時間分辨熒光分析法 - 副本課件

1、時間分辨熒光分析法及其應(yīng)用目錄 一、時間分辨熒光分析法的基本概念 二、時間分辨熒光分析法基本原理與優(yōu)點 三、時間分辨熒光分析技術(shù)簡介 四、時間分辨熒光分析法的應(yīng)用 五、時間分辨熒光免疫分析技術(shù)在真菌毒素檢測 方面的應(yīng)用 六、展望一、基本概念：n 1.有些物質(zhì)受到光的照射時，除吸收某種波長的光之外還會發(fā)射出波長相同或比吸收波長更長和的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。最常見的光致發(fā)光現(xiàn)象是熒光和磷光。n 2.物質(zhì)分子吸收光子能量而被激發(fā)，然后從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回到基態(tài)時所發(fā)射出的光稱為熒光(fluorescence)。n 3.根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)鑒定和物質(zhì)含量測定的方法稱為熒光分

2、析法(fluorometry)。5.時間分辨熒光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA） 是近十年發(fā)展起來的非同位素免疫分析技術(shù)，是目前最靈敏的微量分析技術(shù),其靈敏度高達10-19g/ml，較放射免疫分析（RIA）高出3個數(shù)量級。它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。二、時間分辨熒光分析法基本原理與優(yōu)點1.原理 TRFIA 是用鑭系金屬離子作為示蹤物標記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞,與其螯合

3、劑、增強液(有一部分不需要) 在待反應(yīng)體系(如:抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細胞與效應(yīng)細胞的殺傷反應(yīng)等) 發(fā)生反應(yīng)后,用時間分辨熒光儀測定最后產(chǎn)物中的熒光強度,根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值,推測反應(yīng)體系中分析物的濃度,達到定量分析的目的。時間分辨熒光免疫原理圖2.優(yōu)點 TRFIA 技術(shù)具有酶標記分析技術(shù)和同位素標記技術(shù)的優(yōu)點: 具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好，且測定范圍寬，試劑壽命長，操作簡便和非放射性等特點： 鑭系離子與螯合劑形成螯合物后，Stokes 位移能夠達到 200 nm 以上，很容易分辨激發(fā)光和發(fā)射光，從而激發(fā)光干擾就可以排除。 鑭系元素與通常的熒光

4、物質(zhì)相比較，鑭系元素離子螯合物熒光的衰變時間要長的多，為傳統(tǒng)熒光的 103106倍。 鑭系離子與雙功能螯合劑螯合后，可形成穩(wěn)定的螯合物，穩(wěn)定性非常高，生產(chǎn)出的產(chǎn)品保質(zhì)期可以長達 2 年。三、時間分辨熒光分析技術(shù)簡介 TRFIA的基礎(chǔ)試劑包括示蹤劑、稀有元素雙功能螯合劑、分析緩沖液、增強溶液。 基本技術(shù)包括包被技術(shù)、標記技術(shù)、反應(yīng)模式。1.基礎(chǔ)試劑：1.1示蹤劑的選擇 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 B族,包括鈧(scandium,SC)、釔(yttrium , Y)和鑭系元素。到目前為止,只有銪(europium , Eu)、鋱(terbium ,Tb)、釤(samarium ,Sm)

5、、釹 (neodymium ,Nd)、鏑 (dysprosium ,Dy)等5種被用作TRFIA示蹤劑,尤以 Eu3 +常用。 示蹤劑的使用 一般用Eu2O3制備成EuCl3,再經(jīng)純化和 常溫真空抽干,然后干燥保存。1.2 稀有元素雙功能螯合劑 稀土元素作為金屬離子,很難直接與抗原抗體結(jié)合,因此在標記時需要有一種雙功能基團的螯合物,它們分子內(nèi)或帶氨基和羧基或帶有異硫氰酸基和羧酸基,一端與稀土離子連接,一端與抗原或抗體的自由氨基(組氨酸、酪氨酸) 連接。1.3 增強溶液 免疫反應(yīng)后所形成的復(fù)合物,在弱堿性緩沖液中經(jīng)紫外光激發(fā)所產(chǎn)生的熒光信號甚弱,這主要是因為水是稀土離子經(jīng)紫外光激發(fā)所產(chǎn)生熒光的淬

