流式細胞技術和流式細胞儀

1、流式細胞技術和流式細胞儀 流式細胞儀首頁 第十一章 流式細胞技術和流式細胞儀一、熒光染料在流式細胞術中的應用（一）碘化丙啶染色碘化丙啶(propiolium iodide，PI)能嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強度增加約20倍，以488nm波長激發(fā)，DNA/PI復合物最大的發(fā)射波長約為615nm。1. 小鼠Lewis肺癌細胞DNA含量測定方法（1）從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內用PBS沖洗。（2）去除結締組織及脂肪，剪碎腫塊。（3）小碎片移入1.20×38mm注射針,加壓使其通過,于4條件下重懸細胞于HBSS中。（4）將200300L細胞懸液(5×105細胞/mL

2、)中加入3mL PI(50g/mL)，染色3LL細胞，于4存放2030分鐘。（5）測定580750nm之間的發(fā)射熒光，以去除末結合PI產生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。2.培養(yǎng)細胞DNA的流式細胞儀分析（1）從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次。（2）加入PI5mL于培養(yǎng)皿中，在4放10分鐘。（3）用吸管反復次打細胞，使細胞破壞，胞核釋放出來，再行流式細胞儀分析。3. 完整細胞DNA的PI染色（1）70%乙醇固定的細胞懸液，離心，去固定液。（2）室溫條件下加入PI染色一批細胞（105106細

3、胞/mL），時間為30分鐘，然后行流式細胞儀分析。（二）吖啶橙染色1. DNA和RNA的鑒別染色利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細胞核酸，或作溶酶體的一種標記。觀察死亡細胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細胞和靜止細胞群體。雖然測定DNA和RNA含量時較難獲得好的重復性結果，但該方法已被許多實驗室廣泛采用。方法如下：（1）試劑：1）溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL 1mol/L NaCL 15ml蒸餾水76mL，PH 1.5（100mL）2）溶液B：穩(wěn)定期數月，最好除

4、菌以后(高壓或過濾)貯存。0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L NaCL 15mL0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L檸檬酸18.5mL蒸餾水24mL，總體積為99mL pH6.03）吖啶橙母液：用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應小心)，吖啶橙應用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀釋。4）注意事項：儀器鞘流系統(tǒng)應保持4。氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm),綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)（2）方法：1）用含15%血清的PBS配制細胞懸液，取0.2mL(8×106細胞/mL)，加入0

5、.4mL溶液A，4放置4560秒。2）加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。3）應在加入溶液B后10分鐘內進流式細胞儀分析。（3）注意事項：（1）細胞數保持恒定；（2）核酸與吖啶橙的比例；（3）染色時間及溫度。2. 單鏈和雙鏈DNA的鑒別染色（1）試劑：1）HBSS內含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.352）吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5 mg/L(16.7m),0.2mol/L Na2HPO4緩沖液，pH2.6。（2）方法1）2×106細胞懸于1mL HBSS/RNase液中。2）37溫育1小時。3）將0.2mL細胞懸液(含4×1

6、05細胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20 30分鐘。4）加2mL吖啶橙染色2分鐘。5）綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細胞中單鏈及雙鏈DNA含量。（三）Hoechst33258染色以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進行細胞周期分析。1.試劑：（1）用培養(yǎng)基配制33 mg/L Brdu及脫氧細胞苷26.4g/mL。（2）染色液：Hoechst33258溶于PBS，細胞染色24小時后進行分析，據報道染色的穩(wěn)定時間在30分鐘至24小時之間。2.方法：（1）將Brdu溶液按1:10加入細胞培養(yǎng)

7、液中。（2）根據細胞周期時間不同，選擇不同時間培養(yǎng)的細胞。（3）孵育后，搖散細胞以傳代培養(yǎng)。（4）直接用染液重懸細胞，進入流式細胞儀分析。Hoechst33258熒光值在410580nm之間，需用330360nm紫外光激發(fā)。應特異性結合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對。因此，不僅特異性標記DNA，亦可標記胸腺嘧啶。在細胞周期分析時，在與細胞孵育過程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內的細胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產生一新峰，此項技術可用于直接測定細胞G2期及分裂時間。（四）Hoechst33342染色Hoechst33342染色活細胞DNA1.試劑：

