第14章 臨床免疫檢驗的自動化分析

1、第一章第一章 血液標(biāo)本采集與處理血液標(biāo)本采集與處理臨床免疫學(xué)檢驗技術(shù)第十四第十四章臨章臨床免疫檢驗的自動化床免疫檢驗的自動化分析分析陶志華目 錄第一節(jié) 免疫濁度測定的自動化分析一、免疫散射比濁測定的自動化分析二、免疫散射比濁測定的影響因素第二節(jié) 發(fā)光免疫測定的自動化分析一、吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光測定的自動化分析二、酶聯(lián)發(fā)光免疫測定的自動化分析三、電化學(xué)發(fā)光免疫測定的自動化分析四、發(fā)光氧通道免疫測定的自動化分析目 錄第三節(jié) 熒光免疫測定的自動化分析一、時間分辨熒光免疫測定的自動化分析二、熒光偏振免疫測定的自動化分析第四節(jié) 酶聯(lián)免疫測定的自動化分析第五節(jié) 臨床免疫檢驗自動化分析的選擇與應(yīng)用一、臨床免疫

2、檢驗自動化分析的選擇原則二、臨床免疫檢驗自動化分析的臨床應(yīng)用重點(diǎn)提示臨床免疫檢驗的自動化分析(automation of immunoassays) 是將免疫學(xué)檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機(jī)控制，儀器自動完成整個免疫檢驗過程。重點(diǎn)提示各種自動化免疫分析儀都使用一種或兩種免疫分析技術(shù)，如酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、生物素-親合素技術(shù)、化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)、熒光偏振免疫測定技術(shù)、時間分辨熒光免疫測定技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)等。有些免疫檢驗如免疫透射比濁則可采用全自動生化分析儀進(jìn)行檢測，有些則整合在其它一些自動化分析系統(tǒng)中，如自

3、動化血凝分析儀。重點(diǎn)提示通過本章學(xué)習(xí)，學(xué)生將全面掌握臨床上常用的全自動免疫分析儀的類型、儀器檢測技術(shù)要點(diǎn)和影響因素。通過本章學(xué)習(xí)，學(xué)生還將了解臨床實驗室選擇選擇原則和臨床應(yīng)用。第一節(jié)第一節(jié) 免疫濁度測定的自動化分析免疫濁度測定的自動化分析免疫濁度分析的基本原理抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。 II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24免疫散射比濁儀粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后

4、，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強(qiáng)度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：式式I I 中為與入射光成中為與入射光成角處散射光強(qiáng)度；角處散射光強(qiáng)度；和和I0I0為入射光的波長和強(qiáng)度；為入射光的波長和強(qiáng)度；dndn/dc/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M M為顆粒分子量；為顆粒分子量；c c為濃度；為濃度；N N為阿佛加德指數(shù)；為阿佛加德指數(shù)；為顆粒到檢測器的距離；為顆粒到檢測器的距離；為散射光與入射光為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。的夾角（散射夾角

5、）。定時散射比濁法（fixed time nephelometry）檢測檢測原理：原理：定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結(jié)果會產(chǎn)生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應(yīng)7.5s2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。 儀器測定技術(shù)儀器測定技術(shù)要點(diǎn)：要點(diǎn)： 1.抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段 2.反應(yīng)階段3.信號檢測4.抗原過剩檢測 (1) 抗體適當(dāng)過量 (2) 對抗原過量進(jìn)行閾值限定 定時散射比濁法（fixed t

6、ime nephelometry）速率散射比濁法（rate nephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號聯(lián)系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅1min2min即可完成。 抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化抗原抗體反應(yīng)速率的動態(tài)變化儀器測定技術(shù)儀器測定技術(shù)要點(diǎn)：要點(diǎn)：開啟機(jī)器，進(jìn)行校準(zhǔn)反應(yīng)階段 抗原過量檢測 速率散射比濁法（rate nephelometry）BN ProSpec全自動特定蛋白分析儀全自動特定蛋白分析儀IMMAGE全自

7、動特定蛋白分析儀全自動特定蛋白分析儀免疫散射比濁儀方法評價散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價格比較貴, 對抗體的質(zhì)量要求很高。免疫比濁分析的影響因素1.抗原抗體比例2.抗體的質(zhì)量3.增濁劑的使用4.偽濁度5.入射光光源和波長6.校準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制第二節(jié)第二節(jié) 發(fā)光免疫測定的自動化分析發(fā)光免疫測定的自動化分析發(fā)光免疫測定的自動化分析發(fā)光免疫測定的自動化分析是通過抗原或抗體標(biāo)記技術(shù)、抗原或抗體的抗原抗體反應(yīng)、固相分離技術(shù)、發(fā)光技術(shù)和計算機(jī)信息技術(shù)進(jìn)行有機(jī)整合，實現(xiàn)了加樣、溫育、固相