6、滅劑。所以要加入一種增強液。增強液一般由-二酮體、三辛基氧化磷(TOPO)、TritonX-100、醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀(pH2.0 3.2)組成。2.基本技術(shù)：2.1 包被技術(shù) TRFIA包被技術(shù),是保持其靈敏度重要因素,因此在包被抗體之前,往往要對抗體進行純化,以提高抗體的包被量和均一性。國內(nèi)外最早的使用的包被的緩沖體系為pH9.6的碳酸鹽緩沖液,90年代后改為檸檬酸緩沖液,pH為4.5 ,效果明顯優(yōu)于碳酸鹽緩沖系統(tǒng)。2.2 標記技術(shù) 抗原或抗體標記時,銪離子首先要作為標記物標記到抗原或抗體上。標記時不同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性依賴于蛋白表面的游離氨基酸數(shù)目和蛋白質(zhì)特異等電點。一般來說,游離氨基酸數(shù)

7、目越大,蛋白質(zhì)的特異等電點越高,蛋白質(zhì)易與螯合劑反應(yīng),從而產(chǎn)生較高的標記率,但其標記比率與免疫反應(yīng)不成正比關(guān)系。鑭系離子Eu3 +可用來標記核酸探針。2.3 反應(yīng)模式 常用的有雙位點夾心法和固相抗體競爭法。2.3.1 雙位點夾心分析法使用針對被測物上不同抗原決定簇的兩個單克隆抗體,一個用Eu3 +標記,另一個包被固相載體,經(jīng)過免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物后,再將Eu3 +從復(fù)合物上完全解離下來,在Eu3 +的增強液中與另一種螯合劑結(jié)合,在協(xié)同劑的作用下,形成一個Eu3 +包裹于其內(nèi)部的微膠囊(膠態(tài)分子團) 。它在激發(fā)光作用下能發(fā)射出很強的熒光信號,其強弱與待測抗原(或抗體) 含量相關(guān)。該法用于測定蛋

8、白質(zhì)類大分子化合物。2.3.2 固相抗體競爭法是對一些小分子半抗原化合物,因分子質(zhì)量小,不能直接進行固相包被,如多肽、甲狀腺激素類和一些藥物等,都必須經(jīng)過化學耦聯(lián)劑與載體蛋白質(zhì)進行共價鍵結(jié)合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定條孔壁,制成固相抗原.四、時間分辨熒光分析法的應(yīng)用1.在免疫學的應(yīng)用1.1 測定細胞因子:細胞因子不僅僅參與免疫應(yīng)答反應(yīng),而且在腫瘤、炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。因此,準確測定細胞因子含量,對于了解它們病理生理作用是十分重要的。1.2 測定補體:補體成分在多種自身免疫性疾病中起作用,臨床上常檢測補體C3來評價免疫系統(tǒng)的功能。2.在微生物方面的應(yīng)用 由于TRFIA的方法靈敏度高

9、,在1979年它的理論形成后,研究重點放在試劑開發(fā)和利用上； 1982年研制出用于測定風疹病毒抗體TRFIA的試劑； 1986年開創(chuàng)快速診斷流感的TRFIA方法； 2002年有關(guān)于同時檢測弓形體IgM和IgA抗體TRFIA方法.3.分子生物學的應(yīng)用 標記的鏈霉親合素2生物素探針,則會使核酸雜交整個過程變得快速、簡單。目前,稀土元素標記探針技術(shù)已用于檢測HIV、檢測前列腺特異性抗原( PSA)的mRNA、腺病毒DNA、肺炎鏈球菌DNA和HLA227等位基因,獲得了滿意的結(jié)果。4.在激素方面的應(yīng)用 用TRFIA檢測人血清胰島素含量;檢測了hCG;血清中的甲狀腺激素;國外還用它檢測動物的激素; TR

10、FIA分析血清、EDTA抗凝血漿和檸檬酸鈉抗凝血漿激素含量差別,發(fā)現(xiàn)只有在分析促甲狀腺激素(TSH)、胰島素 (Ins)、TT3、雌二醇 (E2)、Testo (睪酮) 和Prog(孕酮) 時檸檬酸鈉抗凝血漿與血清有差別。 現(xiàn)在TRFIA已經(jīng)取代RIA、EIA等方法,檢測項目涉及甲狀腺激素、性腺激素、下丘腦分泌的激素、胰島素、胃泌素等各個方面。 五、時間分辨熒光分析法在真菌毒素檢測方 面的應(yīng)用 1.真菌霉素概述 真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌( 主要為曲霉屬、青霉屬及鐮孢屬) 在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的具有很強毒性的二級代謝產(chǎn)物，它主要對食品、農(nóng)作物及飼料等污染很嚴重。 當前，最主要的真菌毒素主要有: 黃

