表觀遺傳學(xué)的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究2009CB825500G

1、項(xiàng)目名稱：表觀遺傳學(xué)的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究首席科學(xué)家：許瑞明 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所起止年限：2009.1至2013.8依托部門：中國(guó)科學(xué)院一、研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目的主要研究?jī)?nèi)容是以X光晶體學(xué)方法為主要研究手段，結(jié)合其它生物物理和生物化學(xué)方法，深入研究以下幾項(xiàng)表觀遺傳學(xué)的重要問(wèn)題：組蛋白修飾酶的反應(yīng)機(jī)理和底物特異性主要幾類組蛋白共價(jià)修飾有乙酰/去乙?；⒓谆?去甲基化、磷酸/去磷酸化、泛素/去泛素化。其中組蛋白的乙酰/去乙酰化和甲基/去甲基化是近年來(lái)表觀遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，這也是本項(xiàng)目的研究焦點(diǎn)。盡管這方面的結(jié)構(gòu)研究已有一定的進(jìn)展，但還有一些重要的問(wèn)題并不清楚。例如組蛋白H3的第四個(gè)賴氨酸(H3K4)和H4

2、K20的三甲基化酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理還有待解析；到目前為止H3K36和H3K27的甲基化酶識(shí)別其對(duì)應(yīng)的賴氨酸的機(jī)理也不清楚。我們將著重研究H3K4、H3K36、H3K27和H4K20的甲基化和去甲基化酶的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究。同時(shí)，我們也將進(jìn)行對(duì)組蛋白乙酰/去乙酰化、泛素/去泛素化和磷酸化酶的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究。修飾后的組蛋白識(shí)別目前已知的識(shí)別組蛋白乙?；挠蠦romo結(jié)構(gòu)域，識(shí)別甲基化后賴氨酸的有Chromo,Tudor,PHD,WD40等結(jié)構(gòu)域。其中有的PHD和WD40結(jié)構(gòu)域也和未修飾的組蛋白結(jié)合?？梢灶A(yù)測(cè)的是同一個(gè)修飾過(guò)的組蛋白末端殘基將有不同蛋白質(zhì)中的以上或全新的結(jié)構(gòu)域識(shí)別。例如甲基化

3、后的H3K4可被PHD和Tudor結(jié)構(gòu)域識(shí)別。更重要的一個(gè)科學(xué)問(wèn)題是一個(gè)組蛋白上的多個(gè)或多種修飾是怎樣被同時(shí)識(shí)別的。本項(xiàng)目將發(fā)展化學(xué)生物學(xué)新方法來(lái)制備有關(guān)的組蛋白樣品，利用光晶體學(xué)、電鏡和生物化學(xué)、分子生物學(xué)方法來(lái)研究組蛋白多種修飾的共識(shí)別以及新發(fā)現(xiàn)的單識(shí)別模式，例如PCL的PHD結(jié)構(gòu)域與甲基化后的H3K27的結(jié)合。組蛋白修飾酶的活性調(diào)控和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用有些組蛋白酶，例如大部分乙酰化酶和甲基化酶，單獨(dú)就具有酶活性；而另一些組蛋白酶，例如大部分去乙酰化酶和部分甲基化酶和乙?；福挥信c其它蛋白質(zhì)形成復(fù)合體時(shí)才有酶活性。還有一種情況就是復(fù)合體的形成大大地提高了酶活性。組蛋白修飾酶復(fù)合體里亞基

4、之間的相互作用是怎樣激活或者提高組蛋白修飾酶的活性的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究在國(guó)際上到目前為止還是空白，這也是本項(xiàng)研究的重點(diǎn)。同時(shí)，我們也將緊密追蹤表觀遺傳學(xué)發(fā)展新動(dòng)向，對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的重要的組蛋白修飾酶與其它蛋白的相互作用，包括HDAC與含PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的相互作用，及時(shí)地闡明它們的結(jié)構(gòu)機(jī)理。基于組蛋白修飾酶的藥物設(shè)計(jì)很多組蛋白修飾酶在疾病發(fā)生中有很大的作用。例如H3K4，H3K36和H3K79甲基化酶MLL，NSD1和hDot1L在白血病里，而H3K9和H3K27甲基化酶SUV39和EZH2在多種癌癥里都有很大的作用。我們過(guò)去的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究都涉及了相關(guān)的甲基化酶。我們將在本項(xiàng)目里繼續(xù)深入研究與重大疾病

5、相關(guān)的組蛋白修飾酶的結(jié)構(gòu)和功能，利用所得到的結(jié)構(gòu)信息用計(jì)算生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)的方法進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的初期研究。以上幾個(gè)方向?qū)⑹潜卷?xiàng)目今后五年的研究重點(diǎn)。為了給進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)，我們也將同時(shí)開展蛋白質(zhì)與核小體復(fù)合體的探索性研究。這項(xiàng)研究的意義是盡管核小體的晶體結(jié)構(gòu)解析已完成10年多了，到目前為止唯一只有一個(gè)與短肽結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)被解析。染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及其調(diào)控涉及到多種不同的蛋白質(zhì)與核小體的相互作用，所以這方面的研究將是今后表觀遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)機(jī)理研究的重點(diǎn)。我們的先期研究工作將從技術(shù)層面上探索單個(gè)和多個(gè)核小體，尤其是包括修飾后的組蛋白的核小體的高效重組途徑。二、預(yù)期目標(biāo)1、總體目標(biāo)本項(xiàng)目的總體目標(biāo)

6、是使我國(guó)在表觀遺傳學(xué)的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究水平躋身于國(guó)際先列。具體的目標(biāo)為：(1)通過(guò)不懈的努力在表觀遺傳學(xué)機(jī)理研究領(lǐng)域做出幾項(xiàng)有標(biāo)志性的工作。我們選擇的突破口為組蛋白修飾酶的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)和核小體的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，以及異染色質(zhì)(heterochromatin)的三維結(jié)構(gòu)研究。(2)在組蛋白修飾酶的催化機(jī)制和底物識(shí)別機(jī)理，以及修飾后的組蛋白的識(shí)別研究做作出廣泛的貢獻(xiàn)。(3)利用所獲取的與人類健康和疾病有重大關(guān)系的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息開展藥物設(shè)計(jì)研究。(4)通過(guò)本項(xiàng)研究建立起一只多學(xué)科相互合作的高水平表觀遺傳學(xué)研究隊(duì)伍，培養(yǎng)一批勇于探索、求是創(chuàng)新的年青研究人才。2、五年預(yù)期目標(biāo)我們期望完成10個(gè)以上在表觀

7、遺傳學(xué)里有重要作用的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能研究。力爭(zhēng)部分工作在高影響力的國(guó)際雜志(例如Nature,Science，Cell)上發(fā)表。建立起系統(tǒng)地表達(dá)組蛋白修飾酶以及在表觀遺傳學(xué)里有重要作用的蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、結(jié)晶和功能分析平臺(tái)。探索重組核小體以及包括修飾后組蛋白的核小體的有效途徑，為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)-核小體相互作用開創(chuàng)局面。從已知化合物文庫(kù)中篩選出24個(gè)對(duì)HDAC活性有抑制作用的小分子化合物；用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，合成，得到一組結(jié)構(gòu)全新的、針對(duì)HDAC小分子抑制劑；并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化。為深入開展多學(xué)科合作、高復(fù)雜性的表觀遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)機(jī)理研究打下深厚的基礎(chǔ)。三、研究方案1、總體研究思路

