第二十章--比色法和分光光度法課件

1、20.1 概概 述述 20.1.1 光度分析法的特點(diǎn)光度分析法的特點(diǎn) 20.1.2 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收 20.1.1 光度分析法的特點(diǎn)光度分析法的特點(diǎn) 有色物質(zhì)顏色的深淺和濃度有關(guān)，利用比較溶液顏色深淺來(lái)測(cè)定含量的分析方法稱為比色分析法。 目視比色稱為比色法比色法；利用分光光度計(jì)測(cè)試，稱為分光光度法分光光度法。 光度分析法特點(diǎn)： (1) 具有較高的靈敏度。 一般物質(zhì)可測(cè)到10-310-6 molL-1 (2) 有一定的準(zhǔn)確度。 相對(duì)誤差為2%5% (3) 操作簡(jiǎn)便、快速，選擇性好，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單。 (4) 應(yīng)用廣泛。 20.1.2 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

2、在可見(jiàn)光區(qū)(400760nm)不同波長(zhǎng)的光具有不同的顏色。 溶液呈現(xiàn)一定的顏色是對(duì)光選擇性吸收的結(jié)果。當(dāng)一束白光通過(guò)一有色溶液時(shí)，某些波長(zhǎng)的光被溶液吸收，另一些波長(zhǎng)的光則透過(guò)，溶液的顏色由透過(guò)光決定。 透射光與吸收光又可組成白光，這兩種光稱為互補(bǔ)色互補(bǔ)色光。光。 如CuSO4溶液呈藍(lán)色就是吸收了白光中黃光。白光紅橙黃綠青青藍(lán)紫紅藍(lán) 如果將不同波長(zhǎng)的光通過(guò)一固定濃度和厚度的有色溶液，測(cè)量每一波長(zhǎng)下有色溶液對(duì)光的吸收程度（吸光度A），然后以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得一曲線，稱吸收曲線。吸收曲線。 圖中、三條曲線，代表同一被測(cè)物質(zhì)含量由高到低的吸收曲線。鄰二氮雜菲亞鐵溶液的吸收曲線 （1）

3、同一種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸光度不同。吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)max （2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似，max不變。而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和max則不同。 （3）在max處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測(cè)定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù)。20.2 光吸收的基本吸收定律光吸收的基本吸收定律 20.2.1 朗伯朗伯-比爾定律比爾定律 20.2.2 吸光度的加和性吸光度的加和性 20.2.3 對(duì)對(duì)朗伯朗伯-比爾定律的偏離比爾定律的偏離20.2.1 朗伯朗伯-比爾定律比爾定律 當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)均勻、透明的有色溶液時(shí)，如溶液的濃度越大、

4、液層厚度越大，則光強(qiáng)度的減弱越顯著 。bcIIAt0lgI0：入射光強(qiáng)度；It：透射光強(qiáng)度 “A” ” 稱為吸光度稱為吸光度，量綱為1 。 溶液對(duì)光的吸收程度越大，則透射光強(qiáng)度越小 ，A越大。 吸光度測(cè)量中，也用透光度T表示0IITtbcTTAlg1lg透過(guò)光強(qiáng)度越大， T值越大。 b：液層的厚度 cm； c：溶液的濃度 gL-1 K：吸光系數(shù)：吸光系數(shù) L g-1 cm-1 如“c”的單位：molL-1，此時(shí)的吸光系數(shù)稱為摩摩爾吸光系數(shù)爾吸光系數(shù) kkbcA k：摩爾吸光系數(shù) L mol-1 cm-1 式中M為摩爾質(zhì)量 MK k 是是吸吸光光物質(zhì)在一定波長(zhǎng)和溶劑條件下的特征常數(shù)物質(zhì)在一定波長(zhǎng)