11、曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、T-2 毒素、展青霉素、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等。 .2.真菌毒素的測定方法 目前，真菌毒素的測定方法有 TLC 法、HPLC 法等，這些方法都不同程度地存在著樣品前處理過程復(fù)雜、毒性大、所需時間長等缺點。由于其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對檢測產(chǎn)生干擾，必須通過液-液萃取進行凈化處理，操作煩瑣，有機試劑用量大，提取效率低，環(huán)境污染嚴重。 酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）靈敏、且快速、低成本，但 ELISA是一種定性或半定量的方法，當選擇的不同單克隆抗體，會造成結(jié)果存在一定的誤差，所以這種定量，相對不太準確。 TRFIA 具有排除其他熒光干擾，靈敏度高，一

12、次可以測多個樣品的優(yōu)勢，將成為檢測真菌毒素的主要方法.3.實例分析：黃曲霉毒素B1的時間分辨熒光免疫分析 黃曲霉毒素（Aflatoxins）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）的某些菌株產(chǎn)生的。黃曲霉毒素有四種類型：B1，B2，G1 和G2。另外還從牛奶中分離出黃曲霉毒素的兩種代謝產(chǎn)物M1、M2。黃曲霉毒素常存在于花生、核桃等堅果中，在大豆、稻谷、玉米、通心粉、調(diào)味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)。黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，在天然污染的食品中以黃曲

13、霉毒素B1（AFB1）最為多見，其毒性和致癌性也最強，AFB1 的毒性比氰化鉀大10 倍，比砒霜大68 倍。 AFB1 干擾信息RNA 和DNA 的合成，是在翻譯水平上干擾了蛋白質(zhì)生物合成，影響細胞代謝，因而它與人類及動物的許多疾病存在著聯(lián)系。 AFB1引起人的中毒主要是損害肝臟，發(fā)生肝炎, 肝區(qū)疼痛，黃疸，肝硬化, 肝壞死乃至死亡，還可有心臟擴大、痙攣、昏迷、胃腸道大出血等異常表現(xiàn)。長期食用被AFB1 污染的食物被認為是導(dǎo)致肝癌、胃癌、腸癌等疾病的主要原因，也能誘發(fā)腎癌、乳腺癌及卵巢癌等。AFB1的作用機制及對人體的危害 世界衛(wèi)生組織推薦食品、飼料中AFB1的含量不能超過15g/kg，在嬰兒

14、食品中不能檢出;歐盟國家的規(guī)定更加的嚴格，規(guī)定了日常生活食用品中的 AFB1的含量不得超過2g/kg，總量不超過4g/kg，最近已將部分食品中的 AFB1的含量限定在0.1g/kg 以內(nèi)。 我國對 AFB1的污染和控制也非常重視，在1982年頒布了糧油和發(fā)酵食品中的AFB1允許量標準。規(guī)定大米、食用油中AFB1的含量不超過10g/kg，其他糧食、豆類及發(fā)酵食品的含量不能超過5g/kg。各國的標準材料與儀器 材料 黃曲霉毒素B1 、 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）、 偶聯(lián)牛血清白蛋白的黃曲霉毒素B1（AFB1-BSA）、 牛血清白蛋白（BSA）、辣根過氧化酶（HRP）、 福氏完全佐劑和福氏不完全佐

15、劑、96 孔微孔板、 親和層析純化的羊抗兔IgG 、Sephadex-G50 、 Eu3+標記盒（1244-302）、PD-10 等 儀器 紫外吸收測定儀DU-650 ，酶標測定儀3550-UV 全自動TRFIA 檢測儀AutoDELFIA 1235AFB1-TRFIA 檢測方法的建立： 采用時間分辨熒光技術(shù)建立了高靈敏的黃曲霉毒素B1( AFB1) 間接競爭免疫分析法( AFB1-TRFIA) 。以AFB1-BSA 為免疫原免疫新西蘭大白兔制備抗AFB1抗體；AFB1 與辣根過氧化酶的聯(lián)結(jié)物（AFB1-HRP）包被96 孔板為固相抗原，與游離AFB1 共同競爭有限的抗AFB1 抗體；用稀土離

16、子Eu3+標記的羊抗兔抗體進行示蹤。反應(yīng)過程圖 方法 1.抗AFB1 多克隆抗體的制備 先用弗氏完全佐劑1.2 mL 與1mg AFB1-BSA充分混合，形成抗原乳化劑。在兔子背部多位點地進行皮下注射，之后每隔12 周再用弗氏不完全佐劑與AFB1-BSA 充分混勻后多次免疫。在免疫4次后，從兔子的耳緣靜脈抽血，分離血清，用免疫雙擴散法進行抗體效價的鑒定。免疫6 次后，從兔子心臟采血，分離血清。 2.黃曲霉毒素B1-辣根過氧化物酶（AFB1-HRP）的制備 AFB1 為小分子化合物，本身難以吸附到微孔板上，要先與蛋白結(jié)合后才可以包被到微孔板上形成固相抗原，AFB1 無活潑基團，要先活化AFB1，