8、載體分離清洗、發(fā)光信號檢測和數(shù)據(jù)處理等過程自動化。一、吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結(jié)合法等相同。 磁微粒分離技術(shù)Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y順磁性微粒示意圖順磁性微粒示意圖 磁微粒技磁微粒技術(shù)術(shù) 磁

9、磁微粒微粒在在電磁場中電磁場中分離分離磁磁微微粒粒標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體發(fā)光發(fā)光Y YY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶丫啶帶丫啶酯標(biāo)記酯標(biāo)記物抗體物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后雙抗體夾心法雙抗體夾心法（1 1）加入酸性加入酸性H H2 2O O2 2（pH10）儀器測定技術(shù)要點(diǎn)吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ACS：180 SEACS CENTAURci8200i2000sr酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來標(biāo)記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強(qiáng)弱來進(jìn)行被測物的定量。常用的標(biāo)記酶有辣根過

10、氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。 辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用增強(qiáng)劑使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加、時間延長。魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生物（激發(fā)態(tài)）。它以光量子輻射形式返回基態(tài)時，發(fā)出微綠色可見光。魯米諾增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的原理儀器測定技術(shù)要點(diǎn)全自動增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器是以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行測定的自動化儀

11、器。儀器測定技術(shù)要點(diǎn) AccessAccess全自動酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀全自動酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCelUniCelDxIDxI 800800全自動酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀全自動酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀IMMULITE 2000IMMULITE 2000型全自動酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)型全自動酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀 該儀器以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原），以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團(tuán)，形成4-甲基傘型酮(

12、4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。 儀器測定技術(shù)要點(diǎn)AXSYM全自動酶標(biāo)記熒光免疫分析儀全自動酶標(biāo)記熒光免疫分析儀堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設(shè)計的一種自動化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時間長，易于控制并可根據(jù)待測分子的大小設(shè)計成多種反應(yīng)模式如夾心法、競爭法等。 儀器測定技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體結(jié)

13、合 電化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 光信號檢測 檢測完畢 全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀發(fā)光氧通道免疫分析儀是一種整合了高分子納米微粒、免疫化學(xué)、CPM單光子計數(shù)技術(shù)的新型的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，所采用的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有快速、均相（免沖洗）、高靈敏和操作簡單的特點(diǎn)。發(fā)光氧通道免疫分析儀以雙抗體夾心法為例1. 抗原抗體結(jié)合 將抗體包被感光微粒、抗體包被發(fā)光微粒和待測標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育后，形成抗體包被感光微粒-抗原-抗體包被發(fā)光微粒復(fù)合物。 2. 信號檢測 用光子計數(shù)器計數(shù)得到相對光量子單位(RLU)值，光的強(qiáng)度與待測抗原的濃度成正比，通過校準(zhǔn)曲線計算抗原濃度。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)第三節(jié)第三節(jié) 熒光免疫測定的

14、自動化分析熒光免疫測定的自動化分析自動化熒光免疫分析儀主要是將抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計算機(jī)技術(shù)有機(jī)結(jié)合的一項自動化免疫分析儀器。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進(jìn)行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。 時間分辨熒光免疫分析儀是采用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，并與時間分辨測定技術(shù)相結(jié)合，而建立起來的一種熒光免疫分析儀器，所采用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高，鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，校準(zhǔn)曲線范圍寬等特點(diǎn)。儀器測定技術(shù)要點(diǎn) 抗原抗體結(jié)合 加入Eu3+螯合抗體 加入酸性

15、增強(qiáng)液 4. 信號檢測 時間分辨熒光免疫分析儀auto DELFIAauto DELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)熒光偏振免疫分析儀是采用均相熒光免疫測定原理設(shè)計的一臺熒光免疫分析儀。該儀器利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光（波長485nm）照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光（波長525nm）。該熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)記物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小呈反比。常采用抗原抗體競爭反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)1. 抗原抗體反應(yīng) 2.偏振熒光強(qiáng)度測定 注意事項1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標(biāo)記的好壞、激發(fā)態(tài)熒