5、和溶劑條件下的特征常數(shù)。 在溫度和波長(zhǎng)等條件一定時(shí)， k 僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測(cè)物濃度無(wú)關(guān)。 k 是吸光物質(zhì)吸光能力的量度， k 值越大， 光度法測(cè)定該物質(zhì)的靈敏度越高。 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算時(shí)，常以被測(cè)物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，這樣計(jì)算的 k 值實(shí)際上是表觀摩爾吸光系數(shù)。 分光光度分析的靈敏度還可以用桑德?tīng)栰`敏度S表示。S是指當(dāng)儀器的檢測(cè)極限為A=0.001時(shí)，單位截面積光程內(nèi)所能檢測(cè)出來(lái)的吸光物質(zhì)的最低含量，其單位為g cm-2。 S = M/ k 例例20-1：已知含F(xiàn)e2+濃度為1.0mgL-1的溶液，用鄰二氮菲光度法測(cè)定鐵(Fe2+與鄰二氮菲反應(yīng)，生成橙紅色配合物)。使用

6、厚度為2 cm的吸收池，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)得 吸光度A= 0.390。計(jì)算該配合物的 摩爾吸光系數(shù)。 解：解：已知鐵的相對(duì)原子質(zhì)量為 55.85。1145101 . 1108 . 12390. 0cmmolLbcA153108 . 185.55100 . 1Lmolc 例：例：用雙硫腙光度法測(cè)定Pb2+。 Pb2+的濃度為0.08mg/50mL，用2 cm比色皿在520 nm下測(cè)得 T = 53%，求 k。 解：解：已知鉛的相對(duì)原子質(zhì)量為 207.216107 . 7502 .20708. 0Lmolc28. 0%53lglgTA1146108 . 1107 . 7228. 0cmmolLb

7、cAk20.2.2 吸光度的加和性吸光度的加和性 在含有多組分的體系中，若各組分對(duì)同一波長(zhǎng)的光都有吸光作用，且各組分的吸光物質(zhì)彼此不發(fā)生作用，則測(cè)得的吸光度等于各組分的吸光度之和。 A = A1+A2+A320.2.3 對(duì)朗伯對(duì)朗伯-比爾定律的偏離比爾定律的偏離 1.比爾定律的局限性比爾定律的局限性 2.2.非單色入射光引起的偏離非單色入射光引起的偏離 3.3.由于溶液本身發(fā)生化學(xué)變化的原因由于溶液本身發(fā)生化學(xué)變化的原因 引起的偏離引起的偏離 1.比爾定律的局限性比爾定律的局限性 通常在用分光光度法進(jìn)行分析時(shí)，多采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法。即固定液層厚度、入射光的波長(zhǎng)，測(cè)定一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光

8、度，此時(shí)A與c應(yīng)成直線關(guān)系。 在實(shí)際工作上，特別是在濃度較高時(shí)，常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不為直線，即偏離了朗伯比爾定律。 比爾定律是一個(gè)有限制性的定律，它假設(shè)入射光為單色光，吸收粒子間沒(méi)有干擾。因此僅在稀溶液中才適用。在高濃度時(shí)，由于吸光物質(zhì)微粒間相互影響，從而改變了它對(duì)光的吸收能力，使吸光度與濃度的線性關(guān)系發(fā)生偏離。2. 非單色光引起的偏離非單色光引起的偏離 比爾定律假設(shè)入射光為單色光，但是目前儀器所能提供的入射光不是嚴(yán)格的單色光，是由波長(zhǎng)范圍較窄的光帶組成的復(fù)合光。 A = k b c，k 在一定波長(zhǎng)下是一常數(shù)，如入射光不為單色光，則k不為常數(shù)，A 與c 不成直線關(guān)系。 在最大吸收波長(zhǎng)附近通常有一個(gè)

