實驗七親和層析純化和SDSPAGE鑒定目蛋白質(zhì)學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1實驗七親和層析純化實驗七親和層析純化(chn hu)和和SDSPAGE鑒定目蛋白質(zhì)鑒定目蛋白質(zhì)第一頁，共38頁。第1頁/共38頁第二頁，共38頁。第2頁/共38頁第三頁，共38頁。外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、細(xì)胞多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體表面受體核酸核酸-互補(bǔ)序列（互補(bǔ)序列（Oligo-dT）第3頁/共38頁第四頁，共38頁。親和層析原理親和層析原理(yunl)(yunl)第4頁/共38頁第五頁，共38頁。第5頁/共38頁第六頁，共38頁。第6頁/共38頁第七頁，共38頁。第7頁/共38頁第八頁，共38頁。第8頁/共38頁第九頁，共38頁。第9頁/共38頁第十頁，共38頁。第1

2、0頁/共38頁第十一頁，共38頁。第11頁/共38頁第十二頁，共38頁。n每組取每組取3-5 mL上清上清(shn qn)液，上柱純化。液，上柱純化。第12頁/共38頁第十三頁，共38頁。于于 GSH-Sepharose 4B 第13頁/共38頁第十四頁，共38頁。第14頁/共38頁第十五頁，共38頁。 1-3號分別加入號分別加入20 uL 5上上樣緩沖液，混勻后在沸水中樣緩沖液，混勻后在沸水中加熱加熱3 min。第15頁/共38頁第十六頁，共38頁。 1 2 3 M 1 2 3 M 樣品加樣品加30 uL30 uLMarkerMarker加加10 uL10 uL第16頁/共38頁第十七頁，共

3、38頁。加水定容到加水定容到5000 mL。第17頁/共38頁第十八頁，共38頁。0.15366 g50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。）中。第18頁/共38頁第十九頁，共38頁。第19頁/共38頁第二十頁，共38頁。第20頁/共38頁第二十一頁，共38頁。n logMW=K-bm實驗實驗(shyn)(shyn)原理原理第21頁/共38頁第二十二頁，共38頁。第22頁/共38頁第二十三頁，共38頁。第23頁/共38頁第二十四頁，共38頁。1. 凝膠孔徑的不連續(xù)性（凝膠孔徑的不連續(xù)性（2種孔徑）種孔徑）2. 緩沖液離子成分及緩沖液離子成分及pH值的不連續(xù)性（值的不連續(xù)性（

4、2種緩種緩沖體系，沖體系，3種種pH）：濃縮）：濃縮(nn su)膠，膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl- 低，比低，比Gly高。高。濃縮濃縮(nn su)(nn su)效應(yīng)效應(yīng)第24頁/共38頁第二十五頁，共38頁。3. 電位梯度不連續(xù)性：快離子（電位梯度不連續(xù)性：快離子（ Cl- ）后面）后面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方間的地方(dfng)，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成極移動

5、的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個狹小的中間層。一個狹小的中間層。濃縮濃縮(nn su)(nn su)效應(yīng)效應(yīng)第25頁/共38頁第二十六頁，共38頁。第26頁/共38頁第二十七頁，共38頁。試劑名稱試劑名稱加液量加液量ddH2O2.5 mL30% Acr-Bis（29:1）3.0 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10% SDS75 uLTEMED（加速劑）（加速劑）10 uL10% AP（催化劑，最后加）（催化劑，最后加）75 uL總體積總體積7.5 mL第27頁/共38頁第二十八頁，共38頁。試劑名稱試劑名稱加液量加液量ddH2O3.4 mL30% Acr

6、-Bis（29:1）0.86mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）（最后加）50 uL總體積總體積5.0 mL第28頁/共38頁第二十九頁，共38頁。第29頁/共38頁第三十頁，共38頁。10. 觀察膠中的蛋白質(zhì)條帶。觀察膠中的蛋白質(zhì)條帶。第30頁/共38頁第三十一頁，共38頁。 純化純化(chn hu)(chn hu)前前 純化純化(chn (chn hu)hu)后后 Marker Marker第31頁/共38頁第三十二頁，共38頁。第32頁/共38頁第三十三頁，共38頁。作橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)目作橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)目的蛋白的遷移率以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，的蛋白的遷移率以及標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以計算相對可以計算相對(xingdu)分子量。分子量。第33頁/共38頁第三十四頁，共38頁。蒸餾水，用蒸餾水，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH到到8.8，用蒸餾水稀釋到，用蒸餾水稀釋到100 mL。第34頁/共38頁第三十五頁，共38頁。5. 10 %（W/V）過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)）過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)配）配）第35頁/共38頁第三十六頁，共38頁。uL上樣緩沖液。上樣緩沖液。第3