8、本課題選擇在表觀遺傳調(diào)控過(guò)程中具有重要生物學(xué)意義、與重大疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的蛋白體系為研究對(duì)象，特別是對(duì)一系列組蛋白修飾酶和與其相互作用的調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究。我們將運(yùn)用現(xiàn)有的各種基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)和純化技術(shù)獲取大量蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物的樣品；運(yùn)用X-射線晶體衍射法和溶液NMR方法測(cè)定它們的晶體結(jié)構(gòu)或溶液動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析揭示組蛋白修飾酶的活性中心組份和結(jié)構(gòu)、底物和產(chǎn)物特異性的決定因素、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)、作用的方式、以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系；我們將用化學(xué)生物學(xué)的方法合成有活性的修飾后的組蛋白將其作為組蛋白去甲基化和去乙酰化酶的底物，用來(lái)制備修飾過(guò)的核小體和提供表觀遺傳細(xì)胞生物學(xué)

9、研究的新手段；冷凍電鏡的手段來(lái)研究表觀遺傳中的大復(fù)合體和染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)；結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)和藥物化學(xué)的方法進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)和篩選。同時(shí)，我們也將運(yùn)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物信息學(xué)等方法對(duì)于組蛋白修飾酶和相關(guān)的復(fù)合物進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)信息的功能研究，這包括利用模式生物C.elegans的研究平臺(tái)探索組蛋白的表觀遺傳修飾在個(gè)體發(fā)育，尤其是C.elegans壽命，性腺發(fā)育和生殖發(fā)育中的調(diào)控作用。2、技術(shù)路線本課題主要運(yùn)用同生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和其它生物物理等方法, 針對(duì)一些參與組蛋白修飾過(guò)程并具有重要生物學(xué)意義與重大疾病相關(guān)的蛋白和蛋

10、白復(fù)合物，開展功能、結(jié)構(gòu)、相互作用關(guān)系、分子作用機(jī)制、以及臨床應(yīng)用可能性的研究。主要研究方法和技術(shù)路線概述如下：（1）可溶性蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品的制備為獲得可用于結(jié)構(gòu)和功能研究的大量可溶性蛋白質(zhì)，我們將首先在大腸桿菌體系中構(gòu)建和表達(dá)目標(biāo)蛋白。同時(shí)，對(duì)一些溶解性差、表達(dá)量低的蛋白質(zhì)，我們將嘗試其它的原核和真核表達(dá)載體和系統(tǒng)（包括酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞），表達(dá)不同標(biāo)簽的融合蛋白以及無(wú)細(xì)胞體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)等進(jìn)行表達(dá)條件的摸索。一旦表達(dá)成功，我們將嘗試不同的蛋白質(zhì)分離和純化方法（包括親和柱層析、離子交換柱層析、疏水柱層析和分子篩柱層析），以期獲得具有活性、且適合于結(jié)構(gòu)和功能研究的蛋白質(zhì)。對(duì)功

11、能特別重要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，如有必要，我們將根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)表面上一些氨基酸進(jìn)行突變和修飾，以增加蛋白質(zhì)的可溶性和穩(wěn)定性。為獲得穩(wěn)定的、均一組分的蛋白質(zhì)復(fù)合物，我們將嘗試不同的原核和真核表達(dá)系統(tǒng)和載體（包括共表達(dá)）、不同的分離和純化方法，并通過(guò)酵母雙雜交、體外Pull-down和共沉淀加以驗(yàn)證，以獲得具有活性、且適合于結(jié)構(gòu)和功能研究的穩(wěn)定蛋白質(zhì)復(fù)合物。另外，我們將運(yùn)用生物信息學(xué)方法構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用的模型，并根據(jù)相互作用方式對(duì)蛋白質(zhì)表面上一些氨基酸進(jìn)行突變和修飾，以增加蛋白-蛋白之間的相互作用能力，有利于蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。此外，運(yùn)用最新發(fā)表的以相圖為基礎(chǔ)的生物

12、大分子“可結(jié)晶性”的新概念提高蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的成功率。為保證實(shí)驗(yàn)的成功，我們將同時(shí)開展對(duì)一些具有重要功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的克隆、表達(dá)和純化的工作，由于目前對(duì)這些含有多結(jié)構(gòu)域的大真核蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的劃定尚不明確，我們將運(yùn)用生物信息學(xué)的方法來(lái)幫助進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，并通過(guò)系統(tǒng)的片段缺失和點(diǎn)突變篩選，尋找具有合適大小和功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究。（2）穩(wěn)定蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)解析一旦獲得可供結(jié)構(gòu)研究的蛋白質(zhì)和穩(wěn)定蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品，我們將運(yùn)用動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)蛋白樣品的溶液狀態(tài)進(jìn)行分析，考察其是否處于均一狀態(tài)，在不同條件（溫度、濃度、pH等）下的穩(wěn)定形態(tài)和凝聚狀態(tài)，同時(shí)運(yùn)用溶液光譜（包括

13、CD光譜和熒光光譜）方法分析蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象變化。綜合各種因素，初步確定適合于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)的條件。然后，進(jìn)一步摸索晶體生長(zhǎng)的條件，嘗試大量不同的沉淀劑、蛋白質(zhì)濃度、pH和緩沖體系、以及不同添加劑等，得到高衍射質(zhì)量的晶體用于X-射線衍射分析。一旦獲得蛋白晶體，將利用X-射線衍射儀進(jìn)行初步衍射實(shí)驗(yàn)，以幫助進(jìn)行結(jié)晶條件的優(yōu)化和低溫冷凍條件的篩選。具有高衍射能力的蛋白晶體將運(yùn)用國(guó)內(nèi)外同步輻射光源進(jìn)行高分辨率的X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集。并運(yùn)用單波長(zhǎng)反常散射法、多波長(zhǎng)反常散射法、同晶置換法、和分子置換法解析各種蛋白和蛋白復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)。(3) 蛋白動(dòng)態(tài)復(fù)合物相互作用介面的結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)研究溶液NMR技術(shù)

14、是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的很有用的工具。根據(jù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)度，可選擇相應(yīng)的NMR技術(shù)來(lái)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，如化學(xué)位移擾動(dòng)法、分子間轉(zhuǎn)移NOE(TRNOE)、酰胺質(zhì)子交換率擾動(dòng)法、橫向或縱向弛豫速率擾動(dòng)法、線寬變化、分子間飽和轉(zhuǎn)移、分子間NOE等，以及各種各樣的濾波或半濾波技術(shù)（ filter or half-filter）。細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)之間存在著很弱的相互作用（解離常數(shù)Kd > 10-6 M），只能形成低親和力的、瞬時(shí)復(fù)合物，但這些瞬時(shí)復(fù)合物在細(xì)胞活動(dòng)的分子調(diào)控中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用。我們將選擇分子量合適的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合

15、物，運(yùn)用異核多維NMR技術(shù)，在接近生理?xiàng)l件的溶液狀態(tài)下，研究這些蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，特別是低親和力的、瞬時(shí)蛋白質(zhì)復(fù)合物的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制，探測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)是否發(fā)生相互作用及其親和力（Kd）、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的結(jié)合界面等。通過(guò)測(cè)定分子間的NOE確定蛋白質(zhì)分子之間的距離約束，在稀釋的定向介質(zhì)中,如磷脂雙層混合膠粒（Bicelle bicelle）, 聚丙烯酰胺凝膠（Polyacrylamide gel）, 纖維狀病毒（Filamentous viruses）等, 測(cè)定殘留的偶極耦合常數(shù)(residual dipolar couplings)以確定蛋白質(zhì)分子之間的相

16、對(duì)取向，從而獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用往往會(huì)引起蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的改變。NMR技術(shù)被廣泛地用來(lái)揭示蛋白質(zhì)分子和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的動(dòng)力學(xué)特征。我們將利用異核多維NMR弛豫測(cè)量實(shí)驗(yàn)，研究皮秒-納秒時(shí)間尺度的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的柔性與運(yùn)動(dòng)性，以及微秒-毫秒時(shí)間尺度的構(gòu)象交換。通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件（如實(shí)驗(yàn)溫度、蛋白質(zhì)濃度、pH值、配基類型等），研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程的熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)和分子作用機(jī)理。（4）大復(fù)合體的冷凍電鏡研究冷凍電鏡方法結(jié)合三維重構(gòu)是近年來(lái)發(fā)展迅速并正在取得重要突破的技術(shù)。和其它方法相比，它具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：1.保持生物樣品的活性和功能狀態(tài)；2.