9、吸收強(qiáng)度相差較小的區(qū)域，如入射光在此范圍內(nèi)，因k 變化較小，引起的偏離也較小，A與c基本上呈直線關(guān)系。 Amax3.由于溶液本身發(fā)生化學(xué)變化由于溶液本身發(fā)生化學(xué)變化 的原因引起的偏離的原因引起的偏離 由于被測(cè)物質(zhì)在溶液中發(fā)生締合、離解或溶劑化、互變異構(gòu)、配合物的逐級(jí)形成等化學(xué)因素，造成對(duì)比耳定律的偏離。 Cr2O72- + H2O 2CrO42- + 2H+橙色黃色 應(yīng)控制條件，使溶液中僅存在Cr2O72-或CrO42- ，這樣，c與A 之間才成直線20.3 比色法和分光光度法及其儀器比色法和分光光度法及其儀器 20.3.1 目視比色法目視比色法 20.3.2 分光光度計(jì)的基本部件分光光度計(jì)的

10、基本部件 20.3.3 常用的幾種分光光度計(jì)常用的幾種分光光度計(jì)20.3.1 目視比色法目視比色法 目視比色法是一種用眼睛辨別溶液顏色的深淺，以確定帶測(cè)組分含量的方法。 常用標(biāo)準(zhǔn)系列法，在一套等體積的比色管中，加入不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入等量顯色劑及其它試劑，待測(cè)液在同樣條件下顯色。稀釋至刻度，搖勻。比較待測(cè)液和標(biāo)準(zhǔn)色階溶液的顏色深淺，確定待測(cè)液的濃度。 目視比色法儀器簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確度較差。20.3.2 分光光度計(jì)的基本部件分光光度計(jì)的基本部件 1. 光源光源 作用：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜。要求具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長(zhǎng)的使用壽命。 可見(jiàn)光區(qū)常用鎢燈、或碘鎢燈，波

11、長(zhǎng)范圍：3202500 nm光源單色器吸收池檢測(cè)系統(tǒng)讀數(shù)指示器2. 單色器單色器 作用：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光。單色器由棱鏡和光柵等色散元件及狹縫和透鏡組成。 入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器； 準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵； 聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫； 出射狹縫。 3. 吸收池吸收池 作用：用于盛放試樣溶液。也叫比色皿。 吸收池主要有石英和玻璃兩種。在紫外區(qū)須采用石英吸收池，可見(jiàn)區(qū)一般用玻璃吸收池。 吸收池大多是長(zhǎng)方形的，一般儀器都配有一套厚度為0.5、1、2、3cm的吸收池。吸收池放置

12、的位置應(yīng)使透光面垂直于光束方向。 4. 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng) 作用：將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為電流進(jìn)行測(cè)量。光電轉(zhuǎn)換器對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光有快速靈敏的響應(yīng)，產(chǎn)生的電流應(yīng)與光電轉(zhuǎn)換器上的光強(qiáng)度成正比。 常用的光電轉(zhuǎn)換器有硒光電池、光電管。 5.讀數(shù)指示器讀數(shù)指示器 作用：把光電流或放大的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來(lái)。20.3.3 常用的幾種分光光度計(jì)常用的幾種分光光度計(jì) 72型、722型、751型等。20.4 顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇顯色反應(yīng)及顯色條件的選擇 20.4.1 對(duì)顯色反應(yīng)的要求對(duì)顯色反應(yīng)的要求 20.4.2 顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇20.4.1 對(duì)顯色反應(yīng)的要求對(duì)顯色反應(yīng)的要求 將待測(cè)

13、組分轉(zhuǎn)化為有色化合物的反應(yīng)叫顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)有配位反應(yīng)和氧化還原反應(yīng) 。 1.靈敏度高靈敏度高 因?yàn)楣舛确ㄒ话阌糜跍y(cè)定微量組分含量，故通常選擇靈敏度高的顯色反應(yīng)。生成的有色化合物摩爾吸光系數(shù)大，靈敏度高，通常通常 k 值達(dá)值達(dá)104105，認(rèn)為，認(rèn)為靈敏度較高。靈敏度較高。 2.選擇性好選擇性好 即顯色劑只與一種或少數(shù)幾種物質(zhì)反應(yīng)而顯色。 3.有色化合物組成固定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定有色化合物組成固定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 4.顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收 20.4.2 顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇 1顯色劑的用量顯色劑的用量 通常顯色反應(yīng)可用下式表示： M(被測(cè)離子)

