微生物工程(中國藥科大學生物工程所有課件)

1、第六章第六章 微生物工程微生物工程第一節(jié) 概述一、微生物工程的概念及發(fā)展一、微生物工程的概念及發(fā)展1、概念 微生物工程(microbial engineering)是一門利用微生物的生長和代謝活動來生產(chǎn)各種有用物質的工程技術。2、發(fā)展簡史第一階段 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵技術天然發(fā)酵 不知什么是微生物，卻在生活實踐中利用自然的發(fā)酵現(xiàn)象來生產(chǎn)食品。如酒、醬等的家庭作坊式生產(chǎn)，時常被染雜菌困擾，不能控制。第二階段 第一代微生物發(fā)酵技術 純培養(yǎng)技術的建立純培養(yǎng)技術：用培養(yǎng)基培養(yǎng)純的微生物。 1857年，法國的巴斯德指出發(fā)酵現(xiàn)象是由微小生命體進行的化學反應。1905年，德國的柯赫發(fā)明了固體培養(yǎng)基，使天然發(fā)酵轉

2、為純培養(yǎng)，污染現(xiàn)象減少。第三階段 第二代微生物發(fā)酵技術 深層培養(yǎng)技術 抗生素：是生物（微生物、植物和動物）在其生命活動中產(chǎn)生，并能在低濃度下有選擇的抑制或殺滅其它微生物或腫瘤細胞的有機物質第四階段 第三代微生物發(fā)酵技術 微生物工程 運用現(xiàn)代生物技術DNA重組和原生質體融合技術，有控制有目的的進行生產(chǎn)產(chǎn)品。二、微生物工程的一般過程（一）菌種的選育與菌種保藏（一）菌種的選育與菌種保藏1.菌種的分離微生物工程常用的微生物（1）細菌 是自然界分布最廣、數(shù)量最多的一類微生物。 工業(yè)生產(chǎn)常用的細菌有: 乳酸桿菌屬 芽孢桿菌屬 醋酸桿菌屬 大腸桿菌屬2.酵母菌工業(yè)上用的酵母菌有:啤酒酵母、假絲酵母、畢赤酵母

3、等（3）霉菌凡生長在營養(yǎng)基質上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮狀菌絲的真菌統(tǒng)稱為霉菌。工業(yè)上常用的霉菌有根霉、曲霉等。（4）放線菌產(chǎn)生抗生素 （5）擔子菌 擔子菌資源的利用正引起人們的重視，如多糖、橡膠物質和抗癌藥物的開發(fā)。 （6）藻類1、菌種的分離2、菌種的篩選土樣的采取 預處理 培養(yǎng) 菌落的選擇 菌種的鑒定目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物3、菌種的保藏、菌種的保藏 斜面低溫保藏法斜面低溫保藏法 液體石蠟封存法液體石蠟封存法 甘油冷凍保藏法甘油冷凍保藏法 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法 其他干燥保藏法其他干燥保藏法斜面低溫保藏法4，36個月特點簡便保藏時間短易污染

4、及退化液體石蠟封存法13年甘油冷凍保藏法凍存在-70-80度，可以保存35年冷凍干燥保藏法 510年液氮超低溫保藏法需要加入甘油等保護劑（二）培養(yǎng)發(fā)酵（二）培養(yǎng)發(fā)酵 控制發(fā)酵條件如營養(yǎng)物濃度、溫度、pH、壓力、溶解氧濃度等（三）發(fā)酵產(chǎn)品下游的加工過程（三）發(fā)酵產(chǎn)品下游的加工過程 發(fā)酵產(chǎn)物不同，分離提純的方法會有所不同，產(chǎn)物分離、提純的一般方法是： 代謝產(chǎn)物：蒸餾、萃取、離子交換等方法。 菌體本身：過濾、沉淀。（四）廢棄物的處理（四）廢棄物的處理包括三部分： 原料處理過程剩下的廢渣產(chǎn)品分離與純化提取過程剩下的廢渣、細胞生產(chǎn)過程中的洗滌水、冷卻水 生化需氧量（BOD）：指在規(guī)定條件下，微生物分解存