16、光的平均壽命、抗原的相對分子量和復(fù)合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾成分。 第四節(jié)第四節(jié) 酶聯(lián)免疫測定的自動化分析酶聯(lián)免疫測定的自動化分析酶聯(lián)免疫測定的自動化分析酶聯(lián)免疫測定的自動化分析是將酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）各種操作步驟（加樣溫育洗滌加酶結(jié)合物溫育洗滌加底物溫育比色等）進(jìn)行自動機(jī)器操作，實現(xiàn)自動化分析的免疫檢測系統(tǒng)。 根據(jù)自動化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的處理模式不同，通常將全自動酶免分析儀分成二類：分體機(jī)和連體機(jī)。分體機(jī)是由“前處理系統(tǒng)”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動酶免分析儀兩個獨(dú)立的部分組成。連體機(jī)是由多個模塊組成，使用一

17、臺計算機(jī)、一套操作系統(tǒng)實現(xiàn)了從標(biāo)本稀釋、加樣到酶標(biāo)板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數(shù)和結(jié)果打印的全自動過程。 儀器組成和性能1.條形碼識別系統(tǒng) 2.樣本架和加樣系統(tǒng) 3.試劑架 4.溫育系統(tǒng)5.液路系統(tǒng) 6.洗板系統(tǒng) 7.酶標(biāo)板讀數(shù)儀 8.自動裝載傳遞系統(tǒng) 9.計算機(jī)管理和信息系統(tǒng)加樣加樣儀器組成和性能洗板洗板儀器組成和性能全自動酶免分析儀中的連體機(jī)是將樣本處理工作站和全自動酶免分析儀聯(lián)合起來，工作速度快，自動化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機(jī)，由于它有一個獨(dú)立的全自動樣本處理站，加樣速度快，適合試驗項目變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。 儀器評價第五節(jié)第五節(jié) 臨床免疫檢

18、驗自動化分析的選擇與應(yīng)用臨床免疫檢驗自動化分析的選擇與應(yīng)用選擇原則1.資質(zhì)要求： 企業(yè)法人營業(yè)執(zhí)照、醫(yī)療器械注冊證和醫(yī)療器械生產(chǎn)/經(jīng)營企業(yè)許可證2.性能要求： 性能指標(biāo)（正確度、精密度、最低檢測限、線性范圍和臨床可報告區(qū)間、分析干擾等）；還應(yīng)考慮檢驗科內(nèi)部儀器所組成檢測系統(tǒng)的一致性和測定結(jié)果的可比性。3.儀器放置地的設(shè)施和環(huán)境條件 4.實驗室項目檢測速度要求和設(shè)備配置5.信息要求6.實驗室檢測項目的經(jīng)濟(jì)效益因素臨床應(yīng)用1.血漿、體液中的特定蛋白檢測2.甲狀腺激素及相關(guān)指標(biāo)檢測3. 生殖激素檢測4. 腎上腺和垂體激素檢測5. 貧血因子檢測6. 腫瘤標(biāo)記物檢測 如 AFP、CEA、PSA、fPSA

19、、CA19-9、CA125、CA15-3等。7. 感染性疾病免疫學(xué)指標(biāo)檢測8. 糖尿病免疫學(xué)指標(biāo)檢測9. 治療藥物濃度檢測 如茶堿、地高辛、環(huán)孢素、苯巴比妥血藥濃度測定等思考題1.什么是免疫檢驗自動化？應(yīng)用哪些技術(shù)？優(yōu)點(diǎn)是什么？2.免疫濁度分析的原理是什么？有哪些臨床應(yīng)用？3.定時散射比濁法和速率散射比濁法的測定原理，其抗原過量檢測有什么不同點(diǎn)？4.免疫比濁分析的影響因素有哪些？5.吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀技術(shù)要點(diǎn)是什么？6.酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀的原理是什么？有哪幾種類型？各有什么特點(diǎn)？7.電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定的技術(shù)要點(diǎn)是什么？8.光致發(fā)光化學(xué)免疫分析儀測定原理和技術(shù)要點(diǎn)是什么？9.時間分辨熒光免疫分析儀測定的技術(shù)要點(diǎn)是什么？注意事項有哪些？10.全自動酶免分析儀的組成成分有哪些？優(yōu)點(diǎn)是什么？小結(jié)臨床免疫檢驗自動化分析是將免疫學(xué)檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機(jī)控制，儀器自動完成整個免疫檢驗過程。臨床免疫檢驗自動化分析是通過采用一種或兩種免疫分析技術(shù)和相應(yīng)專用臨床免疫檢驗自動化