17、無(wú)須制備晶體，特別適合難于結(jié)晶的大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)判定；3.可以做到制樣，數(shù)據(jù)收集，三維重構(gòu)全過(guò)程自動(dòng)化，為高通量的大分子及其復(fù)合物的快速三維結(jié)構(gòu)解析打下基礎(chǔ)。同時(shí)，隨著設(shè)備的改進(jìn)和技術(shù)的提高，電鏡三維重構(gòu)的分辨率也迅速提高?，F(xiàn)在最高精度已經(jīng)達(dá)到約4A左右。我們將用冷凍電鏡方法來(lái)研究蛋白質(zhì)復(fù)合體里各亞基之間的空間關(guān)系、蛋白質(zhì)復(fù)合體與核小體的相互作用、染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)和不同活性狀態(tài)下的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化及染色質(zhì)變化動(dòng)力學(xué)。（5）組蛋白修飾酶活性測(cè)定和蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能分析我們將利用成熟的甲基化去甲基化酶、乙酰去乙酰化酶、泛素化連接酶/去泛素化酶、激酶等酶活性測(cè)定方法來(lái)鑒定和比較野生

18、型和突變型的酶活性差別、以及單體和復(fù)合體中的酶活性差異。以下方法將用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和尋找與已知功能蛋白質(zhì)相互作用的蛋白和蛋白復(fù)合物： 表面等離子共振（SPR)；酵母雙雜交（two-hybrid）系統(tǒng)、體外Pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）、二維電泳、TAP和質(zhì)譜等功能蛋白質(zhì)組學(xué)的方法。我們將通過(guò)對(duì)蛋白和蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的分析，找出在蛋白的生物功能和蛋白-蛋白相互作用中發(fā)揮重要作用的氨基酸，運(yùn)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和其它生物學(xué)和生物物理學(xué)方法加以驗(yàn)證；闡述蛋白生物功能的分子基礎(chǔ)和作用機(jī)理；在細(xì)胞水平上驗(yàn)證我們的假設(shè)和理論，并且構(gòu)建相應(yīng)的基因缺失或基

19、因轉(zhuǎn)染的模式生物，篩選不同表型，建立重要蛋白的功能與疾病的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系。（6） 體內(nèi)合成有活性的含共價(jià)修飾的組蛋白的化學(xué)生物學(xué)方法具體的做法是修改大腸桿菌或其它細(xì)胞內(nèi)的遺傳密碼，使得無(wú)義的“UAG”密碼對(duì)應(yīng)于感興趣的非天然氨基酸。篩選對(duì)非天然氨基酸具有特異性的氨酰-tRNA合成酶的技術(shù)路線如下：首先在目標(biāo)細(xì)胞中引入一個(gè)外源的氨酰-tRNA合成酶 和tRNACUA, 在目標(biāo)細(xì)胞中外源的氨酰-tRNA合成酶和tRNACUA保持活性，但不與內(nèi)源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA反應(yīng)，這個(gè)條件稱為生物正交性。之后還要改變氨酰-tRNA合成酶的專一性,使其只催化tRNACUA與非天然氨基酸發(fā)生氨酰化反

20、應(yīng)。采取的方法:一是將 氨酰-tRNA合成酶 活性部位5-6個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行PCR隨機(jī)突變建立氨酰-tRNA合成酶突變庫(kù)。然后對(duì)氨酰-tRNA合成酶突變庫(kù)使用正負(fù)雙向選擇法：正選擇得到對(duì)天然氨基酸或非天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶，主要是通過(guò)構(gòu)建一個(gè)含有UAG密碼子的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，如果無(wú)氨酰-tRNA合成酶活性，則細(xì)胞無(wú)法表達(dá)全長(zhǎng)的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶而無(wú)法存活。負(fù)選擇剔除掉對(duì)天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶，識(shí)別內(nèi)源的天然氨基酸的質(zhì)粒編碼一種細(xì)胞內(nèi)毒素而死亡。 最終得到只對(duì)非天然氨基酸有專一性的氨酰-tRNA合成酶。凝膠電泳和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證最終將非天然氨基酸通過(guò)特殊密碼子UAG添

21、加到蛋白質(zhì)鏈中。 （7）基于表觀遺傳調(diào)控的藥物開發(fā)前期工作我們將用四種途徑初步篩選出一系列的候選小分子：1）基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)虛擬篩選；2）基于化學(xué)小分子文庫(kù)的高通量藥物篩選；3）基于靶蛋白結(jié)構(gòu)，合理設(shè)計(jì)針對(duì)性強(qiáng)的、結(jié)構(gòu)新穎的小分子抑制劑；4）對(duì)于已知的小分子抑制劑做結(jié)構(gòu)和性能改良。以下是以去乙酰化酶HDAC8為例的幾種篩選途徑的典型步驟：a）基于靶蛋白HDAC8的結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)對(duì)已知活性部位和結(jié)構(gòu)表面的分析，得到幾個(gè)潛在的小分子結(jié)合位點(diǎn)；b）選定一個(gè)規(guī)模合適的小分子結(jié)構(gòu)庫(kù)，將庫(kù)中的每個(gè)小分子和幾個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行快速的對(duì)接，初步篩選出一系列的候選小分子；c）對(duì)這一系列的候選小分子，進(jìn)行

22、較精細(xì)的分子對(duì)接，將候選小分子規(guī)模縮小到實(shí)驗(yàn)容許的水平；d)然后檢驗(yàn)候選小分子是否有生物學(xué)活性（具體見課題六研究?jī)?nèi)容）；基于化學(xué)小分子文庫(kù)的藥物篩選我們將使用具有一定規(guī)模的化合物文庫(kù)進(jìn)行高通量的HDAC抑制劑篩選。中山大學(xué)正在建設(shè)一個(gè)約有6萬(wàn)個(gè)小分子化合物的文庫(kù)可供使用。中科院藥物研究所也具有一個(gè)規(guī)?？捎^的小分子化合物的文庫(kù)。中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的丁克教授愿意提供一個(gè)小規(guī)模的小分子化合物的文庫(kù)（約6000個(gè)化合物）。對(duì)候選小分子化合物的生物學(xué)活性再進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè) （具體見課題六研究?jī)?nèi)容）；基于靶蛋白結(jié)構(gòu)，合理設(shè)計(jì)、合成針對(duì)HDAC8的結(jié)構(gòu)新穎的小分子抑制劑a）對(duì)篩選得到的先導(dǎo)化合物，通