5、在水中的某些可氧化物質，特別是有機物所進行的生物化學過程中消耗溶解氧的量。 化學需氧量(COD)：指著一定條件下，水中的還原性物質在外加強氧化劑作用下，被氧化分解所消耗氧化劑的數(shù)量。三、微生物工程的特點與化學工程相比（1）通過選育可以獲得高性能菌種，提高產(chǎn)能（2）反應條件溫和，通常在常溫常壓下進行（3）能夠進行復雜的反應過程，且多個反應可同時進行（4）發(fā)酵產(chǎn)物通常為可降解的有機物質存在的問題：（1）提取和精制困難（2）生產(chǎn)過程影響因素多（3）生產(chǎn)前準備工作量大，花費高，相對化學反應，反應器效率多。（4）發(fā)酵廢水具有較高的BOD和COD，需處理后排放。培養(yǎng)基：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細胞

6、生長 繁殖 所需的一組營養(yǎng)物質和原料。同時培養(yǎng)基也為微生 物培養(yǎng)提供除營養(yǎng)外的其它所必須的條件。 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的作用： 滿足菌體的生長促進產(chǎn)物的形成第二節(jié) 微生物細胞培養(yǎng)技術發(fā)酵培養(yǎng)基的要求 培養(yǎng)基能夠滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟的合成。 發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。 培養(yǎng)基的原料應因地制宜，價格低廉；且性能穩(wěn)定，資源 豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模儲藏，能保證生產(chǎn)上的 供應。 所選用的培養(yǎng)基應能滿足總體工藝的要求。（一）碳源1、作用提供微生物菌種的生長繁殖所需的能源和合成菌體所必需的碳成分 提供合成目的產(chǎn)物所必須的碳成分2、來源糖類、油脂、有機酸、正烷烴v一、培養(yǎng)基的組成3、工業(yè)上常用的糖類

7、葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖 但是會引起葡萄糖效應q 工業(yè)上常用淀粉水解糖,但是糖液必須達到一定的質 量指標 糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物。主要含有蔗糖，總糖可達50%75%注意：糖蜜含有較多的雜質，有些需要進行預處理。 淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、 發(fā)酵液比較稠。優(yōu)點：來源廣泛、價格底 難利用，可以解除葡萄糖效應（二）氮源 氮源主要用于構成菌體細胞物質，常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。 1、有機氮源成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機 鹽及生長因子。例 玉米漿： 可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸 較多的乳酸 硫、磷、

8、微量元素等種類：氨鹽、硝酸鹽和氨水特點：微生物對它們的吸收快，所以也稱之謂迅速利用的氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH 生理酸性物質；生理堿性物質2、無機氮源選擇合適的無機氮源有兩層意義： q 滿足菌體生長q 穩(wěn)定和調節(jié)發(fā)酵過程中的pH氮源使用的一些相關問題：q 有機氮源和無機氮源應當混合使用早期：容易利用易同化的氮源無機氮源中期：菌體的代謝酶系已形成、則利用蛋白質q 有些產(chǎn)物會受氮源的誘導和阻遏q 有機氮源選取時也要考慮微生物的同化能力q 開發(fā)效果好、有針對性的有機氮源仍

9、然是令人感興趣 的課題（三）無機鹽和微量元素1、作用：各種不一樣2、來源：C、N源，以鹽的形式補充3、用量：根據(jù)具體的產(chǎn)品，以實驗決定4、使用注意點A. 對于其它渠道有可能帶入的過多的某種無機離子和 微量元素在發(fā)酵過程中必須加以考慮例：鐵離子 青霉素發(fā)酵中，鐵離子的濃度要小于20g/ml 發(fā)酵罐必須進行表面處理B、使用時注意鹽的形式（pH的變化）（四）生長因素和發(fā)酵刺激物 從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。 1、生長因素2、前體青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136作用：前體有助于提高產(chǎn)量和組份 用法：前體使用時普遍采用流加的方法

