《項目層析技術(shù)》ppt課件

1、層析技術(shù)層析技術(shù)層析技術(shù)層析技術(shù)層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是19061906年俄國植物學家發(fā)年俄國植物學家發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素經(jīng)過裝填有現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素經(jīng)過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后構(gòu)成不同的色帶而被分開，由此得名為構(gòu)成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法色譜法。引言引言 后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分別。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分別。 19441944年出現(xiàn)紙層析。年出現(xiàn)紙層析。 以后層析法不斷開展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相以后層析法不斷開展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析

2、、親和層析、凝膠層析等。層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的根本原理層析法的根本原理 層析法是利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差別層析法是利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差別如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、分配系如吸附力、分子外形及大小、分子親和力、分配系數(shù)等，使各組分在兩相一相為固定的，稱為固定數(shù)等，使各組分在兩相一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相中的分布程度相；另一相流過固定相，稱為流動相中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度挪動而到達分別的不同，從而使各組分以不同的速度挪動而到達分別的目的。目的。層析法的分類層析法的分類 按兩相所處的形狀分類：按兩

3、相所處的形狀分類： 流動相有兩種形狀：流動相有兩種形狀： * *液體作為流動相液體作為流動相 * *氣體作為流動相氣體作為流動相 固定相也有兩種形狀：固定相也有兩種形狀： * *固體吸附劑作為固定相固體吸附劑作為固定相 * *以吸附在固體上的液體作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相 按兩相所處的形狀分為：按兩相所處的形狀分為： 液相層析液相層析 液液- -固層析固層析 液液- -液層析液層析 氣相層析氣相層析 氣氣- -固層析固層析 氣氣- -液層析液層析 按層析過程的機理分類按層析過程的機理分類 吸附層析：利用吸吸附層析：利用吸附劑對不同組分吸附性能的附劑對不同組分吸附性能的差別，從而到

4、達分別鑒定的差別，從而到達分別鑒定的目的。目的。 分配層析：利用不同分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分別。的分配系數(shù)不同，使之分別。 離子交換層析：利用離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和不同組分對離子交換劑親和力的不同，使之分別。力的不同，使之分別。 凝膠層析：利用某些凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同，使之分分阻滯作用的不同，使之分別。別。n按操作方式不同分類按操作方式不同分類n 柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向挪動從而到達分別。樣品沿一個方向挪

5、動從而到達分別。n 紙層析：用濾紙做液體的載體，點紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以到達分別鑒樣后，用流動相展開，以到達分別鑒定的目的。定的目的。n 薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進展物成薄層，以紙層析類似的方法進展物質(zhì)的分別和鑒定。質(zhì)的分別和鑒定。柱層析柱層析 把吸附劑裝在一支玻璃管中把吸附劑裝在一支玻璃管中, ,做成色譜柱。然做成色譜柱。然 后將試液加在柱內(nèi)，假設試液中含有后將試液加在柱內(nèi)，假設試液中含有A A、B B兩兩種組分，那么種組分，那么A A和和B B便被吸附劑固定相吸附便被吸附劑固定相吸附在柱的上端。再用

6、一種洗脫劑流動相進展在柱的上端。再用一種洗脫劑流動相進展沖脫，這時在管內(nèi)就延續(xù)不斷發(fā)生溶解、吸附、沖脫，這時在管內(nèi)就延續(xù)不斷發(fā)生溶解、吸附、再溶解、再吸附的景象。再溶解、再吸附的景象。 假設對假設對A A的吸附才干較弱，那么的吸附才干較弱，那么A A就較易溶解而就較易溶解而較難吸附，在柱中挪動就較快。當沖洗到一定較難吸附，在柱中挪動就較快。當沖洗到一定程度時，兩者即可以完全分開，構(gòu)成兩個帶。程度時，兩者即可以完全分開，構(gòu)成兩個帶。 在繼續(xù)沖洗，在繼續(xù)沖洗，A A物質(zhì)便從柱中流出來，將流出液物質(zhì)便從柱中流出來，將流出液承接于一個容器中。然后承接于一個容器中。然后B B物質(zhì)被洗脫下來，用物質(zhì)被洗脫