23、過(guò)分子疊合等方法構(gòu)建出小分子的三維藥效團(tuán)；b）通過(guò)計(jì)算模擬的方法揭示小分子結(jié)合部位和三維藥效團(tuán)之間相互作用的分子機(jī)制；c）根據(jù)靶蛋白結(jié)合部位和三維藥效團(tuán)之間的作用模型設(shè)計(jì)出更合理有效的小分子抑制劑。d)根據(jù)上述設(shè)計(jì)，利用組合化學(xué)方法合成化合物；e) 對(duì)所合成的小分子化合物的生物學(xué)活性再進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)（具體見課題六研究?jī)?nèi)容）；通過(guò)對(duì)SAHA等HDAC潛在廣譜類抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到起專一性抑制作用的小分子a）建立SAHA或其他的HDAC廣譜類抑制劑和HDAC8的相互作用的可能的分子模型；b）從分子模型出發(fā)，修改廣譜類抑制劑的藥效基團(tuán)，通過(guò)自由能計(jì)算等方式提高小分子的結(jié)合專一性；c）對(duì)設(shè)計(jì)的結(jié)果通

24、過(guò)對(duì)組蛋白乙酰化測(cè)定觀察這些化合物對(duì)HDAC的抑制效應(yīng)，迭代這一過(guò)程，逐步保留對(duì)HDAC8特異性升高，對(duì)其他組蛋白去乙酰化酶特異性減弱的操作。3、 項(xiàng)目創(chuàng)新點(diǎn)本項(xiàng)目的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)在于瞄準(zhǔn)表觀遺傳學(xué)的分子機(jī)理這個(gè)重大前沿科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行系統(tǒng)性、系列性、多層次、多方面的研究。本項(xiàng)研究對(duì)象包括了所有常見的組蛋白修飾酶；研究對(duì)象的復(fù)雜性包括了從單個(gè)蛋白質(zhì)或其中的結(jié)構(gòu)域到多蛋白復(fù)合體以及蛋白質(zhì)復(fù)合體與核小體的結(jié)合；研究的手段包括X光晶體學(xué)、核磁共振、冷凍電鏡等主流結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究手段，以及生物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、藥學(xué)等方法。研究目標(biāo)從搞清楚組蛋白的賴氨酸上加一個(gè)還是三個(gè)甲基到組蛋白修飾對(duì)于損傷

25、應(yīng)答和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控的影響以及抗癌藥物的開發(fā)。我們相信，這樣的課題選擇和科研力量的凝聚是開展原始創(chuàng)新的基礎(chǔ)研究的一大特色，也是促進(jìn)有自主產(chǎn)權(quán)的藥物開發(fā)的動(dòng)力。4、取得重大突破的可行性分析我們對(duì)于本項(xiàng)研究取得突破性進(jìn)展充滿信心，原因是：1）本項(xiàng)目有一支在表觀遺傳結(jié)構(gòu)機(jī)理研究有深厚基礎(chǔ)的充滿活力的年青研究隊(duì)伍。這支隊(duì)伍已在組蛋白甲基化酶、去甲基化酶、去乙?；傅慕Y(jié)構(gòu)里已取得了國(guó)際領(lǐng)先的成績(jī)。本支隊(duì)伍的成員也在化學(xué)生物學(xué)里開拓了一個(gè)應(yīng)用廣泛的原創(chuàng)性領(lǐng)域、在利用冷凍電鏡進(jìn)行高精度結(jié)構(gòu)解析方面作出的舉世矚目的貢獻(xiàn)、在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和在腫瘤的靶向治療和藥理研究的一系列先進(jìn)工作。這些成績(jī)和研究經(jīng)驗(yàn)

26、是本項(xiàng)目成功的基礎(chǔ)。2）本項(xiàng)目的課題選擇瞄準(zhǔn)了表觀遺傳學(xué)這個(gè)重大科學(xué)問(wèn)題的前沿。同時(shí)，這些課題也是切實(shí)可行的。每個(gè)課題組都已在相關(guān)的領(lǐng)域有深厚的積累和基礎(chǔ)。有相當(dāng)多的蛋白已經(jīng)表達(dá)成功，而且個(gè)別蛋白質(zhì)晶體已經(jīng)得到。3）本項(xiàng)目的幾個(gè)課題組具有互補(bǔ)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。這對(duì)于合作研究和攻關(guān)一些技術(shù)難度高、科學(xué)意義重大的課題，例如高分辨率的染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，將有不可取代的優(yōu)勢(shì)。5、課題設(shè)置本項(xiàng)目的主題內(nèi)容是綜合結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段、其它生物物理和生物化學(xué)方法來(lái)揭示表觀遺傳學(xué)的一些重要機(jī)理。本項(xiàng)目的六個(gè)課題利用X光晶體學(xué)、核磁共振、冷凍電鏡等主流結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究手段，以及生物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、藥學(xué)等方法

27、從多方面、多層次來(lái)探尋表觀遺傳學(xué)的分子機(jī)理。具體的課題設(shè)置見下：課題一、幾種主要組蛋白修飾(甲基化/去甲基化,乙?；?去乙?；?的催化機(jī)制和調(diào)控的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究組蛋白修飾酶的結(jié)構(gòu)和功能研究是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，也是國(guó)際上近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。本課題的研究目的是從原子分辨率的尺度上來(lái)揭示在表觀遺傳中至關(guān)重要的幾類常見組蛋白修飾酶(包括甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙?；?的催化機(jī)制、底物特異性和酶活性調(diào)控機(jī)理。本課題研究的結(jié)果將有助于提高對(duì)于表觀遺傳這一重要生命現(xiàn)象的理解，為以干預(yù)表觀遺傳系統(tǒng)為目標(biāo)的藥物研發(fā)提供結(jié)構(gòu)信息。這項(xiàng)研究也將為我們的長(zhǎng)期目標(biāo)，也就是揭示染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及其

28、從11納米核小體串結(jié)構(gòu)到高級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)理，打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容：一、組蛋白甲基化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) （1）組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物和底物特異性。有些甲基轉(zhuǎn)移酶可以做單甲基化，而另一些酶可進(jìn)行多甲基化。不同狀態(tài)的組蛋白甲基化在細(xì)胞里起到的表觀遺傳調(diào)控作用效果大不相同。已有一些研究證明有些酶的活性中心的大小的細(xì)微變化，例如一個(gè)苯丙氨酸與酪氨酸的區(qū)別，就能影響到甲基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)物特異性。但是在體內(nèi)不同狀態(tài)的甲基化是由不同的甲基轉(zhuǎn)移酶或者由不同組份的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體完成的。本課題將著重研究H3K4和H4K20的多甲基化分子機(jī)理。我們選擇這兩個(gè)位點(diǎn)的多甲基化機(jī)理研究的一個(gè)原因是它們的單甲基化酶，Set7/

29、Set9和Set8的三維結(jié)構(gòu)已被解析，而它們的多甲基化酶PRDM7/PRDM9和Suv4-20的結(jié)構(gòu)信息還一無(wú)所知。我們將結(jié)合X光晶體學(xué)和生物化學(xué)的手段來(lái)揭示這兩個(gè)多甲基化酶的分子機(jī)理，包括活性中心組份和結(jié)構(gòu)、以及產(chǎn)物特異性決定因素。比較單和多甲基化酶的活性中心結(jié)構(gòu)差異，并利用這些差異來(lái)設(shè)計(jì)能區(qū)分單和多甲基化酶的小分子抑制劑，這將是一件十分有意義的表觀遺傳學(xué)的生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。組蛋白甲基化酶和去甲基化酶具有高度的底物特異性，而目前只有一部份的甲基化酶和極少數(shù)的去甲基化酶與其底物結(jié)合的特異性得到了闡明。在以上的PRDM7/9和Suv4-20的結(jié)構(gòu)研究中，我們還將利用所得到的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行定點(diǎn)突變

