菌種的篩選和分離

1、工業(yè)微生物菌種的分離與篩選來(lái)源：青島海博 一、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求(一)、微生物工業(yè)的生產(chǎn)水平由三個(gè)要素決定：生產(chǎn)菌種的性能、發(fā)酵及提純工藝條件、生產(chǎn)設(shè)備。其中生產(chǎn)菌種的性能是最重要的因素。（二）、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求是：（1）菌株高產(chǎn)，在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物的能力;（2）在發(fā)酵過(guò)程中不產(chǎn)生或少產(chǎn)生與目標(biāo)產(chǎn)品相近的副產(chǎn)品及其他產(chǎn)物;（3）生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)，較強(qiáng)的生長(zhǎng)速率，產(chǎn)孢子的菌種應(yīng)該具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢子能力;（4）能夠高效地將原理轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品;（5）能利用廣泛的原材料，并對(duì)發(fā)酵原料成分的波動(dòng)敏感性小;（6）對(duì)需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力，并且不能將這些前體物質(zhì)作為一般碳源

2、利用;（7）在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌體的能力；（9）遺傳穩(wěn)定性， 二、工業(yè)用微生物菌種的來(lái)源及選育（一）微生物菌種的來(lái)源一般通過(guò)以下幾個(gè)途徑收集菌種、采集樣品和分離篩選：（1）是根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購(gòu)買；（2）從大自然中采集樣品分離；（3）從一些發(fā)酵制品中分離篩選目的菌株。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)所用菌種總趨勢(shì)是從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌，自然選用轉(zhuǎn)向代謝育種，從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種。（二）微生物工業(yè)菌種的分離1、野生菌株的分離、篩選過(guò)程（1）新菌種分離與篩選的步驟菌種分離的流程如下：標(biāo)本采集 標(biāo)本材料的預(yù)處理富集培養(yǎng)菌種初篩 菌

3、種復(fù)篩性能鑒定 菌種保藏 采樣采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。標(biāo)本預(yù)處理純種分離：采用劃線分離法、稀釋分離法等純化方法獲取單菌落。高產(chǎn)菌株的篩選：這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，獲得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。還要對(duì)菌種進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定，毒性試驗(yàn)：據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和

4、枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn)。 2、菌種的分離方法（1）施加選擇性壓力分離法主要是利用不同種類的微生物其生長(zhǎng)繁殖對(duì)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)的要求不同，如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等，人為控制這些條件，使之利于某類或某種微生物生長(zhǎng)，而不利于其他種類微生物的生存，以達(dá)到使目的菌種占優(yōu)勢(shì)而得以快速分離純化的目的。如可以控制培養(yǎng)時(shí)的氧，可將好氧微生物和厭氧微生物分開(kāi)；通過(guò)控制溫度，可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開(kāi)；控制pH，可將嗜酸、嗜堿微生物分離等。在分離培養(yǎng)基中也可以加入不同的抗生素或試劑來(lái)增加選擇性。如在分離放線菌和細(xì)菌時(shí)，可加入抗真菌抗

5、生素；分離真菌時(shí)，可加入抗細(xì)菌藥物。（2）隨機(jī)分離方法有些微生物的產(chǎn)物對(duì)篩選沒(méi)有直接的選擇性指示作用，因此常采用隨機(jī)分離方法分離。A、抗生素產(chǎn)生菌的分離抗生素產(chǎn)生菌的分離常用抑菌圈法。實(shí)驗(yàn)必須用工具菌：采用抗生素的敏感菌，傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌和枯草桿菌。、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離常用方法：生化誘導(dǎo)法、SOS生色檢測(cè)法、DNA修復(fù)能力突變株。原理是利用DNA的損傷，微生物發(fā)生突變。B1、生化誘導(dǎo)法：將大腸桿菌的lacZ基因連接在噬菌體的PL啟動(dòng)子下，當(dāng)DNA損傷時(shí)，誘發(fā)阻遏物CI分解，PL啟動(dòng)子啟動(dòng)lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測(cè)定表達(dá)的ß-半乳糖苷酶活性，來(lái)檢測(cè)藥物的存在