17、合成黃曲霉毒素B1-羧甲基肟（AFB1-0 xime），引入羧基再偶聯(lián)HRP。 3.固相抗原制備 將AFB1-HRP 用50 mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH9.6 緩沖液稀釋至0.5mg/L的包被液, 96 孔微孔板各孔加100L，4放置過夜。棄去包被液，沖洗三次，加150 L 含2 g/L 明膠的上述緩沖液封閉，4放置過夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置-20冷凍保存。 4.Eu3+-羊抗兔抗體的制備 取溶解于50mmol/L PBS pH7.0 的5g/L 羊抗兔抗體1-2mL，經(jīng)PD-10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A2800.74A260)

18、，用洗脫液稀釋羊抗兔抗體至2g/L。取500-1000L稀釋后的抗體，加入含0.2-0.4mg 的Eu3+-N2-p-異氰酸-芐基-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中反應(yīng)。Sepharose CL-6B 柱層析之后，A280 監(jiān)測收集蛋白峰。 5.主要試劑的配制 （1）AFB1 標準的配制 從AFB1 純品中稀釋AFB1，濃度分別為0.02g/L，0.05g/L，0.1g/L，0.2g/L，0.5g/L，1g/L， 5g/L，10g/L，50g/L，100g/L，200g/L 等，稀釋液為甲醇:水=7:3 的溶液，0 g/L 標準為此溶液。 （2）分析緩沖液 為含8mmol/L NaCl、0.1%明膠、

19、50mol/L DTPA、0.1mL/L Tween-80 和0.1%NaN3的pH7.8 Tris-HCl 緩沖液。 6. 檢測步驟（1）樣品處理（2）間接競爭AFB1-TRFIA 檢測步驟7.考核（1）穩(wěn)定性 比較計數(shù)為0濃度點的ED20、ED50、ED80（2）靈敏度 標準曲線零點計數(shù)X(平均)-2SD(標準差)，找 對應(yīng)的濃度（3）回收率 每克樣品中加入不同量的AFB1，按檢測步驟 測量，再計算實測值與理論值比值（4）特異性 檢測抗體與被測物質(zhì)的交叉反應(yīng)程度（5）與商品化的AFB1-ELISA 試劑盒比較x結(jié)果1. 抗AFB1 兔血清的稀釋實驗 在AFB1-HRP 板條加分析緩沖液稀釋

20、的不同濃度的抗AFB1 兔血清, 結(jié)果見圖1,抑制率為最高濃度(1:63倍稀釋)兔血清結(jié)合率的30%-50%時對應(yīng)的稀釋度約為1:1200-1:600 倍，因此合適的工作濃度應(yīng)在此范圍內(nèi)，我們選擇1:1000倍稀釋。2. Eu3+-羊抗兔抗體的理化和免疫學鑒定 Eu3+標記物經(jīng)Sepharose CL-6B 層析，收集第一洗脫峰。以PE-Wallac 提供的Eu3+標準為參考，Eu3+-羊抗兔抗體第一洗脫峰的Eu3+含量為83.5 mol/L，蛋白含量為9.7 mol/L，即平均每個羊抗兔抗體分子上連接了8.6 個Eu3+。3.AFB1-HRP 固相抗原包被量的優(yōu)化 用包被液將AFB1-HRP

21、稀釋為不同濃度進行包被，采用間接競爭AFB1-TRFIA 作各濃度點的結(jié)合率,見圖2 當AFB1-HRP 固相抗原包被量為0.5mg/L 時，其0 點的結(jié)合率較高，曲線的斜率大，此時的競爭最適合,因此選用0.5mg/L AFB1-HRP 固相抗原進行包被。 4.AFB1-TRFIA 的考核 間接競爭AFB1-TRFIA 的結(jié)果經(jīng)對數(shù)函數(shù)數(shù)據(jù)處理所得的標準曲線見圖3 4.1 方法的靈敏度和穩(wěn)定性 以零劑量點發(fā)光值均值減2SD 后的發(fā)光值在標準曲線上得到的相應(yīng)值為檢測的靈敏度，間接競爭AFB1-TRFIA 的靈敏度為0.01 g/L。8 條不同時間進行的間接競爭AFB1-TRFIA 的效應(yīng)點均值ED80、ED50、ED20 分別為（0.070.01）g/L、（0.630.02）g/L 和（12.50.47）g/L。說明劑量反應(yīng)曲線的位置漂移小，方法的穩(wěn)定性好。