30、和共結(jié)晶研究，目的是揭示這些酶的底物特異性的決定因素。另外有一類組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶不識(shí)別孤立的短肽片段而需要整個(gè)核小體作為底物，已知的例子包括H3K27，H3K36和H3K79的甲基轉(zhuǎn)移酶。蛋白質(zhì)與核小體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究難度較大，而且在國(guó)際上還研究得很少。這也是我們希望作為領(lǐng)先國(guó)際研究水平的一個(gè)突破口。所以，本子課題的一項(xiàng)內(nèi)容就是開展核小體的制備工作并用之于與組蛋白質(zhì)修飾酶或其它蛋白的共結(jié)晶。（2）組蛋白甲基化酶的調(diào)節(jié)組蛋白修飾酶的活性調(diào)控機(jī)理結(jié)構(gòu)研究在國(guó)際上還是空白，填補(bǔ)這項(xiàng)空白、促進(jìn)這方面的研究壯大發(fā)展是本項(xiàng)研究的一個(gè)重要目標(biāo)。有的組蛋白修飾酶在單體時(shí)不具有活性或者只有很弱的活性，而與其它蛋

31、白結(jié)合后其酶活性就被激活了或者大大提高了。這種酶活性調(diào)控機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)表觀遺傳調(diào)控的一種體現(xiàn)，具體的例子包括：大部分組蛋白去乙?；福鏗ADC1-3與含WD40 repeat和SANT結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的相互作用，SIR2與SIR4的相互作用等；一部分乙酰轉(zhuǎn)移酶，例如酵母中的Hat1與Hat2以及 Sas2與Sas4-Sas5的相互作用；本子課題集中研究一部分重要甲基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控，而且這研究思路也貫穿到后面的對(duì)組蛋白去甲基化酶和乙?；?去乙?；傅难芯?。我們選擇MLL復(fù)合體作為對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控研究的標(biāo)本。MLL復(fù)合體的中心組份包括MLL，WDR5，RBBP5和ASH2L。其中MLL是H3K4的催化

32、亞基，但它單體并沒(méi)有活性。MLL與WDR5和RBBP5結(jié)合后的復(fù)合體具有H3K4雙甲基化的活性，而再與ASH2L結(jié)合后就能使H3K4三甲基化。我們的目標(biāo)是尋找以下兩個(gè)重要問(wèn)題的答案：1) WDR5和RBBP5的結(jié)合是如何激活MLL的酶活性的？2)ASH2L是怎樣使MLL復(fù)合體作H3K4三甲基化的？由于MLL在許多白血病發(fā)生中有很大的作用，而且是在真核細(xì)胞進(jìn)化過(guò)程中保守的Trithorax蛋白的代表，其結(jié)構(gòu)機(jī)理的研究具有深刻的科學(xué)意義和可觀的應(yīng)用前景。二、組蛋白去甲基化的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究組蛋白去甲基化酶是否存在曾經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間困擾著表觀遺傳研究?，F(xiàn)在已知的去甲基化酶包括LSD1和一大批含JMJC結(jié)構(gòu)域的蛋

33、白質(zhì)。組蛋白去甲基化酶的結(jié)構(gòu)研究才剛剛起步，目前已知結(jié)構(gòu)的組蛋白去甲基化酶僅有LSD1和JMJC家族中的JMJD2A和JHDM1。還有很多的去甲基化酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理有待解析。本課題的主要研究?jī)?nèi)容是以蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)方法為主要研究手段，結(jié)合其它生物物理和生物化學(xué)方法，深入研究組蛋白去甲基化酶的結(jié)構(gòu)及其復(fù)合物：(1) 組蛋白去甲基化酶的催化核心結(jié)構(gòu)以及與甲基化多肽的復(fù)合物結(jié)構(gòu)組蛋白去甲基化酶的結(jié)構(gòu)研究才剛剛開始，還有許多非常重要的問(wèn)題并不清楚，很多組蛋白去甲基化酶的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理還有待解析；到目前為止，去甲基化酶識(shí)別其對(duì)應(yīng)的賴氨酸的機(jī)理還不太清楚。除了已經(jīng)解出結(jié)構(gòu)的組蛋白去甲基化酶外，我們準(zhǔn)備

34、接著研究其它幾類組蛋白去甲基化酶具有酶活性的核心結(jié)構(gòu)，如JHDM2、SMCX和JMJD3家族等。我們將著重研究H3K4、H3K36、H3K27和H3K79去甲基化酶結(jié)構(gòu)和復(fù)合物結(jié)構(gòu)。通過(guò)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究組蛋白去甲基化酶的催化反應(yīng)機(jī)理和底物特異性。(2) 組蛋白去甲基化酶與蛋白質(zhì)的相互作用大部分組蛋白去甲基化酶，都能與一些蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，如LSD1，JHDM2、JMJD2家族蛋白可與雄性激素受體形成復(fù)合物。它們?cè)诩膊〉漠a(chǎn)生中起著重要的作用。有些組蛋白去甲基化酶，如LSD1，單獨(dú)就具有酶活性；而與其它蛋白質(zhì)如雄性激素受體形成復(fù)合體后酶活性發(fā)生改變。還有一種情況就是復(fù)合體的形成可大大地提高了酶活性

35、。組蛋白修飾酶復(fù)合體里亞基之間的相互作用是怎樣激活或者提高組蛋白修飾酶的活性的結(jié)構(gòu)機(jī)理研究在國(guó)際上到目前為止還是空白，這也是本項(xiàng)研究的重點(diǎn)。我們也將與本項(xiàng)目的其它課題組合作，開展基于組蛋白去甲基化酶結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)工作。很多組蛋白去甲基化酶在重要疾病如癌癥等的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用，如KDM5B去甲基化酶在乳腺癌，KDM4在食管癌、胃癌和前列腺癌等重大疾病中都有關(guān)鍵的作用。我們將利用本課題所得到的結(jié)構(gòu)信息結(jié)合計(jì)算生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)的方法進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)、抑制劑的尋找等初期研究。三、組蛋白乙酰化/去乙?；笍?fù)合物的結(jié)構(gòu)研究組蛋白乙?；?去乙?；揎検怯啥鄠€(gè)蛋白組成的組蛋白乙?；笍?fù)合物作用于組蛋白上的賴

36、氨酸來(lái)完成的。多個(gè)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化亞基的結(jié)構(gòu)已得到解析，所以本課題將聚焦在復(fù)合體里蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)和功能研究。我們選擇三個(gè)有不同結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的復(fù)合物，包括Hat1-Hat2雙聚體，Sas2-Sas4-Sas5三聚體和多組份的NuA4，作為我們的切入點(diǎn)進(jìn)行這方面的研究。在Hat1-Hat2雙聚體里，已知三維結(jié)構(gòu)的Hat1是催化亞基。Hat2是一個(gè)WD40-repeat蛋白。它與Hat1的結(jié)合使得復(fù)合體的酶活性比Hat1單體的活性提高上千倍，而其中的結(jié)構(gòu)機(jī)理一無(wú)所知。這也是本課題研究期望回答的問(wèn)題。其次，Sas2是Sas2-Sas4-Sas5復(fù)合體中的催化亞基。它與Sas4的結(jié)合是

