《畜禽養(yǎng)殖污水中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》征求

1、NY/T 20*ICS 65.080CCS B 40NY中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 畜禽養(yǎng)殖污水中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Determination of tetracyclines, sulfonamides and quinolones residues in waste water from livestock and poultry farms - liquid chromatography tandem mass spectrometry （公開征求意見稿）-實施-發(fā)布中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 發(fā)布I前 言本文件按照GB/T 1.1-2

2、020標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出。本文件由全國畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會（SAC/TC 274）歸口。本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所。本文件主要起草人：陳剛、陶秀萍、王安如、賈曼、王曉麗、胡劍。I畜禽養(yǎng)殖污水中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1范圍本文件描述了畜禽養(yǎng)殖污水中4種四環(huán)素類、15種磺胺類和14種喹諾酮類藥物(見附錄A)殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)

3、譜測定方法。本文件適用于豬、牛、雞養(yǎng)殖污水中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定，其他畜禽養(yǎng)殖污水可參照執(zhí)行。本文件畜禽養(yǎng)殖污水中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物殘留量的測定方法檢出限均為2 g/L，定量限均為5 g/L。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T 27522 畜禽養(yǎng)殖污水采樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語與定義適用于本文件。3.1畜禽養(yǎng)殖污水 waste w

4、ater from livestock and poultry farm畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的污水,包括尿液、沖洗水以及其他管理環(huán)節(jié)所產(chǎn)生的污水。來源: GB/T 27522-2011, 3.14原理試樣中待測物經(jīng)Na2EDTA-McIIvaine緩沖液提取，QuEChERS方法凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，基質(zhì)匹配標準溶液校準，外標法定量。5試劑或材料除非另有說明，僅使用分析純試劑。 5.1 水：GB/T 6682，一級。5.2 甲醇：色譜純。5.3 乙腈：色譜純。5.4 萃取鹽包：每份含4 g無水硫酸鈉及1 g氯化鈉。5.5 凈化分散劑：每份含900 mg無水硫酸鈉，150 mg C

5、18及50 mg N-丙基乙二胺（PSA）。5.6 Na2EDTA-McIIvaine緩沖液：準確稱取無水磷酸氫二鈉7.1 g，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）1.95 g，檸檬酸8.4 g，溶解于650 mL水中，pH調(diào)節(jié)至4.0。5.7 乙腈-甲醇溶液：量取750 mL乙腈（5.3）與250 mL甲醇（5.2），混勻。5.8 80%甲醇溶液：量取800 mL甲醇（5.3）與200 mL水，混勻。5.9 0.2 %甲酸溶液：量取2 mL甲酸，用水定容至1000 mL，混勻。5.10 0.2 %甲酸甲醇溶液：量取2 mL甲酸，用甲醇（5.3）定容至1000 mL，混勻。5.11 標準品：3

6、類33種藥物信息見附錄A 表A.1。5.12 33種藥物標準儲備溶液：準確稱取33種藥物標準品適量（精確到0.01 mg），分別按附表A.1中溶劑溶解，用甲醇（5.2）定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的單標準儲備溶液，置于-18 以下避光保存，磺胺類和喹諾酮類藥物儲備溶液有效期為6個月，四環(huán)素類藥物儲備溶液有效期為1個月。5.13 混合標準中間溶液：準確吸取標準儲備液（5.12）各100 L于5 mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀釋至刻度，配制成濃度為20 g/mL的混合標準中間液, 現(xiàn)用現(xiàn)配。5.14 混合標準系列工作溶液：準確移取混合標準中間液（5.13）適量，用80%甲醇溶液（5.8

7、）稀釋成2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL混合標準系列工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。5.15 微孔濾膜：0.22 m，有機系。6儀器設(shè)備6.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。6.2 分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。6.3 漩渦混合儀。6.4 冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于10000 r/min。6.5 氮吹儀。6.6 超聲波清洗器。7樣品7.1 樣品按照GB/T 27522進行取樣。取樣后樣品應(yīng)立即在-18 以下保存。試驗前取適量恢復(fù)至室溫的樣品，混勻備用。7.2 空白樣品：選取類型相同，均勻一致、且在待

8、測物保留時間處，儀器響應(yīng)值小于方法定量限30%的畜禽養(yǎng)殖污水樣品，作為空白試樣。8試驗步驟8.1 提取平行做兩份試驗。準確移取樣品2 mL置于50 mL離心管中，加入2 mL Na2EDTA-McIIvaine緩沖液（5.6），渦旋混勻1 min，加入8 mL乙腈-甲醇溶液提取（5.7），渦旋混勻后超聲提取15 min，于4 條件下10,000 r/min離心10 min。取全部上層清液于50 mL離心管中，加入萃取鹽包（5.4），渦旋混勻1 min，靜置10 min鹽析分層，于4 條件下10,000 r/min離心10 min。取5 mL上層清液于15 mL離心管中，備用。8.2 凈化取一份