10、 前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利 苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07% 前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化. 流加也有利于提高前提的轉化率3、發(fā)酵刺激物 產(chǎn)物促進劑：是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑。（五）水 水源質量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。 按組成物質來源合成培養(yǎng)基 : 原料其化學成分明確、穩(wěn)定 q 適合于研究菌種基本代謝和過程的物質變化規(guī)律 q 培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn) 天然培養(yǎng)基: 采用天然原料 q 原料來源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價格低廉、適于

11、工業(yè)化生產(chǎn) q 原料質量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性 二、培養(yǎng)基的種類按狀態(tài)固體培養(yǎng)基 :用于菌種的培養(yǎng)和保存，是在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑配成。也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)。 半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%0.8% ,主要用于微生物的鑒定。 液體培養(yǎng)基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。 按用途（從發(fā)酵生產(chǎn)應用考慮） 培養(yǎng)基按其用途可分為孢子（斜面）培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種 三、滅菌 指用化學的或物理的方法殺滅或除掉物料或設備中所有的生命有機體的技術或工藝過程。 常用的

12、方法有加熱滅菌法、輻射滅菌法、介質過濾除菌法、化學滅菌法（一）加熱滅菌法是發(fā)酵工業(yè)中最常用的滅菌方法。分為濕熱滅菌和干熱滅菌法。濕熱滅菌法直接蒸汽滅菌，蒸汽冷凝時釋放大量潛熱，并具有強大的穿透力，在高溫和水存在時，微生物細胞中的蛋白質極易發(fā)生不可逆的凝固性變性，短時間內殺死微生物。干熱滅菌 指在干燥高溫條件下，微生物細胞內的各種與溫度有關的氧化反應速度迅速增加，使微生物的致死率迅速增高的過程。（二）輻射滅菌法是利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺滅微生物。紫外線：作用于微生物的核酸 對營養(yǎng)細胞和芽孢均有效,但穿透力低，只適于表面滅菌。X射線和射線:使菌體內的水和有機物產(chǎn)生強烈的離子化反應，阻礙微

13、生物代謝活動而導致菌體迅速死亡。（三）介質過濾除菌法是用過濾方法除去活的或死的微生物的方法。主要用于對熱不穩(wěn)定的藥物溶液、氣體、水的滅菌。（四）化學滅菌法 是通過藥劑與微生物細胞接觸而發(fā)生諸如蛋白質變性等作用而達到殺滅微生物的目的。常用藥劑：甲醛、苯酚、高錳酸鉀四、微生物的培養(yǎng)方法 根據(jù)培養(yǎng)基的性質可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)（一）固體培養(yǎng)法1、斜面培養(yǎng)法常用于菌種復壯和暫時保存。2、平板培養(yǎng)法常用于菌種分離3、穿刺培養(yǎng)法常用于厭氣菌的保藏（二）液體培養(yǎng)法1、靜置培養(yǎng)法2、振蕩培養(yǎng)法3、通氣攪拌培養(yǎng)法 發(fā)酵罐示意圖發(fā)酵罐示意圖 厭氧發(fā)酵：厭氧發(fā)酵：適用于厭氧或兼性厭氧微生物的發(fā)酵，如丙酮丁醇發(fā)酵、