37、整個(gè)復(fù)合物酶活性的先決條件，而Sas5的加入極大地提高了這個(gè)乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的酶活性。研究這三個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)于這個(gè)復(fù)合物的酶活性的影響是本課題研究的另一項(xiàng)內(nèi)容。組蛋白乙?；诩せ罨虮磉_(dá)中的作用與以ATP為燃料的核小體重構(gòu)復(fù)合體(Nucleosome Remodeling Complex)的作用是分不開的，但人們對(duì)于這兩個(gè)過(guò)程是如何緊密的耦合在一起的理解還極其有限。本課題重點(diǎn)以組蛋白乙?；福℉AT）復(fù)合物NuA4以及核小體重構(gòu)復(fù)合物SWR1共享的Yaf9p和Swc4p為主要研究對(duì)象，開展對(duì)組蛋白修飾與染色體重構(gòu)在基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)系的結(jié)構(gòu)機(jī)理探討。NuA4是一個(gè)較為重要的乙?；笍?fù)

38、合體，其主要組份為Act1p, Arp4p, Eaf3p, Eaf5p, Eaf6p, Eaf7p, Epl1p, Esa1p, Swc4p,Tra1p,Vid21p,Yaf9p,Yng2p等蛋白質(zhì)。NuA4 HAT復(fù)合物能在生物體內(nèi)催化組蛋白H4第5位，第8位，第12位，第16位賴氨酸的乙?；磻?yīng)，并且進(jìn)一步的研究表明：組蛋白H4上述位點(diǎn)的乙?；嚢彼釋?duì)特定基因具有轉(zhuǎn)錄激活作用。在該復(fù)合物眾多的蛋白質(zhì)組分當(dāng)中，僅Esa1p具有組蛋白乙?；傅拇呋钚?，其余的蛋白質(zhì)組分在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)為該乙?；笍?fù)合體發(fā)揮生物學(xué)活性所必須。此外，Yaf9p以及Swc4p同時(shí)還存在于核小體重構(gòu)復(fù)合物SWR1當(dāng)中

39、。SWR1復(fù)合體在基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中催化組蛋白H2A與組蛋白類似物H2A.Z在細(xì)胞核內(nèi)的置換反應(yīng)，使其形成含有特殊核小體的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而維持基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄的水平。對(duì)于Yaf9p以及Swc4p是如何協(xié)調(diào)兩種具有不同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)復(fù)合體在復(fù)雜生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物學(xué)反應(yīng)的時(shí)間空間順序的結(jié)構(gòu)機(jī)理的探討是本課題研究的另一項(xiàng)內(nèi)容。有意思的是，該復(fù)合物中的Yaf9蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)根據(jù)預(yù)測(cè)為一種全新的折疊類型。搞清楚這一種折疊類型的蛋白質(zhì)是否在基因表達(dá)和調(diào)控中有類似的功能也是非常有意義的。主要目標(biāo)本課題的預(yù)期目標(biāo)是在以上的每個(gè)方向里做出有代表性的結(jié)構(gòu)工作，并且利用所得到的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行深入的生的化和體內(nèi)功能研究。我們

40、總體上期望解析5個(gè)以上新組蛋白修飾酶復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并利用所得到的結(jié)構(gòu)信息對(duì)這些組蛋白修飾酶進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。所得到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也將用于小分子干擾劑的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)。由于H3K79，H3K27，H3K36，H4K20甲基轉(zhuǎn)移酶hDot1，EZH2，Set2和Suv4-20的底物是核小體，所以我們也將開展核小體的制備和與核小體結(jié)合的復(fù)合體的研究。 承擔(dān)單位中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人許瑞明主要學(xué)術(shù)骨干陳忠周、吳瑋、趙武玲、許航、曾宗浩經(jīng)費(fèi)比例28%課題二、組蛋白泛素化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 組蛋白泛素化連接酶和去泛素化酶在DNA損傷修復(fù)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要的作用，也

41、是國(guó)際上表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。但是目前國(guó)際上還沒(méi)有人開展專門對(duì)組蛋白的泛素化連接酶、去泛素化酶及其與調(diào)控蛋白質(zhì)的單體和復(fù)合物結(jié)構(gòu)測(cè)定以及基于結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)理研究。組蛋白的泛素化在DNA的輻射損傷和斷裂損傷信號(hào)途徑中起著重要的作用，DNA受到紫外照射后會(huì)發(fā)生膠連反應(yīng)，在DNA產(chǎn)生紫外照射損傷后，組蛋白H3、H4的泛素化連接酶DDBCUL4ROC1能使組蛋白H3、H4泛素化，使DNA與組蛋白分離，因此其它DNA損傷修復(fù)蛋白能與DNA結(jié)合，行使修復(fù)功能。而當(dāng)DNA產(chǎn)生斷裂損傷后，組蛋白H2AX的泛素化連接酶RNF8-UBC13能使其泛素化，然后招募其它的DNA損傷修復(fù)因子如53BP1、BRCA1、

42、Rap80到斷裂位點(diǎn)，行使修復(fù)功能。組蛋白泛素化連接酶復(fù)合物DDB1CUL4ROC1和RNF8UBC13在不同的DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，測(cè)定這些組蛋白泛素化連接酶的單體和復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，對(duì)于了解這些組蛋白泛素化連接酶復(fù)合物的分子組裝機(jī)制，復(fù)合物中各個(gè)亞基間的相互調(diào)控作用機(jī)理，以及其在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)理有重要的意義。組蛋白去泛素化酶在基因轉(zhuǎn)錄的激活、沉默以及mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中功能研究較多的是酵母組蛋白去泛素化酶UBP8和UBP10，而酵母作為一種模式生物，研究其蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于研究此類蛋白在其他真核生物中的作用有著指導(dǎo)意義。UBP10能使

43、端粒區(qū)的組蛋白H2B去泛素化，抑制端粒區(qū)基因的表達(dá)。除了使端粒區(qū)的基因沉默外，UBP10也能調(diào)控其它區(qū)域的基因表達(dá)。UBP8能使轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的H2B去泛素化，激活基因轉(zhuǎn)錄。UBP8還能通過(guò)sgf11以及sus1與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相聯(lián)系，調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。目前mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)與表觀遺傳修飾調(diào)控蛋白復(fù)合物之間的聯(lián)系機(jī)制還不清楚。測(cè)定這些組蛋白去泛素化酶及其與調(diào)控蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，對(duì)于深入理解組蛋白去泛素化酶在基因轉(zhuǎn)錄和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理有著指導(dǎo)意義。主要研究?jī)?nèi)容：（1）在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中起重要作用組蛋白泛素化連接酶及其調(diào)控蛋白單體的結(jié)構(gòu)和功能研究DNA損傷修復(fù)與衰老、腫瘤發(fā)生、輻射效應(yīng)

44、等都有密切的關(guān)系。人類遺傳性疾病已發(fā)現(xiàn)4000多種，其中不少與DNA修復(fù)缺陷有關(guān)。DNA損傷速率大約是每個(gè)細(xì)胞每天50,000至500,000處分子損害，如果一些關(guān)鍵的癌基因受到未修復(fù)的損傷將給機(jī)體帶來(lái)災(zāi)難性的后果，因此DNA損傷一直以來(lái)也是癌癥研究的一個(gè)重要方面。雖然這方面的研究很多，但是對(duì)DNA損傷應(yīng)答的分子機(jī)制特別是對(duì)這些DNA損傷應(yīng)答途徑中調(diào)控蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)仍然所知甚少。組蛋白的泛素化在DNA的輻射損傷和斷裂損傷信號(hào)途徑中起著重要的作用，例如在受到紫外照射后，組蛋白H3、H4的泛素化連接酶DDB1CUL4ROC1能使H3、H4泛素化，使組蛋白和DNA間的分離，協(xié)助DNA修復(fù)蛋白