9、凈化分散劑（5.5）加入到5 mL上層清液中，渦旋混勻1 min，于4 條件下10,000 r/min離心5 min。取4 mL上層清液于40 水浴條件下氮氣吹干，用80 %甲醇溶液（5.8）定容至1 mL，過0.22 m微孔濾膜（5.15），供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析測定。8.3 基質(zhì)匹配標準系列溶液的制備取空白樣品，按8.1和8.2處理得到氮吹吹干后的空白基質(zhì)，分別取1 mL標準系列溶液（5.14）復(fù)溶，配制成2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL基質(zhì)匹配標準系列溶液。8.4 測定8.4.1 液相色譜參考條件色譜柱：C18

10、 柱，柱長150 mm，內(nèi)徑3.0 mm，粒徑1.8 m，或性能相當(dāng)者；柱溫：30 ；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 mL。流動相A：0.2%甲酸溶液(5.9)；流動相B：0.2%甲酸甲醇溶液(5.10)；梯度洗脫程序見表1。表1 梯度洗脫程序時間/ minA/%B/%0.0090100.5090100.6065351.0065356.00109010.00109010.10901015.0090108.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜參考條件電離方式：電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；碰撞氣（CAD）：34.475 kPa（5 psi）； 霧化氣（GS1）：413

11、.7 kPa（60 psi）； 輔助氣（GS2）：413.7 kPa（60 psi）； 噴霧電壓（IS）：5000 V；離子源溫度(TEM)：500 ；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。表2 四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對、保留時間、去簇電壓及碰撞能量的參考值類別被測物名稱監(jiān)測離子對/(m/z)保留時間/min去簇電壓/V碰撞能量/(eV)四環(huán)素類四環(huán)素445.1410.1 a4.259030445.1427.730土霉素461.0426.3 a4.3511028461.0443.019金霉素479.1443.9 a5.1512030479

12、.1462.025多西環(huán)素445.4427.6 a5.829027445.4410.329磺胺類磺胺嘧啶251.5155.9a3.587221251.5108.134磺胺二甲基嘧啶278.9108.2 a4.308527278.9156.238磺胺氯噠嗪285.0156.1 a4.757023285.0108.033表2（續(xù)）類別被測物名稱監(jiān)測離子對/(m/z)保留時間/min去簇電壓/V碰撞能量/(eV)磺胺類磺胺甲噁唑254.2156.1 a4.737223254.2108.132磺胺甲氧嗪281.0156.0a4.427525281.0108.027磺胺對甲氧嘧啶281.1156.0 a

13、4.237025281.1108.030磺胺間甲氧嘧啶281.1156.1 a4.917525281.1108.130磺胺噻唑256.1156.1 a3.576222256.1108.134磺胺間二甲氧嘧啶311.2108 a5.599039311.215644磺胺甲噻二唑271.1156.1 a4.244021271.1107.834磺胺苯吡唑315.0158.0 a5.309040315.0108.040磺胺脒214.8155.9a2.896021214.810830磺胺醋酰鈉215.0107.93.456027215.0156.0 a15磺胺鄰二甲氧嘧啶311.1155.9 a4.891

14、2030311.110837磺胺喹噁啉301.0156.1 a5.787324301.0108.137喹諾酮類諾氟沙星320.1302.2 a4.1610029320.127625氟羅沙星370.3326.4 a3.8811727370.3269.137司帕沙星393.4292.24.857434393.4349.2 a29奧比沙星396.4295.24.339035396.4352.0a27恩諾沙星360.1342.54.1912030360.1316.0 a30達氟沙星358.3340.3 a4.248031358.3314.125培氟沙星334.3290.3 a4.019425334.3

15、233.441二氟沙星400.2356.3 a4.397031400.2299.536表2（續(xù)）類別被測物名稱監(jiān)測離子對/(m/z)保留時間/min去簇電壓/V碰撞能量/(eV)喹諾酮類環(huán)丙沙星332.1314.0 a4.2311030332.1288.027沙拉沙星386.1368.1 a4.547030386.1342.230洛美沙星352.2265.5 a4.348030352.2334.630氧氟沙星362.5261.4 3.9811238362.5318.2 a27氟甲喹262.0202.0 6.948545262.0244.2 a40惡喹酸262.2216.1 a6.0190332

16、62.2244.2 10a為定量離子。8.4.3 定性在相同試驗條件下，試樣溶液與基質(zhì)匹配標準系列工作溶液中待測物的保留時間相對偏差應(yīng)在 2.5之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的定性離子對，比較試樣譜圖中待測物定性離子的相對離子豐度與濃度接近的基質(zhì)匹配標準系列溶液中對應(yīng)的定性離子的相對離子豐度，若偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。表3 定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差 相對離子豐度/% 5020501020 10 最大允許偏差/% 20 25 30 508.4.4 定量以33種藥物基質(zhì)匹配標準系列溶液（8.3）的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線的相關(guān)系數(shù)