8、Hoechst 33342,用蒸餾水配成0.25mol/L。2.方法：（1）制備106/m細胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為510 mg/L ，室溫下20分鐘。（2）分析前切勿洗滌細胞。Hoechst33342可用作細胞DNA的活體染料，據信可在保持細胞活性的同時，呈現出相當好的DNA化學計量關系，激發(fā)波在紫外范圍350363nm之間，發(fā)射波則在450nm處。（五）異硫氰酸熒光素染色以異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyante，FITC）染色蛋白質。1.試劑： FITC用含40 mg/L RNase的PBS配成0.11.0 mg/L濃度。2.方法：(1)染

9、色前用終濃度70%乙醇固定細胞，至少18小時。(2)離心固定細胞，棄去固定液。(3)室溫下用FIFC染色細胞蛋白，30分鐘。(4)流式細胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長488nm，熒光發(fā)射波長515535nm。也可于固定細胞中，以18 mg/L (0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質雙重染色，分別呈現紅色熒光（DNA）和綠色熒光（蛋白質）。（六）若丹明染色若丹明標記單克隆抗體的應用該技術既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細胞，可用若丹明標記單克隆抗體處理上述細胞；也可用于測定胞漿中的蛋白質(如凋亡BCL-2

10、蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。1.說明：用磷酸鹽緩沖液Eagle's MEM稀釋FITC連接的抗體內含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FITC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細胞中加入50L不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認最佳染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時，應稀釋成5 mg/L或 0.25 mg/L。無論鼠或人細胞在2×107濃度時其存活率應在90%以上。2.方法：(1)于微量滴定板加入50L若丹明標記的抗體，再加入50L細胞懸液，混勻。(2)冰浴45分鐘，離心滴定板（1500r/min 10分鐘）。(3)棄上清，以培養(yǎng)基100L洗滌細胞沉淀2次，每次洗滌后

11、用1500r/min 10分鐘，棄上清。(4)以1ml預冷的培養(yǎng)基配成1×106細胞/mL的已染色細胞懸液，進樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4)。 （七）光輝霉素和PI的雙標記DNA染色在熒光抗生素光輝霉素和PI聯合染色過程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產生能量轉移，該染色技術主要用于實體腫瘤組織，精子細胞及婦科標本，同時也適用于體外培養(yǎng)的細胞。1.分離制備的細胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。2以PI/光輝霉素染色，4 1小時（PI為10 mg/L、光輝霉素為10 mg/L）。3染色后進樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法

12、。（八）PI和FITC對DNA與癌基因探針雙標記測定1. 說明：這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標記癌基因表達產物，然后用PI標記DNA，現以研究白血病細胞增殖與癌基因的關系說明操作步驟：2.方法：（1）制備白血病細胞懸液，用100%甲醇在-20固定10分鐘。(2) 取50l50 mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結合)，4作用3045分鐘。(3) 用PB離心洗滌2次，重懸浮于50L HBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。(4) 加入50L 1:200兔抗鼠IgG，4

13、放置3045分鐘。(5) 同(3)洗滌后加入50L 1:40的FITC標記的羊抗兔IgG，4反應3045分鐘。(6) 同(3)洗滌后，細胞用RNA酶消化，室溫2030分鐘。(7) 同(3)洗滌后，用PI染液染20分鐘。(8) 同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長測定。FITC染色顯示ras癌基因表達產物，PI染色顯示DNA含量。3. 注意事項：（1）制備樣品時，離心次數不宜過多，防止細胞丟失和凝集；（2）細胞固定時間不宜過長，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑；（3）為了降低本底，應將細胞表面未結合的熒光染料洗凈；（4）進行雙標記沉淀時，應盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。二、記活細胞免疫熒

14、光技術流式細胞儀標本的制備流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發(fā)展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞?；罴毎庖邿晒饧夹g是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結果。(一)原理活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，

15、再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。(二)操作步驟制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)用10FCSRPMI1640調整細胞濃度為5×10×107ml取40l細胞懸液加入預先有特異性McAb(550l)的小玻璃管或塑料離心管，再加50l 120(用DPBS稀釋)滅活正常兔血清 4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右1000rpm×5min 棄上清，加入50l工作濃度的羊抗鼠(或兔抗鼠)熒光標記物，充分振搖 4 30min用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml

16、左右，1000rpm×5min加適量固定液(如為FCM制備標本，一般加入1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100500l固定液)FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察(標本在試管中可保存57天)(三)試劑和器材1.各種特異性單克隆抗體。 2.熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。 3.10 FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。 4.玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。(四)注意事項 1.整個操作在4下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯、脫落。 2.洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。 3.加適量正常兔血清可封閉某些細胞表