14、酵母菌的酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵等 好氧發(fā)酵：好氧發(fā)酵：適用于好氧微生物的發(fā)酵，如鏈霉素、谷氨酸、檸檬酸等的發(fā)酵根據(jù)是否需要氧氣可分為厭氧發(fā)酵和好氧發(fā)酵（一）分批培養(yǎng)（一）分批培養(yǎng) 指在發(fā)酵過程中，除了不斷進行通氣（好氧發(fā)酵）和為調節(jié)發(fā)酵液的 pH 而加入酸堿溶液外，與外界沒有其它物料交換的一種發(fā)酵方式。培養(yǎng)基的量一次性加入，產(chǎn)品一次性收獲，是目前廣泛采用的一種發(fā)酵方式。 根據(jù)投料方式的不同可分為分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。 分批培養(yǎng)中微生物的生長遲滯期對數(shù)生長期穩(wěn) 定 期死亡期優(yōu)點 操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質量容易掌握缺點 產(chǎn)率低，不適于測定動力學數(shù)據(jù)（二）連

15、續(xù)培養(yǎng)（二）連續(xù)培養(yǎng) 指 連續(xù)不斷地向反應器（發(fā)酵罐）中流加新鮮發(fā)酵液，同時又連續(xù)不斷地排出發(fā)酵液，從而使 pH 、養(yǎng)分、溶解氧等保持恒定，使微生物的生長和代謝活動保持旺盛穩(wěn)定狀態(tài)的一種發(fā)酵方式 。優(yōu)點優(yōu)點 高效，產(chǎn)品質量較穩(wěn)定，節(jié)約能源。缺點缺點 菌種不穩(wěn)定的話，長期連續(xù)培養(yǎng)會引起菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。 （三）補料分批培養(yǎng)（三）補料分批培養(yǎng) 是指在微生物分批發(fā)酵過程中，以某種方式向發(fā)酵系統(tǒng)中補加一定物料，但并不連續(xù)地向外放出發(fā)酵液的發(fā)酵技術，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術。 （四）半連續(xù)培養(yǎng) 在補料分批培養(yǎng)的基礎上間歇放掉部分發(fā)酵液稱為半連續(xù)培養(yǎng)。五、發(fā)

16、酵過程的控制（一）物理參數(shù)壓力料液流量攪拌轉速黏度空氣流量濁度攪拌功率物理參數(shù)溫度溫度溫度對發(fā)酵的影響：1、溫度影響反應速率2、溫度影響發(fā)酵方向最適溫度的選擇：1、根據(jù)菌種及生長階段選擇2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇3、根據(jù)菌生長情況（二）化學參數(shù)基質濃度溶解氧濃度氧化還原電位產(chǎn)物的濃度廢氣中的氧濃度pH值廢棄中的CO2濃度pH值值發(fā)酵過程pH變化的原因（1）基質代謝 糖代謝、氮代謝 、生理酸堿性物質利用后pH會上升或下降（2）產(chǎn)物形成（3）菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升pH對發(fā)酵的影響（1）pH影響酶的活性（2）pH值影響微生物細胞膜所帶電荷的改變（3）pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解

17、離，從而影響微生物對這些物質的利用（4）pH影響代謝方向pH的控制(1)調節(jié)好基礎料的pH(2)在基礎料中加入維持pH的物質(3)通過補料調節(jié)pH (4)當補料與調pH發(fā)生矛盾時，加酸堿調pH(5)不同調pH方法的影響(6)發(fā)酵的不同階段采取不同的pH值基質濃度 基質就是發(fā)酵液中的各種營養(yǎng)物質，基質濃度指發(fā)酵液中糖、氮、磷等重要營養(yǎng)物質的濃度溶解氧濃度 溶解氧濃度一般用絕對含量10-6（g/ml）表示，有時也用在相同條件下，氧在培養(yǎng)液中飽和度的百分數(shù)來表示。明顯下降的原因：（1）污染了需氧性雜菌。（2）菌體代謝發(fā)生了異常，消耗氧增多 ( 3）某些設備或者工藝控制出現(xiàn)故障明顯上升的原因氧化還原電