6、。B2、SOS生色檢測(cè)法：利用當(dāng)DNA損傷時(shí)，可活化yecA蛋白，進(jìn)而分解噬菌體的阻遏蛋白，再引起sifA基因啟動(dòng)lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測(cè)定表達(dá)的ß-半乳糖苷酶活性，來(lái)檢測(cè)藥物的存在。、生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的分離以氨基酸產(chǎn)生菌為例，介紹篩選方法。首先將待試菌接入加了抗真菌的化合物（如亞胺環(huán)己酮）的分離培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后采用影印法，將菌落復(fù)印到能支持氨基酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3天后，用紫外線殺司長(zhǎng)好的菌落，再往此平板上面鋪一層相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株菌懸液，培養(yǎng)16小時(shí)后，被殺死的氨基酸產(chǎn)生菌的菌落周圍應(yīng)有一檢測(cè)菌的生長(zhǎng)圈。（3）目的微生物分離A、根據(jù)形態(tài)篩選突變株B、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩

7、選變株 透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、渾濁圈法等。透明圈法：在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見(jiàn)的透明圈。 在分離某種產(chǎn)生有機(jī)酸的菌株時(shí)，也通常采用透明圈法進(jìn)行初篩。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來(lái)。分離乳酸產(chǎn)生菌時(shí)，由于乳酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，因此，在培養(yǎng)

8、基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。 變色圈法：對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來(lái)。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長(zhǎng)成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.27.6，當(dāng)pH在6.2以下時(shí)為黃色，pH7.6以上為藍(lán)色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。 生長(zhǎng)圈法：生

9、長(zhǎng)圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營(yíng)養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營(yíng)養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會(huì)形成一個(gè)混濁的生長(zhǎng)圈。如嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長(zhǎng)圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。 抑菌圈法：常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長(zhǎng)的抑菌圈，很容易被鑒別出來(lái)。實(shí)驗(yàn)十從自然界中分離篩選微生物菌種

10、60;1 目的（1）學(xué)習(xí)并掌握優(yōu)良曲霉菌的分離原理和方法。（2）學(xué)習(xí)工掌握酸乳中乳酸菌的分離原理和方法。2 原理從自然界中分離篩選微生物菌種，是我們獲得優(yōu)良新菌種最基本、最主要的方法，因此，食品工業(yè)菌種的分離篩選是一項(xiàng)重要的、長(zhǎng)期而繁重的工作。自然界存在著各種各樣的微生物，尤其是土壤中微生物種類齊全，是微生物的大本營(yíng)。因此可以從土壤中分離到幾乎所有微生物。另外，不同的自然界環(huán)境中生存的微生物優(yōu)勢(shì)菌種也不同。各種食品、農(nóng)副產(chǎn)品等營(yíng)養(yǎng)組成不同，從中可以分離出不同的微生物。食品工業(yè)菌種常用的分離源有被污染的生產(chǎn)或科研菌種、生產(chǎn)中長(zhǎng)期使用的菌種、發(fā)酵食品用菌種、動(dòng)物腸道菌群、經(jīng)各種

11、育種方法處理過(guò)的微生物材料和自然界菌種樣品。自然界的微生物是混雜生存的，要從中分理出一種微生物，不僅需要考慮分離源應(yīng)含有較多數(shù)量的目的菌，還要在分離操作中使之與其他菌種相互分開(kāi)。對(duì)于樣品中含量較低的菌處，要針對(duì)其生物學(xué)特點(diǎn)合理設(shè)計(jì)分離方法，如富集培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、利用其特殊的生理反應(yīng)產(chǎn)生特定的生長(zhǎng)現(xiàn)象等，以便于從大量雜菌中選出目的菌種。從混雜群體中分離特定微生物的常用方法有：控制分離培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、控制培養(yǎng)基的pH值、添加抑制劑、控制培養(yǎng)溫度、控制空氣條件、對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理等。常用的純種分離方法有平板劃線分離法、簡(jiǎn)單平板分離法、稀釋分離、涂布分離法、毛細(xì)管分離法、顯微操作單細(xì)胞分離法等。本實(shí)

