論文實(shí)驗(yàn)方案

1、測(cè)定花青素、多糖對(duì)自由基清除的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)方案一、原理多糖(polysaccharides)是由許多相同或不同的單糖以-或-糖苷鍵所連接而成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子化合物。20世紀(jì)60年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫、降血糖和降血脂等，而且對(duì)機(jī)體幾乎無毒副作用。它廣泛存在于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁中。原花青素(proanthocyanidins)是由單體黃烷-3-醇類物質(zhì)以不同聚合度連接而成的多酚類化合物，研究表明，原花青素具有廣泛的生化和藥理活性，如抗氧化、清除自由基、護(hù)肝解毒、抗菌及抗癌等功能，目前已經(jīng)成為醫(yī)藥、保健品的重要原料及食品、化妝品的重要添加劑，它廣泛存在于各

2、種植物的核、皮或種籽中二、材料、儀器和試劑1. 材料：黑枸杞,2017年由靜樂縣提供2. 試劑：二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品;原花青素PC對(duì)照品（源自葡萄籽,純度>95%）;香草醛,大孔吸附樹脂HPD-200A、HPD-400A、HPD-700,聚酰胺30-60目;葡聚糖凝膠SephadexLH-20;色譜級(jí)甲醇、乙腈、醋酸;甲醇、乙醇、鹽酸、硫酸、石油醚、丙酮、甲酸、冰乙酸、三氯乙酸、正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖、蒽酮、茚三酮、苯酚、考馬斯亮藍(lán)、氯化鈉、三氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鉀、無水氯化鈣、碘化鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。3. 儀器：粉碎機(jī),分析天

3、平,超純水機(jī),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,冷凍干燥機(jī),真空干燥箱,紫外分光光度計(jì),PB-10酸度計(jì),BT-100恒流泵,DL-5M冷凍離心機(jī),HH-6電熱恒溫水浴鍋,恒溫鼓風(fēng)干燥箱,7200型可見光分光光度計(jì),超聲波清洗器,JR-2集熱式磁力攪拌器,高效液相色譜儀,高速冷凍離心機(jī),氣質(zhì)聯(lián)用儀,層析柱(2.5cm×50cm)三、實(shí)驗(yàn)過程：參照1. 材料的預(yù)處理：將黑枸杞放于烘箱中40條件下烘4h，取出用粉碎機(jī)粉碎，后置于干燥器中備用。2. 提取方法：1)準(zhǔn)確稱取一定量黑枸杞粉于100mL具塞三角瓶中，在超聲功率400W、料液比為1:70（g:ml）、乙醇濃度40%、反應(yīng)溫度60等條件下提取30min，

4、冷卻至室溫2）離心(5000r/min，10min，常溫)，取上清液，3）經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60)濃縮至1/10體積左右，然后加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，攪拌均勻后置4冰箱中12h，4)離心(5000r/min，10min，4)，得上清液(原花青素粗提物)和沉淀物（多糖）。3. 多糖、花青素得率的計(jì)算1）多糖得率的計(jì)算a) 標(biāo)曲的制作：稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用去離子水定容到50mL，配成0.2mg/mL的葡萄糖溶液，分別從中移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL定容到10mL，以蒸餾水為空白對(duì)照，取上述溶液1.0mL，加入5mL蒽酮試液，冰浴5min，后置沸水浴10mi

5、n，取出后用自來水冷卻2min，靜置10min后在627nm處測(cè)定其吸收值。b) 樣品得率的測(cè)定以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，做回歸處理，得回歸方程。將上述粗提取得到的沉淀物用去離子水溶解并定容到50mL，即為待測(cè)樣，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算多糖含量。多糖提取率/%=(C×V/1000m)×100式中:c，從回歸方程中計(jì)算得出的多糖的濃度(mg/mL);V，多糖定容體積(mL);m，黑枸杞樣品的質(zhì)量(g)。2）原花青素提取率計(jì)算a) 標(biāo)曲的制作：稱取2.5mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容到5mL，然后吸取0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL定容到5mL，分

6、別從中抽取1mL加入2.5mL1%香草醛-60%乙醇溶液和2.5mL濃鹽酸，避光，30水浴30min，以60%乙醇為空白對(duì)照，在500nm處測(cè)定吸收值。b) 樣品得率的測(cè)定以原花青素濃度為縱坐標(biāo)，吸光度值為橫坐標(biāo)，做回歸處理，得回歸方程。吸取上述粗提取得到的上清液1mL，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算原花青素含量。原花青素提取率/%=(C×V/1000m)×100式中:c，從回歸方程中計(jì)算得出的原花青素的濃度(mg/mL);V，待測(cè)樣總體積(mL);m，黑枸杞樣品的質(zhì)量(g)。4. 分別測(cè)定黑枸杞花青素、多糖對(duì)自由基的清除作用a) DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱量0.025gDPPH于小

7、燒杯中,加入適量蒸餾水和3ml甲醇溶解，再于100mL容量瓶中用蒸餾水定容，即得1000mol/LDPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。將1000mol/LDPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水分別稀釋成100、200、400、600、800mol/L的DPPH溶液。用移液槍分別吸取0、100、200、400、600、800、1000mol/L的DPPH溶液各200L于已加入7.8mLDPPH甲醇液的10mL棕色容量瓶中。混勻后，將其置于室溫暗處反應(yīng)60min，然后在515nm處測(cè)定殘留DPPH自由基吸光值。對(duì)照組設(shè)置為200L甲醇溶液代替標(biāo)準(zhǔn)液。根據(jù)DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與已知濃度的DPPH標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)DPPH自由基的抑制率繪制標(biāo)

8、準(zhǔn)曲線。b) DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)根據(jù)Brand、William等的方法并略做修改。用分析天平準(zhǔn)確稱取0.0025gDPPH，再用少量甲醇溶解并于100mL棕色容量瓶中用甲醇定容，避光保存，即得100mol/LDPPH工作液。吸取4.8mLDPPH工作液于試管中，加入0.2mL原花青素提取液（避光），混勻，避光反應(yīng)60min后，在515nm下測(cè)定殘留DPPH自由基吸光值，每個(gè)試驗(yàn)平行重復(fù)三次。抑制率：X=（1-DPPHt /DPPHt=0）×100式中：DPPHt=0表示0 時(shí)刻體系中DPPH·的起始濃度；DPPHt表示t 時(shí)刻體系中DPPH·的濃度。以各樣品的濃度對(duì) DPPH的清除率作圖，可以得到各樣品對(duì)D P P H 清除率達(dá) 5 0 % 時(shí)所需各樣品的量，即IC50值。四、綜合比較，花青素、多糖單獨(dú)存在時(shí)的IC50以及黑枸杞多糖與花青素的復(fù)配物的IC50得出多糖、花青素對(duì)自由基清除的協(xié)同作用。五、參考文獻(xiàn)1李丹丹,梁英,楊宏志,朱磊.葡萄籽原花青素提取工藝的研究J.中國(guó)食品添加劑,2017(08):55-62.2白海娜. 黑木耳多糖AAP-4與原花青素對(duì)輻射誘導(dǎo)氧化損傷協(xié)同防護(hù)作用D.哈爾濱工業(yè)大學(xué),2016.3余紅軍,李立祥,倪媛,袁芳,王曉莉,孫海洋.油茶籽殼中多糖和原花青素的超聲波提取工藝J.食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36