18、位 也是控制發(fā)酵過程的參數(shù)之一。氧化還原電位的適宜值和微生物的種類還有生理狀態(tài)有關。 產(chǎn)物的濃度 衡量產(chǎn)量的高低或判斷合成代謝是否正常。也是決定發(fā)酵周期長短的根據(jù)。廢氣中的氧濃度廢氣中的CO2濃度 測定廢氣中的CO2可以算出產(chǎn)生菌的呼吸熵，從而了解產(chǎn)生菌的呼吸代謝規(guī)律。CO2對菌體生長的影響CO2對產(chǎn)物合成的影響（三）生物參數(shù)菌絲形態(tài)菌體濃度發(fā)酵過程中泡沫產(chǎn)生的原因（1）通氣攪拌的強烈程度（2）培養(yǎng)基配比與原料組成（3）菌種、種子質量和接種量（4）滅菌質量 （四）泡沫的影響與控制起泡的危害：降低生產(chǎn)能力引起原料浪費影響菌的呼吸引起染菌消除泡沫的方法機械消沫原理：靠機械力引起強烈振動或者壓力變化

19、，促使泡沫破裂，或借機械力將排出氣體中的液體加以分離回收。優(yōu)缺點化學消沫原理：當泡沫的液膜具有較大的表面粘度時，可以加入某些分子內聚力較小的物質，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液體流失，導致泡沫破裂天然油脂類消泡劑、聚醚類消泡劑、醇類消泡劑、硅酮類消泡劑第三節(jié)第三節(jié) 微生物菌種選育及原生微生物菌種選育及原生質體技術質體技術一、菌種選育的理論基礎基因突變1基因重組2遺傳型變異表型變異二、菌種選育的經(jīng)典方法（一）自然選育自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-810-9（二）誘變育種1、出發(fā)菌株的選擇1234具備某種優(yōu)良特性對誘變劑敏感出發(fā)菌株的穩(wěn)定性菌種的生理狀態(tài)及生長發(fā)育時間2、誘變處理誘

20、變處理物理誘變化學誘變生物誘變（1）物理誘變：紫外線、快中子、射線、射線、射線、激光。（2）化學誘變 引起DNA結構改變的一些化學物質。按照與DNA作用的方式分為三類：烷化劑、堿基類似物、移碼誘變劑（3）生物誘變 噬菌體可以作為誘變劑用于抗噬菌體的菌種的選育（4）誘變劑量的選擇（5）增變劑的使用3、突變株的篩選隨機篩選篩選半理性化篩選（1）隨機篩選 隨機篩選即菌種經(jīng)誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，從中挑選高產(chǎn)菌株。（2）半理性化篩選 根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調控機制和產(chǎn)物分子結構來進行設計和采用的篩選方法。誘變育種工作中幾個應注意的問題：A 選擇好出發(fā)菌株 B 復合誘

21、變因素的使用C 劑量選擇D 變異菌株的篩選E 高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合原生質體（protoplast)：動植物和微生物細胞去除細胞壁以后的一種細胞結構。三條標準（1958年Brenner)： 沒有細胞壁 失去細胞剛性，成球形 對滲透壓敏感脆弱三、原生質體融合原生質體融合 用脫壁酶處理將微生物細胞壁除去，制成原生質體，再用聚乙二醇（PEG）促進原生質體發(fā)生融合，從而獲得融合子。（五）融合子的選擇（四）原生質體的再生（三）原生質體的融合（二）原生質體的制備（一）標記菌株的篩選（二）原生質體的制備6.滲透壓穩(wěn)定劑5.酶解時間4.酶解溫度3.酶濃度2.菌體的培養(yǎng)時間1.菌體的預處理（三）原生質體的融合 原生體在誘融劑或正弦電場作用下凝集，彼此靠近, 兩個相鄰原生質體之間的質膜相互融合，兩親本原生質體質膜上的受體、糖蛋白。糖脂等成分也在融合后的質膜上重新分布,細胞質發(fā)生融合,細胞核發(fā)生融合，形成單核融合細胞PEG誘導融合的原理誘導融合的原理 PEG是帶負電的高分子化合物，在原生質體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質體凝集，洗脫過程中PEG可被洗掉，導致質膜表面電荷重排。粘連的質膜大面積緊