7、下來，用另一個容器承接。這樣便可將另一個容器承接。這樣便可將A A、B B兩種物質(zhì)分兩種物質(zhì)分別。別。 如以下圖所示如以下圖所示紙層析紙層析 這是一種微量分別方法。這是一種微量分別方法。 用濾紙做載體，利用紙上吸著的水分作為固定相，將用濾紙做載體，利用紙上吸著的水分作為固定相，將濾紙條點試液的一端浸在有機溶劑中留意不要把原濾紙條點試液的一端浸在有機溶劑中留意不要把原點浸入有機溶劑中該有機溶劑為流動相展開劑。點浸入有機溶劑中該有機溶劑為流動相展開劑。由于濾紙條毛細管的作用。流動相將不斷上升，當流由于濾紙條毛細管的作用。流動相將不斷上升，當流動相上升的時候，與點在濾紙條上的試樣相遇，這時動相上升的

8、時候，與點在濾紙條上的試樣相遇，這時試樣中欲分別的組分就溶解在流動相中并隨之上升。試樣中欲分別的組分就溶解在流動相中并隨之上升。當欲分別的組分遇到上面的固定相時，又溶解在固定當欲分別的組分遇到上面的固定相時，又溶解在固定相中而停下來，接著又被不斷上升的流動相所溶解。相中而停下來，接著又被不斷上升的流動相所溶解。 于是就在兩相之間一次又一次地發(fā)生分配過程相當于是就在兩相之間一次又一次地發(fā)生分配過程相當于一次又一次的萃取，從而將各組分逐個分開。于一次又一次的萃取，從而將各組分逐個分開。薄層層析薄層層析 利用吸附劑對化合物吸附才干的不同而到達分別，吸利用吸附劑對化合物吸附才干的不同而到達分別，吸附劑

9、吸附才干的大小與化合物極性大小有關(guān)。由于硅附劑吸附才干的大小與化合物極性大小有關(guān)。由于硅膠或氧化鋁薄層的毛細管作用，展開劑將沿著薄層逐膠或氧化鋁薄層的毛細管作用，展開劑將沿著薄層逐漸上升。在上升過程中，當遇到新的吸附劑時，又被漸上升。在上升過程中，當遇到新的吸附劑時，又被吸附下來。接著又被不斷流過的展開劑溶解，再隨著吸附下來。接著又被不斷流過的展開劑溶解，再隨著展開劑繼續(xù)上升。展開劑繼續(xù)上升。 試樣中的各個組分將按照它們對硅膠或氧化鋁吸附才試樣中的各個組分將按照它們對硅膠或氧化鋁吸附才干強弱的不同而別分開來。干強弱的不同而別分開來。 化合物極性大，被吸附劑吸附得牢，化合物極性大，被吸附劑吸附得

10、牢，RfRf值小，反之，值小，反之，化合物極性小，化合物極性小，RfRf值大。值大。 特點：薄層層析法分別迅速，普通特點：薄層層析法分別迅速，普通1560min1560min內(nèi)內(nèi)可以完成，操作簡便，靈敏度高?？梢酝瓿?，操作簡便，靈敏度高。 近年廣泛應該在制藥、農(nóng)藥、染料、抗生素等近年廣泛應該在制藥、農(nóng)藥、染料、抗生素等工業(yè)中。工業(yè)中。薄層層析操作方法薄層層析操作方法 1、硅膠、硅膠CMCNa薄層板的制備：薄層板的制備： 稱取稱取CMCNa(羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉)0.15g溶于溶于30mL蒸蒸餾水中餾水中攪拌攪拌(如不溶可加熱如不溶可加熱)至全部溶解至全部溶解參與層析用參與層析用硅膠硅膠

11、10g充分攪拌均勻，研磨成糊狀充分攪拌均勻，研磨成糊狀倒入玻璃板，倒入玻璃板，用食指和拇指拿住玻片，作前后左右悄然搖動，至流用食指和拇指拿住玻片，作前后左右悄然搖動，至流動的硅膠均勻地鋪在玻璃片上動的硅膠均勻地鋪在玻璃片上,程度放置，室溫陰干程度放置，室溫陰干至無水氣存在至無水氣存在于于105烘箱中活化烘箱中活化2h枯燥器中冷枯燥器中冷卻備用卻備用 2、點樣、點樣 選取制備好的薄板一塊，在距底邊選取制備好的薄板一塊，在距底邊2cm 的程度直線上的程度直線上選幾個點，各點間距選幾個點，各點間距1.5或或2cm，離板邊約有，離板邊約有l(wèi)cm的間的間隔。用毛細管分別點上不同的樣品于各個點，樣品量隔。