12、驗(yàn)將采用稀釋法和涂布法對(duì)目的微生物進(jìn)行分離篩選。優(yōu)良曲霉菌的分離采用透明圈法，即先用淀粉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)樣品，由于糖化酶的作用，長(zhǎng)出的菌落周圍的淀粉被水解，遇碘后呈無(wú)色透明圈而平板的其他處呈藍(lán)色。一般來(lái)講，透明圈的直徑越大，該菌的糖化力越強(qiáng)。可根據(jù)透明圈的大小篩選出糖化力強(qiáng)的菌株。酸乳中乳酸菌的分離采用溴甲酚綠（BCG）牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板分離法。溴甲酚綠指示劑在酸性環(huán)境中呈黃色，在堿性環(huán)境中呈藍(lán)色。在分離培養(yǎng)基（pH6.8）中加處溴酚綠指示劑后呈藍(lán)綠色，乳酸菌在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并分解乳糖，產(chǎn)生乳酸，使菌落呈黃色，菌落周圍的培養(yǎng)基也變?yōu)辄S色。乳酸可用紙上層析法鑒別。3 材料3.1 

13、樣品黑曲霉種曲、酸奶。3.2 器具及其他用品平皿、三角瓶、涂布器、試管、玻璃珠、紗布。3.3 培養(yǎng)基及試劑2%淀粉察氏培養(yǎng)基、BCG牛乳培養(yǎng)基、0.02mol/L碘液、10%牛乳培養(yǎng)基、無(wú)菌生理鹽水。4 流程4.1 優(yōu)良糖化酶菌株的分離與篩選融化培養(yǎng)基倒平板打散孢子團(tuán)粒梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察滴加碘液挑菌落接種培養(yǎng)糖化酶活力測(cè)定菌種保存4.2 酸乳制品中的乳酸菌的分離制培養(yǎng)基倒平板梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察挑菌落接牛乳管培養(yǎng)觀察傳代培養(yǎng)挑選凝乳管乳酸測(cè)定菌種保存5 步驟5.1 優(yōu)良糖化酶菌株的分離與篩選（1）融化淀粉察氏培養(yǎng)基

14、，稍冷后倒平板與斜面數(shù)個(gè)。（2）取種曲少許，加入10mL帶玻璃球的無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，用力振蕩打散孢子團(tuán)粒，使之形成均勻的孢子懸浮粒。然后將其用無(wú)菌紗布過(guò)濾于無(wú)菌試管中。（3）將上述濾液以10倍稀釋法知釋至10-7，取后3個(gè)稀釋度的稀釋液各0.2mL，于淀粉察氏培養(yǎng)基平板上用無(wú)菌涂布器分別依次涂布2至3個(gè)皿，30培養(yǎng)12d。（5）性能測(cè)定：測(cè)定各菌落的糖化酶活力。5.2 酸乳制品中的乳酸菌的分離（1）制備BCG牛乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。稱取脫脂奶粉10g，溶于50mL水中，加入1.6%溴甲酚綠酒精溶液0.07mL，0.075MPa壓力下滅菌20min。另取瓊脂2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后調(diào)pH值至6.8，0.1MPa壓力下滅菌20min。趁熱將上述兩液以無(wú)菌操作混合均勻，倒平板6個(gè)，待凝固后，置37培養(yǎng)24h，若無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可使用。（2）將樣品以10倍稀釋法稀釋至10-7，取其中10-7、10-6 2個(gè)稀釋度的稀釋液各0.10.2mL，分別置于上述各營(yíng)養(yǎng)平板上，用無(wú)菌涂布器依次涂布2至3個(gè)皿，置43培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基亦為黃色者初步定為乳酸菌。（3）將典型菌