化學(xué)性 質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動 相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。層析法白分類：流動相有兩種狀態(tài)：液體作為流動相氣體作為流動相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相以

21、吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分類：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析：氣-固層析氣-液層析按層析過程的機理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定層析分離方法層析方法分

22、離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力/、同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同,而使各組分分離離子父換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和 力/、同而達到分離目的疑膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分 子質(zhì)量/、同而達到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而乂可逆的親和力，使生 物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一 起，實現(xiàn)組分分離5、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：紙電泳 薄

23、層電泳 薄膜電泳 凝膠電泳 自由電泳等電聚焦電泳顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。6、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：有機溶劑萃取雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取各種雙水相系統(tǒng)：聚合物P聚合物Q或鹽聚內(nèi)一醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙 烯口比咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖

24、乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸錢，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸 鉀鈉二、純化方案的設(shè)計與評價一、純化方案的設(shè)計（一）純化方法的選擇依據(jù)根據(jù)有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異調(diào)節(jié)溶解度：沉淀法2 .根據(jù)分子大小、形狀的不同： 離心分離，膜分離，凝膠過濾 3.根據(jù)分子電荷性質(zhì) 的不同： 離子交換層析，電泳 4.根據(jù)專一性結(jié)合的方法：親和層析 5.其它：吸附 層析，疏水層析、純化方案的評價（一）酶活力測定:酶活力（enzyme activity）又稱酶活性，是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小 可用在一定的條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來表示。一般用單位時間內(nèi)產(chǎn)物生成的量來表示酶催化的反應(yīng)速率。常用的方法：1 .化學(xué)分析法（比色法）：產(chǎn)物可與特定的化學(xué)試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的有色溶液。2 .分光光度法：利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同。3 .量氣法：酶促反應(yīng)中產(chǎn)物或底物之一為氣體。4 .滴定法（pH值測量法）：產(chǎn)物之一是自由的酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)。多用 pH電極 測。常用終止反應(yīng)方法：1）改變反應(yīng)最適條件：加酸、堿、加熱2）加酶變性劑：5 %三氯乙酸酶活力單位：通常采用國際酶學(xué)委員會規(guī)定的單位。但在純化過程中，為了方便，可采用自 行規(guī)定的單位，只要達到可比較的目的即可，如直接以光密度值表示。常用比活力表示酶制