45、能結(jié)合到受損傷的DNA位點(diǎn)行使修復(fù)功能。CUL4ROC1的底物很多，例如組蛋白H3、H4、P53等，目前其底物特異性決定因素仍然是研究的熱點(diǎn)之一，有研究顯示含有一類WD40repeat motif的蛋白在CUL4ROC1的底物識(shí)別過(guò)程中起著重要作用，但是還沒(méi)有CUL4ROC1和此類蛋白的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這一類蛋白單體的結(jié)構(gòu)報(bào)導(dǎo)也很少，測(cè)定含有WD40repeat motif的蛋白單體的結(jié)構(gòu)以及DDBCUL4ROC1的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，能揭示DDBCUL4ROC1識(shí)別底物組蛋白H3、H4的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并為研究CUL4ROC1復(fù)合物底物特異性的決定因素奠定基礎(chǔ)。而組蛋白H2AX的泛素化參與雙鏈斷裂DNA修復(fù)信

46、號(hào)的傳導(dǎo)，雙鏈DNA斷裂后首先引起H2AX磷酸化，MDC1與磷酸化的H2AX結(jié)合后募集組蛋白泛素化連接酶復(fù)合物RNF8BC13，使H2AX泛素化后結(jié)合其他的DNA損傷修復(fù)因子如53BP1、BRCA1、Rap80等在斷裂位點(diǎn)行使修復(fù)功能。因此本課題的一個(gè)研究?jī)?nèi)容就是研究這些組蛋白泛素化連接酶及相關(guān)調(diào)控蛋白質(zhì)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)及其分子組裝機(jī)制，闡明其在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)理。在原子分辨率水平上為進(jìn)一步研究癌癥的發(fā)生機(jī)理和治療方法打下基礎(chǔ)。（2）在基因轉(zhuǎn)錄和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用的組蛋白去泛素化酶及其調(diào)控蛋白單體和復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究組蛋白去泛素化酶在基因轉(zhuǎn)錄的激活、沉默以及mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的

47、過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，例如酵母的組蛋白H2B去泛素化酶UBP10在基因的轉(zhuǎn)錄，端粒和核糖體DNA區(qū)域的基因沉默，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。UBP10能使端粒區(qū)的組蛋白H3保持去甲基化狀態(tài)，并且與端粒的沉默因子sir4結(jié)合，使sir4與其他的sir蛋白如sir2、sir3等結(jié)合形成沉默因子復(fù)合物，保持端粒區(qū)基因沉默。然而UBP10的調(diào)控作用并不局限于端粒區(qū)，在染色體的其他區(qū)域UBP10起作用的機(jī)理仍然所知甚少。組蛋白H2B泛素化水解酶UBP8通常存在于組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物SAGA中，通過(guò)sgf11、sus1和SAGA復(fù)合物的其余部分結(jié)合，UBP8的結(jié)合不影響SAG

48、A的乙?；D(zhuǎn)移酶活性。在轉(zhuǎn)錄起始后UBP8能和磷酸化的RNA聚合酶II的C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，水解基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的泛素化組蛋白H2B，激活基因轉(zhuǎn)錄延伸，調(diào)控SAGA依賴的基因轉(zhuǎn)錄。UBP8還能通過(guò)sgf11以及sus1與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)聯(lián)，影響mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，但是組蛋白去泛素化和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑聯(lián)系的分子機(jī)制還不清楚。本課題的另一個(gè)研究?jī)?nèi)容就是解析這些組蛋白去泛素化酶及其調(diào)控蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度闡明其在基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控機(jī)理，以及SAGA復(fù)合物中其它組分對(duì)UBP8功能的調(diào)控機(jī)制，揭示表觀遺傳修飾因子與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的相互作用機(jī)理。主要目標(biāo)測(cè)定組蛋白泛素化連接酶及其底物連接蛋白

49、如含有WD40repeat motif蛋白的三維結(jié)構(gòu)，闡述泛素化連接酶底物特異性的三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，揭示組蛋白泛素化連接酶及其調(diào)控蛋白在DNA損傷應(yīng)答途徑中的作用機(jī)制。測(cè)定組蛋白去泛素化酶UBP8、UBP10及其調(diào)控蛋白如sus1、sgf11的結(jié)構(gòu)，闡明組蛋白去泛素化酶調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)，揭示UBP8與乙酰基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物SAGA相互作用的機(jī)理，以及SAGA復(fù)合物中其它組分對(duì)UBP8的調(diào)控機(jī)制，闡明表觀遺傳修飾因子如組蛋白去乙?；窾BP8與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相互作用的機(jī)理。承擔(dān)單位中國(guó)科技大學(xué)，安徽大學(xué)課題負(fù)責(zé)人臧建業(yè)主要學(xué)術(shù)骨干張敏經(jīng)費(fèi)比例14%課題三、用高精度電鏡方法研究組蛋白修飾酶復(fù)

50、合體及染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)X射線晶體學(xué)、電鏡三維重構(gòu)、NMR和一些光譜學(xué)研究是結(jié)構(gòu)生物學(xué)中幾種重要而且相互補(bǔ)充的手段。本課題將主要利用冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)研究組蛋白修飾酶復(fù)合體和染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，輔以修飾酶的體內(nèi)功能分析，闡述表觀遺傳的調(diào)控機(jī)理。本課題的研究目的是（1）利用冷凍電鏡三維重構(gòu)對(duì)大分子及其復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析優(yōu)勢(shì)，從亞納米級(jí)的尺度上解析一些重要的組蛋白酶蛋白質(zhì)復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，以了解這些復(fù)合體形成的結(jié)構(gòu)及其對(duì)表觀遺傳的催化機(jī)制、底物特異性和酶活性調(diào)控機(jī)理；（2）利用冷凍電鏡技術(shù)開展高精度的染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)研究，以了解組蛋白酶和其它重要蛋白在染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的建立和維持中的作用；以及（3）以C.

51、elegans線蟲為模型，探索組蛋白的表觀遺傳修飾在C.elegans個(gè)體發(fā)育中的調(diào)控作用。本課題研究的結(jié)果將有助于為本項(xiàng)研究的長(zhǎng)期目標(biāo)，也就是揭示染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及其從11納米核小體串結(jié)構(gòu)到高級(jí)結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)理，打下前期基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容：（1）組蛋白酶蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)很多組蛋白修飾酶在體內(nèi)都是以復(fù)合體的形式存在，而且在很多情況下其酶活性和其它生物功能都與整個(gè)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。盡管光晶體學(xué)方法在分辨率方面有很大的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于大復(fù)合體則有很大的局限性：1）它需要大量的蛋白質(zhì)，而含多個(gè)或高分子量的蛋白質(zhì)復(fù)合體的高產(chǎn)表達(dá)是一種挑戰(zhàn)；2）結(jié)晶成功的可能性與復(fù)合體樣品的構(gòu)象、組份和寡聚均一性緊密關(guān)聯(lián)。