14、+ HR(顯色劑) MR + H+ 從平衡角度看，顯色劑過(guò)量越多，越有利于有色配合物的形成。但顯色劑過(guò)量太多，有時(shí)會(huì)引起副反應(yīng)，故有一適宜用量，通常由實(shí)驗(yàn)確定。 固定其它條件，改變顯色劑的濃度，測(cè)A，作A c R曲線，選擇原則：選擇曲線上平坦部分 吸光度與顯色劑用量關(guān)系曲線cRcRcRAAA(a)適合進(jìn)行光度分析(對(duì)顯色劑濃度控制不嚴(yán)格)(b)只能選擇較窄的顯色劑濃度范圍(c)必須嚴(yán)格控制顯色劑濃度。 2. 酸度酸度 酸度對(duì)顯色反應(yīng)的影響是多方面的： H+濃度大，不利于有色配合物的形成；酸度還影響有些顯色劑的顏色；某些被測(cè)組分與顯色劑能形成不同組成的配合物；金屬離子在酸度下降時(shí)會(huì)水解。 適宜的

15、酸度范圍由實(shí)驗(yàn)確定：固定其它條件，改變pH值測(cè)A，作A pH曲線，選擇曲線平坦部分對(duì)應(yīng)的pH值作為測(cè)量條件。 吸光度與pH關(guān)系曲線pHA 3顯色時(shí)的溫度和時(shí)間顯色時(shí)的溫度和時(shí)間 多數(shù)顯色反應(yīng)在室溫下能很快進(jìn)行，有些反應(yīng)需要加熱。多數(shù)顯色反應(yīng)須經(jīng)一定時(shí)間才能完成，有些有色物質(zhì)放置時(shí)受到空氣和光的作用，顏色會(huì)減弱。 適宜顯色時(shí)間可通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。 AtAt(2)(1)(1) 隨著時(shí)間的增加，有色化合物的濃度增大，A增大。反應(yīng)完成后，A保持不變。(2)有色化合物性質(zhì)不太穩(wěn)定，隨著放置時(shí)間的增加，在日光，空氣的的作用下，有色化合物分解，濃度下降，A降低。 4. 溶劑的影響溶劑的影響 許多有色配合物在水中

16、解離度較大，而在有機(jī)溶劑中解離度較小。有些配合物易溶于有機(jī)溶劑。 5.干擾物質(zhì)的影響及消除干擾物質(zhì)的影響及消除 干擾離子本身有顏色或與顯色劑作用顯色等，都將干擾測(cè)定。 消除干擾的方法有： (1)加掩蔽劑 (2) 選擇適當(dāng)?shù)娘@色條件 如通過(guò)控制酸度，使干擾離子不作用 (3) 選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量條件 如波長(zhǎng)、參比溶液等 (4) 分離干擾離子20.5 分光光度法儀器測(cè)量誤差及其消除分光光度法儀器測(cè)量誤差及其消除 20.5.1入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)的選擇 20.5.2 光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇 20.5.3 參比溶液的選擇參比溶液的選擇 20.5.4 溶液濃度的測(cè)定溶液濃度的測(cè)定 20

17、.5.1入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)的選擇 入射光波長(zhǎng)應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線選擇。 1) 在一般情況下選擇最大吸收波長(zhǎng)作為入射光的波長(zhǎng)，因此時(shí)k 最大，測(cè)定的靈敏度高； 2) 如干擾物在待測(cè)物的最大吸收波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收，則選擇非最大吸收波長(zhǎng)作為入射光的波長(zhǎng)，這時(shí)靈敏度雖有下降，但卻消除了干擾。曲線A為鈷絡(luò)合物的吸收曲線曲線B為顯色劑的吸收曲線吸光度測(cè)定條件的選擇吸光度測(cè)定條件的選擇20.5.2 光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇 任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差，誤差來(lái)源于：入射光源不穩(wěn)定；吸收池玻璃厚薄不均勻；池壁不夠平行、表面有水跡、油污或劃痕等；光電池不靈敏、疲勞現(xiàn)象及檢流計(jì)刻度不準(zhǔn)等。以

