免疫熒光技術(shù)

1、整理ppt免疫熒光技術(shù)整理ppt一、一些基本概念和基本知識：1 熒光免疫測定技術(shù)的概念：將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)，稱為免疫熒光素技術(shù)。整理ppt2.技術(shù)分類： 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù)) 抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判 定結(jié)果的檢測方法。 免疫熒光測定技術(shù)： 抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定 熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法整理ppt熒光的產(chǎn)生： 物質(zhì)吸收外界能量而進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發(fā)光，這種光稱為熒光。 這種物質(zhì)，稱為熒光素 由光激發(fā)所引起的熒光，為光致熒光

2、-熒光免疫技術(shù) 由化學(xué)反應(yīng)所引起的熒光，為化學(xué)熒光 -化學(xué)發(fā)光技術(shù)整理ppt熒光素的熒光特性： 停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止 對光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性 入射光波長發(fā)射光波長 熒光效率： 發(fā)射熒光的光量子數(shù) 熒光效率= 吸收光的光量子數(shù) 熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱整理ppt5 常見熒光素： FITC RB200 TRITC 鑭系：Eu、Tb PE 其它整理ppt常見熒光素的特性： FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490495nm， 發(fā)射光：520530nm，明亮的黃綠色熒光。 RB200： 橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光 595600nm，橘紅色熒光。 TRITC： 紫紅

3、色粉末，吸收550nm，發(fā)射光 620nm，橙紅色熒光。 鑭系：Eu、Tb PE：吸收光490560nm，發(fā)射光595nm，紅色 熒光。 其它：酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。整理ppt酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)： 酶 底物 產(chǎn)物 激發(fā)光 發(fā)射光-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA 二聚體 317 414 整理ppt合適熒光素的選擇 具有與蛋白質(zhì)形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)。 熒光素-N=C +NH-蛋白質(zhì) 熒光素-N-C-N-蛋白質(zhì) S H H S H 熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。 熒光色澤與背景色澤對比鮮明。 標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性 標(biāo)記方法簡單、快速

4、。 安全無毒整理ppt二、 熒光抗體的制備 1 熒光素與抗體結(jié)合（標(biāo)記） 2 熒光抗體的純化 3 熒光抗體的鑒定 整理ppt熒光素與抗體結(jié)合方法： 透析法：適用于蛋白質(zhì)含量低、樣品體 積小的抗體溶液的標(biāo)記 標(biāo)記較均勻，非特異熒光較低 攪拌法：適用于蛋白質(zhì)含量較高、樣品 體積較大的抗體溶液的標(biāo)記 標(biāo)記時間短、效率較高，熒光 素用量節(jié)省 影響因素多，非特異熒光較強(qiáng)整理ppt 透析法第一步： 將含10mg/ml的Ig溶液10ml 裝入透析袋。第二步： 將上述透析袋放入燒杯中 ： 含0.1mg/ml FITC的 pH=9.4的碳酸鹽緩沖液100ml。第三步： 4磁力攪拌24h。第四步： 取出透析袋，進(jìn)

5、行純化、鑒定。整理ppt 攪拌法第一步： 將含40mg/ml BP 溶液5ml 裝入反應(yīng)瓶中。第二步： 加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸鹽 緩沖液4ml 第三步： 25磁力攪拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶液第四步： 25下攪拌1h，4下繼續(xù)攪拌 4h，然后進(jìn)行純化、鑒定。整理ppt熒光抗體的純化： 除去未結(jié)合熒光素 除去標(biāo)記不適當(dāng)?shù)目贵w 除去非特異反應(yīng)物質(zhì)整理ppt 除去未結(jié)合熒光素： A 透析法： 將標(biāo)記后的抗體溶液裝于透析袋，于流動的自來水中透析約10min，然后移入pH=7.4的磷酸鹽緩沖液中，在4下透析，直至透析外液在紫外燈下不呈現(xiàn)熒光為止。整理pptB 凝膠過濾法：