12、用毛細管分別點上不同的樣品于各個點，樣品量控制在控制在510g，斑點直徑普通為，斑點直徑普通為23 mm，干后再點，干后再點一次。一次。 3、展層、展層 點樣終了，待薄層上樣品自然枯燥后，將薄板點樣終了，待薄層上樣品自然枯燥后，將薄板置于盛有層析溶劑的層折缸中，薄板與液面成置于盛有層析溶劑的層折缸中，薄板與液面成15左右的夾角，點有樣品的一端浸入溶劑中，左右的夾角，點有樣品的一端浸入溶劑中，深達深達0.5cm左右、擴展劑液面應低于點樣線，左右、擴展劑液面應低于點樣線，蓋好層析槽蓋，自下向上展層，當展層溶劑到蓋好層析槽蓋，自下向上展層，當展層溶劑到達離薄板頂端約達離薄板頂端約1cm 處時取出薄板

13、，標出溶劑處時取出薄板，標出溶劑前沿位置，用熱風吹干。前沿位置，用熱風吹干。 4、顯色：、顯色： 除盡溶劑后用噴霧器均勻地噴上顯色劑，烘干除盡溶劑后用噴霧器均勻地噴上顯色劑，烘干使其顯色，計算使其顯色，計算Rf值。值。或使之出現(xiàn)各種有色的斑點，與規(guī)范進展對照或使之出現(xiàn)各種有色的斑點，與規(guī)范進展對照比較，可確定其成分。比較，可確定其成分。 Rf= 起始線到樣品斑點中心間隔起始線到樣品斑點中心間隔 /起始線到溶起始線到溶劑前沿的間隔劑前沿的間隔 1 1、吸附層析技術(shù)、吸附層析技術(shù)吸附層析法液吸附層析法液- -固色譜法，固色譜法，LSCLSC原理原理 利用固定相的固體吸附劑外表對不利用固定相的固體吸

14、附劑外表對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用解吸作用的差別進展分溶解作用解吸作用的差別進展分別。別。 特點特點 適宜分別不同種類的化合物適宜分別不同種類的化合物( (醇類醇類和芳香烴和芳香烴二、吸附劑二、吸附劑吸附劑是具有大外表積的活性多孔固吸附劑是具有大外表積的活性多孔固體，活性多孔固體與待分別物質(zhì)的體，活性多孔固體與待分別物質(zhì)的極性官能團作用。極性官能團作用。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。鋁、羥基磷灰石等。羥基磷灰石羥基磷灰石HAHACa10(PO4)6.(OH)2,Ca10(PO4)6.(OH)2

15、,可用于分別蛋可用于分別蛋白質(zhì)與核酸。其外表有白質(zhì)與核酸。其外表有Ca2+Ca2+和和PO43-PO43-兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質(zhì)兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質(zhì)可與可與Ca2+Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-PO43-結(jié)合。結(jié)合。HAHA柱層析最重要的用途柱層析最重要的用途之一是分別單鏈之一是分別單鏈DNADNA和雙鏈和雙鏈DNADNA，由，由于它對雙鏈于它對雙鏈DNADNA的親和力大于單鏈的親和力大于單鏈DNADNA。2 2、分配層析技術(shù)、分配層析技術(shù)分配層析法液分配層析法液- -液層析法，液層析法，LLCLLC原理原理 利用混合物在兩種不相混溶的液相固定相利

16、用混合物在兩種不相混溶的液相固定相和流動相之間的分配系數(shù)的不同而到達分和流動相之間的分配系數(shù)的不同而到達分別各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載別各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體外表，流動相流過固定相。體外表，流動相流過固定相。分配系數(shù)：分配系數(shù)：當一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，當一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在兩種溶劑中的濃度之比是個常數(shù)，稱為它在兩種溶劑中的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)。分配系數(shù)。K=c1/c2K=c1/c2 分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中的分配的數(shù)量分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中的分配的數(shù)量多，挪動快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分多，挪動快；分配系數(shù)大的溶

17、質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，挪動慢。因此可彼此分開配的數(shù)量多，挪動慢。因此可彼此分開特點：液特點：液- -液層析法適宜于分別同系物或同分液層析法適宜于分別同系物或同分異構(gòu)體異構(gòu)體A ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8 層析柱分別物質(zhì)的表示圖層析柱分別物質(zhì)的表示圖固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm5cm，固定相周圍充溢液體流動相，每，固定相周圍充溢液體流動相，每厘米柱中液相體積為厘米柱中液相體積為1cm31cm3。假設在柱頂參與。假設在柱頂參與1cm31cm3溶劑溶劑, ,其中含其中含32mg32mg樣品，同時樣品，