18、上因素造成測(cè)量誤差的總和，表現(xiàn)為透光度讀數(shù)誤差T。T與c之間是對(duì)數(shù)關(guān)系，同樣的T對(duì)不同濃度造成的c不同。 在不同的吸光度范圍內(nèi)讀數(shù)，引入的濃度測(cè)量誤差在不同的吸光度范圍內(nèi)讀數(shù)，引入的濃度測(cè)量誤差是不同的，因此必須選擇合適的吸光度讀數(shù)范圍。是不同的，因此必須選擇合適的吸光度讀數(shù)范圍。 根據(jù)朗伯-比爾定律： abcTAlgabcTln434. 0或求微分： abdcTdT434. 0兩式相除： TTdTcdcln以有限值表示： TTTcclnTTTcclg434. 0 濃度的相對(duì)誤差；ccT：透光度讀數(shù)的絕對(duì)誤差 何時(shí)濃度的相對(duì)誤差最??？ 0)ln() 1(ln)ln1(2TTTdTTTdT =

19、0.368或或A = 0.434時(shí)時(shí) ，濃度的相對(duì)誤差最小。 一般分光光度計(jì)的T在0.2% 1%之間，如果為 0.5%，根據(jù)上式計(jì)算不同A或T%時(shí)濃度的相對(duì)誤差。如圖18-9、表18-29(p351)。T%：1070A：1.0 0.15，濃度的測(cè)量誤差較濃度的測(cè)量誤差較小。小。而A過(guò)高或過(guò)低，因讀數(shù)造成的濃度的相對(duì)誤差都是很大的。 為了減小測(cè)量的相對(duì)誤差可采取如下措施： (1) 控制溶液的濃度，如改變?cè)嚇拥姆Q出量或改變稀釋度等。 (2)如溶液已顯色，則可選擇合適厚度的比色皿，使吸光度在上述范圍內(nèi)。 20.5.3 參比溶液的選擇參比溶液的選擇 參比溶液用來(lái)調(diào)節(jié)儀器的零點(diǎn)，以消除吸收池壁及溶劑等對(duì)

20、入射光的反射和吸收帶來(lái)的影響，使測(cè)得的吸光度能真正反映被測(cè)物質(zhì)的含量。 選擇參比溶液的原則：選擇參比溶液的原則： (1) 如果僅所測(cè)物質(zhì)有吸收，顯色劑及其它試劑均無(wú)吸收，可用純?nèi)軇┳鲄⒈?，如蒸餾水； (2) 如顯色劑和其他試劑略有吸收，則應(yīng)用不含被測(cè)組分的試劑溶液（空白溶液）作參比溶液； (3) 如果試樣中其他組分有吸收，但不與顯色劑作用，當(dāng)顯色劑無(wú)吸收時(shí)，可用試樣溶液（不加顯色劑）作參比；當(dāng)顯色劑也略有吸收，或干擾離子也與顯色劑作用且產(chǎn)物有吸收，可在試液中加掩蔽劑，掩蔽待測(cè)組分，再加顯色劑，以此溶液作參比。 20.5.4 溶液濃度的測(cè)定溶液濃度的測(cè)定 1. 工作曲線法工作曲線法 配制一系列不同濃度的被測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的max和最佳操作條件下，測(cè)得吸光度，作工作曲線（A c），為一直線，也叫標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同條件下，測(cè)得試樣溶液的吸光度，從工作曲線上查得相應(yīng)濃度。 2. 比較法比較法 同一波長(zhǎng)的光，通過(guò)兩個(gè)厚度相同而濃度不同的溶液，則濃度之比等于吸光度