6、 葡聚糖凝膠G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶脹后裝柱，加入標(biāo)記后的抗體溶液，然后用上述PBS洗脫，取洗脫液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的熒光素應(yīng)低于0.01ug/ml。整理ppt 除去標(biāo)記不適當(dāng)?shù)目贵w： 采用DEAE纖維素離子柱。將DEAE纖維素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液平衡裝柱，加入標(biāo)記抗體溶液，進(jìn)行分步洗脫。 未結(jié)合熒光素的抗體，所帶負(fù)電少，最先洗出。 過量結(jié)合熒光素的抗體，所帶負(fù)電多，最后洗出。整理ppt 除去非特異反應(yīng)物質(zhì)： 將熒光抗體用同一正常組織或同種動物其它組織的組織粉預(yù)先吸收。 按100mg組織粉/ml標(biāo)記抗體比例混合， 4磁力

7、攪拌1h，靜置1h，離心取上清液，在用50mg/ml比例重復(fù)一次。整理ppt熒光抗體的鑒定： 抗體含量測定：雙擴(kuò)法 結(jié)合比率(F/P)測定： 分光光度法，并按下式計算： FITC: F/P=2.87A495/(A280-0.35A495) RB和TRITC: F/P= A515 / A280 * F/P值高則抗體分子結(jié)合的熒光素多。 * 固定標(biāo)本染色以F/P=1.5左右為宜 * 活細(xì)胞染色以F/P=2.4左右為宜整理ppt三、熒光抗體技術(shù)： 抗原片的制作 試驗(yàn)類型 熒光顯微鏡檢查整理ppt抗原片的制作1 制作：臨床常見的標(biāo)本有組織、細(xì)胞細(xì)菌三大類?？刹捎猛科?、印片或切片方式制備抗原片。細(xì)胞采用

8、涂片、印片或切片的方式制備抗原片。整理ppt2 標(biāo)本的固定： 固定目的防止細(xì)胞、細(xì)菌或切片從玻片上脫落。去除組織中妨礙抗原抗體結(jié)合的類脂質(zhì)。易于保存。（但CD、SIg的檢測不進(jìn)行固定，而采用活細(xì)胞染色）。整理ppt 常用的固定方法：抗原 固定劑 固定方法蛋白質(zhì) 95%乙醇 室溫310min或430min Ig類 甲醇 同上酶類 丙酮 同上激素 CCl4 同上類脂質(zhì) 10%福爾馬林 室溫310min多糖(細(xì)菌) 10%福爾馬林 室溫310min或430min 丙酮、甲醇病毒 無水乙醇 室溫510min或43060min 丙酮、CCl4 或-20 60min以上整理ppt試驗(yàn)類型 1 直接法 2

9、間接法 3 補(bǔ)體結(jié)合法 4 雙標(biāo)記法 整理ppt抗原標(biāo)記抗體光原熒光直接法原理示意圖整理ppt間接法原理示意圖抗原抗體標(biāo)記抗體光原熒光整理ppt補(bǔ)體抗體標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體光源熒光補(bǔ)體結(jié)合法原理示意圖整理ppt熒光顯微鏡檢查： （由實(shí)驗(yàn)課介紹）整理ppt三、其它免疫熒光技術(shù)流式細(xì)胞儀時間分辨免疫熒光技術(shù)1熒光偏振免疫分析技術(shù)整理ppt時間分辨熒光免疫測定(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA) 基本原理是：利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時

10、間分辨熒光儀即可測定熒光強(qiáng)度，從而推測待測物含量。整理ppt整理ppt時間分辨熒光測定的特點(diǎn)： 1 采用脈沖光源(每秒閃爍1000次以上的氙燈), 照射樣品后即暫短熄滅. 2 以電子設(shè)備控制延緩時間，待非特異本底熒 光衰退后，再測鑭系熒光。 3 鑭元素具有較長的熒光壽命(105ns)，延緩測量時 間，能有效地消除非特異本底熒光(10ns)的干擾， 4 鑭系螯合物的激發(fā)光與熒光發(fā)射峰之間的波長差 異(即較大的Stokes位移），有利于排除非特異性 熒光干擾，提高檢測特異性。鑭系元素有Eu、Sm Tb、Nd 和Dy等，其中以Eu最為常用。 5 測定技術(shù)類型有：競爭法、夾心法、間接法等。整理ppt熒光偏振免疫