18、同時應有一樣體積的溶劑從柱底流出，此時樣品處于柱中應有一樣體積的溶劑從柱底流出，此時樣品處于柱中A A位置。假設樣品的分配位置。假設樣品的分配系數(shù)是系數(shù)是1 1，那么它在固相與液相間等量分配。假設再有，那么它在固相與液相間等量分配。假設再有1cm31cm3的溶劑加到柱上，的溶劑加到柱上，A A部分中的溶劑帶著部分中的溶劑帶著16mg16mg的物質(zhì)向下挪動到的物質(zhì)向下挪動到B B，A A和和B B中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配. .3 3、凝膠過濾層析技術(shù)、凝膠過濾層析技術(shù)根本原理根本原理概念概念 排阻層析，分子篩層析：排阻層析，分子篩層析：當生物大分子經(jīng)過裝有凝膠顆當生物大分子經(jīng)

19、過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進展分別的技術(shù)。大小不同而進展分別的技術(shù)。原理原理 凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀構(gòu)造，被分別的混合物流過層構(gòu)造，被分別的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下挪動，并最粒之間的空隙向下挪動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自在出入凝膠子能不同程度的自在出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長挪動速度較慢，最后被洗脫長挪動速度較慢，最后被洗脫出來。出來

20、。凝膠顆粒凝膠顆粒凝膠過濾在實驗室中的運用凝膠過濾在實驗室中的運用1 1生物大分子物質(zhì)的分別純化生物大分子物質(zhì)的分別純化2 2分子量的測定分子量的測定3 3分級分別分級分別4 4溶液濃縮溶液濃縮5 5平衡常數(shù)的測定平衡常數(shù)的測定6 6細胞及顆粒的分別細胞及顆粒的分別LogMLogMA AB BC CLogMLogM測測V V測測LogM=k1-k2VeLogM=k1-k2Ve蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，蛋白質(zhì)經(jīng)過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，VeVe為洗脫體積為洗脫體積先測得幾種規(guī)范蛋白質(zhì)的先測得幾種規(guī)范蛋白質(zhì)的VeVe，并以其分子量對數(shù)對，并以其分子量對數(shù)對VeV

21、e作圖得不斷線，再測出作圖得不斷線，再測出待測樣品的待測樣品的VeVe，查規(guī)范曲，查規(guī)范曲線即可確定分子量。線即可確定分子量。原理原理 根據(jù)離子交換樹脂對需求分別的根據(jù)離子交換樹脂對需求分別的各種離子的親和力不同而到達分別的各種離子的親和力不同而到達分別的目的。目的。將離子交換樹脂裝入層析柱。將離子交換樹脂裝入層析柱。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團物質(zhì)，分子中含有可解離的基團. .含含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂，可解離出樹脂，可解離出 H+H+，含有堿性可解離基團的稱，含有堿性可解離基團

22、的稱 為陰離子交換樹脂，可解離出為陰離子交換樹脂，可解離出 OH-OH-4 4、離子交換層析法、離子交換層析法離子交換層析的根本原理離子交換層析的根本原理+假設選擇陽離子交換樹脂，那么帶正電荷的物質(zhì)與假設選擇陽離子交換樹脂，那么帶正電荷的物質(zhì)與H+H+發(fā)生交換而發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。假設選擇陰離子交換樹脂，那么帶負電荷的物質(zhì)可結(jié)合在樹脂上。假設選擇陰離子交換樹脂，那么帶負電荷的物質(zhì)可與與OH-OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的結(jié)實程度即親和力大小有差別，因此選用適物質(zhì)在樹脂上結(jié)合的結(jié)實程度即親和力大小有差別，因此選用適當?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，到達分別純化的當?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個洗脫下來，到達分別純化的目的。目的。+原理原理 利用生物大分子間特異的親和才干來純利用生物大分子間特異的親和才干來純化生物大分子化生物大分子 如：抗原和抗體如：抗原和抗體 ； 酶酶和底物或輔酶或抑制劑和底物或輔酶或抑制劑 ； 激素和受體；激