17、不應(yīng)低于0.99。試樣溶液與基質(zhì)匹配標準溶液中待測物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)重新試驗或?qū)⒃嚇尤芤汉突|(zhì)匹配標準溶液作相應(yīng)稀釋后重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的濃度與標準溶液濃度相差應(yīng)不超過30%。四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物標準溶液的定量離子色譜圖見附錄B圖B.1。9 試驗數(shù)據(jù)處理試樣中藥物的殘留量 以質(zhì)量分數(shù)計，單位為微克每升（mg/L）。單點校準按公式（1）計算；多點校準按公式（2）計算： =ACSVV21000ASV1v1000. （1）式中：A 試樣溶液中待測物的色譜峰面積；AS基質(zhì)匹配標準系列溶液中待測物的峰面積；CS基質(zhì)匹配標準系列

18、溶液中待測物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V提取液的體積，單位為毫升（mL）；V1氮吹所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）； V2氮氣吹干后復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；v 試樣體積，單位為毫升（mL）。 =CVV21000V1v1000（2）式中:C從基質(zhì)匹配標準曲線查得的試樣溶液中待測物的濃度，單位為微克每升（g/L）；V提取溶液的體積，單位為毫升（mL）；V1氮吹所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升（mL）； V2氮氣吹干后復(fù)溶液的體積，單位為毫升（mL）；v 試樣體積，單位為毫升（mL）。測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。 10 精密度在重復(fù)性條件

19、下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值不大于該算術(shù)平均值的15%。9附錄A(規(guī)范性)四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物的相關(guān)信息四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物的相關(guān)信息見表A.1表A.1 四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物的相關(guān)信息類別序號中文名稱英文名稱CAS含量/%，溶劑四環(huán)素類1四環(huán)素Tetracycline60-54-897.6甲醇2土霉素Oxytetracycline79-57-298.0甲醇3金霉素Chlortetracycline57-62-594.5甲醇4多西環(huán)素Doxycycline hydrochloride564-25-098.5甲醇磺胺類5磺胺嘧啶Sul

20、fadiazine68-35-998.5甲醇6磺胺二甲基嘧啶Sulfadimidine57-68-198.5甲醇7磺胺氯噠嗪Sulfachloropyridazine80-32-098.0甲醇8磺胺甲噁唑Sulfamethoxazole723-46-698.0甲醇9磺胺甲氧嗪Sulfamethoxypyridazine80-35-398.5甲醇10磺胺對甲氧嘧啶Sulfameter651-06-998.0甲醇11磺胺間甲氧嘧啶Sulfamonomethoxine1220-83-398.5甲醇12磺胺噻唑Sulfathiazole72-14-098.5甲醇13磺胺間二甲氧嘧啶Sulfadimet

21、hoxypyrimidine155-91-998.5甲醇14磺胺甲噻二唑Sulfamethizole144-82-198.5甲醇15磺胺苯吡唑Sulfaphenazolum526-08-998.5甲醇16磺胺脒Sulfaguanidine57-67-098.5甲醇17磺胺醋酰鈉Sulfacetamide Sodium127-56-098.590%甲醇溶液18磺胺鄰二甲氧嘧啶sulfadimoxine2447-57-698.5甲醇19磺胺喹噁啉Sulfaquinoxaline59-40-598.55%氨水甲醇溶液喹諾酮類20諾氟沙星Norfloxacin70458-96-798.5甲醇21氟羅沙

22、星Fleroxacin79660-72-398.5甲醇22司帕沙星Sparfloxacin110871-86-898.55%氨水甲醇溶液23奧比沙星Orbifloxacin113617-63-397.75%氨水甲醇溶液24恩諾沙星Enrofloxacin93106-60-698.5甲醇25達氟沙星Danofloxacin112398-08-094.2甲醇26培氟沙星Pefloxacin149676-40-498.5甲醇27二氟沙星Difluoxacin hydrochloride98106-17-398.5甲醇28環(huán)丙沙星Ciprofloxacin85721-33-198.55%氨水甲醇溶液29沙拉沙星Sarafloxacin98105-99-897.05%氨水甲醇溶液30洛美沙星Lomefloxacin98079-51-798.55%氨水甲醇溶液31氧氟沙星Ofloxacin82419-36-198.55%氨水甲醇溶液32氟甲喹flumequine42835-25-698.55%氨水甲醇溶液33惡喹酸Oxolinic Acid14698-29-498.05%氨水甲醇溶液附錄B（資料性）四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類33種藥物的標準溶液定