52、而冷凍電鏡方法不需結(jié)晶，所需蛋白量要少得多，而且復(fù)合體分子量越大（應(yīng)用范圍通常³500kDa)它的靈敏度越高。課題一里涉及的幾個(gè)組蛋白酶復(fù)合體，34甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（1a），327甲基轉(zhuǎn)移酶2復(fù)合體（0.5M Da), u4乙?；笍?fù)合體（1.3MDa），和很多其它的組蛋白修飾酶復(fù)合體，如1，1，in3等都是百萬(wàn)道耳頓以上的復(fù)合體。這些大分子及其復(fù)合物的大小正好處于cryoEM的合適研究范圍，所以對(duì)于它們的結(jié)構(gòu)解析，冷凍電鏡三維重構(gòu)有它自己獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。我們將主要利用電鏡單顆粒重建（single particle analysis）的方法研究這些大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。我們將緊密地

53、與第一課題組合作，將組成復(fù)合體的各個(gè)單元體（比如組蛋白酶或核小體）或者單元體的一部分的高精度的結(jié)構(gòu)嵌入得到的復(fù)合體結(jié)構(gòu)中，從而研究組成復(fù)合物的單體（如組蛋白酶，蛋白質(zhì)）之間的相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，了解這些單元的相互作用的分子機(jī)制及調(diào)控機(jī)理。同時(shí)，我們也將研究突變組蛋白修飾酶蛋白質(zhì)復(fù)合體和對(duì)應(yīng)的未突變組蛋白修飾酶蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)區(qū)別，從而通過(guò)對(duì)這些組蛋白修飾酶突變體的結(jié)構(gòu)變化了解它的活性調(diào)控機(jī)理。（2） 染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)；核小體，DNA的組裝及其對(duì)遺傳調(diào)控的影響。核小體是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)。最簡(jiǎn)單的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)就是一條DNA上的一連串核小體，也就是所謂的11納米染色質(zhì)纖維。更高一個(gè)層次的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)就

54、是30納米的染色質(zhì)纖維，它是由鄰近的核小體有序堆積而成的。目前對(duì)于染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的較為深入的認(rèn)識(shí)也只局限于到30納米纖維這個(gè)層次，而且對(duì)于其結(jié)構(gòu)模型、結(jié)構(gòu)的建立和維持機(jī)制的理解都還有相當(dāng)?shù)牟淮_定性。用電鏡三維重構(gòu)的方法研究染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)將是本課題的另外一個(gè)重要內(nèi)容。我們將用冷凍電鏡三維重構(gòu)的方法研究多個(gè)核小體組裝成的局域二級(jí)結(jié)構(gòu)，11納米染色質(zhì)纖維以及更高一級(jí)的30納米染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。主要將對(duì)染色質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比如核小體重復(fù)單元的長(zhǎng)度及其調(diào)控因素；染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)建立、維持過(guò)程中的各種蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用，維持機(jī)制等進(jìn)行研究。比如H1組蛋白、組蛋白修飾酶、以及其它一些影響染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白如

55、MeCP2, MENT, Polycomb如何影響染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)？它們?cè)谌旧|(zhì)高級(jí)纖維結(jié)構(gòu)中處于什么位置？它們?cè)诟呒?jí)結(jié)構(gòu)形成和穩(wěn)定過(guò)程中的作用如何？冷凍電鏡特別適合于超大分子及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)研究。這也決定了它適合于研究染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，比如由核小體，連接DNA和連接組蛋白H1組成的11nm染色質(zhì)纖維，和由其組裝成的30nm染色質(zhì)纖維的大小正好處于冷凍電鏡最適合的蛋白大小區(qū)域。目前，對(duì)于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的電鏡觀察還都局限于對(duì)其二維投影的觀察，如參考文獻(xiàn)2，對(duì)其空間結(jié)構(gòu)的理解及模型的建立都有很大的局限性。本課題的著眼點(diǎn)和突破點(diǎn)將是染色質(zhì)纖維高級(jí)結(jié)構(gòu)的三維重建。由于各個(gè)染色質(zhì)纖維的大小形態(tài)并不具有同

56、一性，我們將主要利用冷凍電子層析成象（cryo Electron tomography）的方法對(duì)單個(gè)染色質(zhì)纖維進(jìn)行重建，并對(duì)其中的重復(fù)單元進(jìn)行亞區(qū)平均（Sub-volume averaging）以達(dá)到更高精度的三維結(jié)構(gòu)。我們將把組成這些高級(jí)結(jié)構(gòu)的單元，如核小體，DNA和組蛋白酶等的原子尺度的結(jié)構(gòu)嵌入到用電鏡三維重構(gòu)的方法得到的這些高級(jí)結(jié)構(gòu)的三維密度圖中，從而研究單體之間的相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制。（3） 不同活性狀態(tài)下的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化及染色質(zhì)變化動(dòng)力學(xué)染色質(zhì)在不同的活性狀態(tài)下具有不同的功能。我們將用冷凍電鏡研究在不同狀態(tài)下（乙?；?去乙酰化、甲基化/去甲基化、磷酸化/去磷酸化、泛

57、素化/去泛素化）染色質(zhì)的三維形態(tài)以了解不同活性狀態(tài)對(duì)染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響及調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，染色質(zhì)形態(tài)在所有結(jié)構(gòu)層次上都是在動(dòng)態(tài)變化的，這也決定了染色質(zhì)的重要功能。我們將在動(dòng)態(tài)變化中的染色質(zhì)的不同形態(tài)用快速冷凍的辦法固定下來(lái)，然后對(duì)不同時(shí)間段的染色質(zhì)形態(tài)進(jìn)行冷凍電鏡三維重構(gòu)，通過(guò)對(duì)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行“snapshot”攝影的方法對(duì)染色質(zhì)變化的動(dòng)力學(xué)及其調(diào)控因素進(jìn)行研究。電子顯微鏡，特別是冷凍電鏡的樣品可以是活性狀態(tài)下處于自然緩沖液中的染色質(zhì)。它提供了一個(gè)在正常生理環(huán)境下研究染色質(zhì)形態(tài)變化及其動(dòng)力學(xué)的良好工具。（4） 體內(nèi)環(huán)境下的表觀遺傳修飾功能研究獲得了組蛋白修飾酶及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)信息后，我

58、們將在生物體內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的功能研究。在這部分研究工作中，我們主要利用模式生物C.elegans的研究平臺(tái)探索組蛋白的表觀遺傳修飾在個(gè)體發(fā)育，尤其是C.elegans壽命，性腺發(fā)育和生殖發(fā)育中的調(diào)控作用。我們知道C.elegans線蟲具有清楚的基因組遺傳背景，并具有強(qiáng)大的RNAi和突變體庫(kù)，遺傳操作方便，是遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的良好模式；并且一些組蛋白修飾酶在C.elegans中已發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的同源蛋白，如人類H3K4的去甲基化酶RBP2在C.elegans中的同源蛋白R(shí)BR-2的RNAi處理可以增強(qiáng)H3K4的甲基化修飾，造成生殖器官發(fā)育的異常。通過(guò)體內(nèi)功能的研究，我們預(yù)期的研究結(jié)果不僅有助于揭示組蛋白修飾酶的生物體功能，而且也將彌補(bǔ)表觀遺傳在線蟲研究中的不足。主要目標(biāo)本課題的預(yù)期目標(biāo)是用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)的方法解析出幾個(gè)重要的組蛋白酶與蛋白質(zhì)復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，研究組成這些復(fù)合物的單體（如組蛋白酶，蛋白質(zhì)）之間的相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從而了解這些單元的相互作用的分子機(jī)制及其對(duì)表觀遺傳的催化機(jī)制、底物特異性和酶活性的調(diào)控機(jī)理。用冷凍電子層析成象結(jié)合亞區(qū)平均的方法解析出核小體之間組裝成的局域二級(jí)結(jié)構(gòu)以及不同活性狀態(tài)下的染色質(zhì)纖