分子標(biāo)記技術(shù)課件課件

1、關(guān)于分子標(biāo)記技術(shù)課件現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁(yè)，共16頁(yè)分子標(biāo)記的概念分子標(biāo)記的概念 n廣義的分子標(biāo)記(molecular marker)是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。n蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。n狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記，而這個(gè)界定現(xiàn)在被廣泛采納： 能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片片 段，它直接反映基因組段，它直接反映基因組DNA間的差異。間的差異?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁(yè)，共16頁(yè)分子標(biāo)記的特點(diǎn)分子標(biāo)

2、記的特點(diǎn)（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題；（2）數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)座位幾乎無(wú)限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無(wú)須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁(yè)，共16頁(yè)分子標(biāo)記的類(lèi)型分子標(biāo)記的類(lèi)型基于雜交的分子標(biāo)記基于雜交的分子標(biāo)記，如RFLP（Restriction fragment length polymorphism,即限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性）?；?DNA序列和芯片的分子標(biāo)記，如SNP（Single n

3、ucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁(yè)，共16頁(yè)基于基于 PCR的分子標(biāo)記的分子標(biāo)記，它又分為兩類(lèi)： RAPD （Random amplified polymorphic DNA） DAF（DNA amplification fingerprinting） SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA） 微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）,又稱(chēng)SSR（Simple sequence repeat） ISSR（Inter s

4、imple sequence repeat） AP-PCR（Arbitrary primer PCR） 它主要有SCAR（Sequence characterized amplified region） STS (Sequence tagged site)位點(diǎn)特異的位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)標(biāo)記方法記方法多位點(diǎn)標(biāo)記方法多位點(diǎn)標(biāo)記方法基于基于PCR技術(shù)的技術(shù)的DNA擴(kuò)增方法擴(kuò)增方法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁(yè)，共16頁(yè) AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增 CAPS（Cleaved amplified polymor

5、phic sequence） CAPS是先擴(kuò)增，再酶切擴(kuò)增片段PCR與酶切相結(jié)合的方法與酶切相結(jié)合的方法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁(yè)，共16頁(yè)微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA Microsatellite，MS/Simple Sequence Repeat,SSR 短的，簡(jiǎn)單的串聯(lián)重復(fù)序列； 基元是1-6個(gè)堿基(有的定義為1-5個(gè)堿基)； 廣泛存在于真核細(xì)胞整個(gè)基因組的不同位置上； 高度多態(tài)性(微衛(wèi)星DNA長(zhǎng)度的多態(tài)性) ； 微衛(wèi)星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列； 共顯性標(biāo)記。特點(diǎn)特點(diǎn)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁(yè)，共16頁(yè)ISSR原理簡(jiǎn)介原理簡(jiǎn)介nISSR(inter-simple sequence repeat)是Zie

6、tkeiwitcz等于1994年在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的分子標(biāo)記。其基本原理是:用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3端或5端加上2-4個(gè)隨機(jī)核昔酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的兩個(gè)SSR區(qū)域之間的多個(gè)條帶通過(guò)聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。由于微衛(wèi)星在基因組中廣泛分布，且等位變異特別豐富，因而可以檢測(cè)到高的多態(tài)性。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁(yè)，共16頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁(yè)，共16頁(yè)ISSR分子標(biāo)記的特點(diǎn)分子標(biāo)記的特點(diǎn)n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：ISSR 標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和SSR 的優(yōu)點(diǎn),

7、所需DNA模板的量少、多態(tài)性豐富, 無(wú)需試劑盒、結(jié)果記錄方便、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性較高、呈孟德?tīng)柺竭z傳 n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：是PCR 擴(kuò)增時(shí)最適反應(yīng)條件需要一定時(shí)間摸索, 其標(biāo)記大多為顯性標(biāo)記, 在解決交配系統(tǒng)、計(jì)算雜合度和父系分析等問(wèn)題時(shí)效果不佳 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁(yè)，共16頁(yè)特性特性RFLPRAPDSSRISSRAFLP分布 普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在普遍存在遺傳共顯性多數(shù)顯性共顯性多數(shù)顯性多數(shù)顯性多態(tài)性中高高高非常高等位檢測(cè)是不是是不是不是檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)1311015050更多20100樣品信息量低中高高高非常高基因組區(qū)域底拷貝編碼整個(gè)基因組整個(gè)基因組整個(gè)基因組整個(gè)基因組技術(shù)難度中等簡(jiǎn)

8、單簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單中等重復(fù)性高中等高高高DNA樣品量230g1100ng50-100ng250ng100ng耗費(fèi)時(shí)間慢快快快中等可靠性高中等高高高現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁(yè)，共16頁(yè)ISSR實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程DNA提取及檢測(cè)提取及檢測(cè) 引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增電泳檢測(cè)電泳檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)及分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)及分析必須對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括對(duì)Tag酶、引物濃度及其退火溫度、M g 2+濃度、模板濃度等?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁(yè)，共16頁(yè) 引物設(shè)計(jì)是 ISSR技術(shù)中最關(guān)鍵、最重要的一步?；蚪M中SSR 一般為 26個(gè)寡聚核苷酸，用于ISSR的引物常為 5或 3端加錨定的二核苷酸、三核苷 酸、四核苷酸重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)

9、一般為48 次，使引物的總長(zhǎng)度達(dá)到 1618bp 。 5或 3端用于錨定的堿基數(shù)目一般為 14個(gè)，錨定的目的是引起特定位點(diǎn)退火， 使引物與相匹配 SSR的一端而不是中間結(jié)合，從而對(duì)基因組中特定片段進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)。由于植物基因組中SSR最多的 是 (AT) n、(TA) n、(GA) n 、(CT) n等二核苷酸重復(fù)序列 ，在選擇 ISSR引物時(shí)，應(yīng)以二核苷酸重復(fù)序列為主，少選寡聚三核苷酸、四核苷酸引物。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁(yè)，共16頁(yè) PCR 產(chǎn)物需經(jīng)電泳分離、染色顯示后才能進(jìn)行譜帶觀察、統(tǒng)計(jì)。瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前通用的兩種電泳技術(shù)。一般采用1.5%-2%的瓊脂糖凝膠電泳或5%-8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。前者EB 染色紫外光下觀察、拍照；后者經(jīng)銀染可見(jiàn)光下觀察記錄，拍照。一般當(dāng)瓊脂糖電泳分離效果不理想時(shí)采