基因工程實驗

1、12實驗一：堿裂解法抽提實驗一：堿裂解法抽提 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA3一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒DNA的提取方法。4二、實驗原理 堿裂解法主要利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒和線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異。 NaOH和SDS溶液使細(xì)胞裂解，在堿性溶液中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對較小，且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使在高堿性pH條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會充分分離。5 當(dāng)加入中性緩沖液調(diào)和時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，它們之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等結(jié)合沉淀下來。

2、通過離心沉淀，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的RNA則留在上清液中?；祀s的RNA可用RNaseA消除。再用酚氯仿處理，可除殘留蛋白質(zhì)6三、材料、試劑及儀器1 材料： （1）菌種E.coliDH 10B含質(zhì)粒pSK （2）菌種E.coliDH 10B含質(zhì)粒pMP32 試劑: LB培養(yǎng)基（ 固體和液體）;氨芐青霉素(Amp,100mg/ml);20SDS;溶液; 溶液（最好現(xiàn)配現(xiàn)用）;溶液（-20預(yù)冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;無水乙醇; TE緩沖液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70乙醇;飽和酚/氯仿/異戊醇（2

3、5：24：1）73 儀器及設(shè)備 高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫?fù)u床、臺式離心機(jī)、漩渦振蕩器 培養(yǎng)用試管、量筒、冰盒、微量離心管、微量取液器、吸管頭若干8四、實驗步驟1.細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)（1）配制LB液體和瓊脂培養(yǎng)基，并高壓滅菌（2）當(dāng)培養(yǎng)基不燙手時把Amp加入瓊脂培養(yǎng)基中倒平板使終濃度為Amp100g/ml（3）在Amp100g/ml的瓊脂培養(yǎng)基平板上用接種環(huán)劃線分別培養(yǎng)出含mp3和psk質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落（37.18-20個小時）（4）取2支滅菌的12mL培養(yǎng)管，加入2.5mL液體LB培養(yǎng)基和2.5LAmp母液（1000 x） （5）用滅菌的鑷子夾一個滅菌的牙簽，在單菌落上沾一下放入液

4、體培養(yǎng)基中（6）蓋上蓋子，將培養(yǎng)管傾斜插在搖床上，37過夜培養(yǎng)（ 200rpm，14-16小時，一般不超過18小時）。92 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取的提取取取1.5 ml菌液入菌液入1.5ml的離心管中的離心管中 5000rpm 5000rpm、離心、離心2min2min，棄上清，收集菌體（如果想提取，棄上清，收集菌體（如果想提取多一點多一點DNADNA，再吸取，再吸取1.5ml1.5ml菌液到同一離心管中，離心，菌液到同一離心管中，離心，棄上清）棄上清）: :離心時離心管方向要固定，柄朝外，方便看離心時離心管方向要固定，柄朝外，方便看是否離下來是否離下來用移液槍盡可能除去上清液，然后用移液槍盡可

5、能除去上清液，然后150uL150uL溶液溶液I I懸浮菌體懸浮菌體用渦旋振蕩器充分振蕩用渦旋振蕩器充分振蕩 ：溶液：溶液I I最好要放冰上最好要放冰上 加入加入250uL250uL溶液溶液IIII，緩慢上下翻轉(zhuǎn)離心管，緩慢上下翻轉(zhuǎn)離心管1010多下，多下，溫和溫和混混勻勻，冰上靜置，冰上靜置5min 5min ：充分裂解菌體充分裂解菌體10 加入加入180uL預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液III，上下翻轉(zhuǎn)十多下，溫和，上下翻轉(zhuǎn)十多下，溫和混勻，冰上靜置混勻，冰上靜置10min或者放入或者放入-20冰箱冰箱5min : 使染色體使染色體DNA等沉淀，而質(zhì)粒等沉淀，而質(zhì)粒DNA復(fù)性復(fù)性12000rpm，4

6、離心離心5min。 取上清。加取上清。加2/3體積的酚體積的酚/氯仿氯仿12000rpm，混勻。，混勻。12000rmp離心離心5min ：用于抽提脂類，蛋白質(zhì)等。用于抽提脂類，蛋白質(zhì)等。 在混勻時，要蓋緊蓋子，用紙巾包住離心管，來回翻在混勻時，要蓋緊蓋子，用紙巾包住離心管，來回翻轉(zhuǎn)。離心后會發(fā)現(xiàn)溶液分三層，上層為含轉(zhuǎn)。離心后會發(fā)現(xiàn)溶液分三層，上層為含DNA，RNA的水相，中間為蛋白質(zhì)，下層為有機(jī)相的水相，中間為蛋白質(zhì)，下層為有機(jī)相 移取上清液，加移取上清液，加2倍體積的無水乙醇（大量提取時可倍體積的無水乙醇（大量提取時可以用以用0.6倍的異丙醇代替），混勻：倍的異丙醇代替），混勻：用于沉淀用

7、于沉淀DNA，11 12000rpm離心離心5min，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液，倒掉酒精。離心幾秒鐘，用移液槍盡可能除去酒精。用槍盡可能除去酒精。用0.5ml 70%酒精洗酒精洗DNA一次，一次，離心離心2min，倒掉酒精，倒掉酒精 70%酒精可以使酒精可以使DNA保持不溶解的狀態(tài)，保持不溶解的狀態(tài)，30%的水還的水還可以使離子洗去可以使離子洗去 離心幾秒，用移液槍盡可能除去酒精，風(fēng)干十分鐘離心幾秒，用移液槍盡可能除去酒精，風(fēng)干十分鐘 此時此時DNA變成無色透明變成無色透明 加入50ulTE（含50ug/mgRNaseA）溶解DNA沉淀。放置金屬浴65加熱10min或37放置數(shù)小時 使RN

8、aseA發(fā)揮作用，并且DNA酶在此條件下會失活 -20保存?zhèn)溆?23 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的進(jìn)一步純化的進(jìn)一步純化 加入TE使DNA溶液為200ul，加入等體積的酚/氯仿，充分振蕩：會分三層 12000rpm，離心5分鐘，吸取上清液 加入等體積的氯仿， 12000rpm，離心5分鐘，取上清 加入1/10體積的3MNaAc，加2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，混勻。 置于-70冰箱約10min以上或者-20冰箱30min至數(shù)個小時13 12000rpm離心15分鐘（4），倒掉酒精，離心幾秒，用移液槍盡可能除去酒精 用0.5ml70 %酒精洗酒精洗DNA沉淀一次，離心沉淀一次，離心2分鐘，倒掉分鐘，倒掉酒精酒精

9、 離心幾秒，用移液槍盡可能除去酒精，風(fēng)干。加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）14五、實驗注意事項1 挑菌落應(yīng)挑單菌落。 可用牙簽挑取，也可用tip頭挑取。市場上買的牙簽上有防腐劑，應(yīng)用沸水煮過之后，烘干用2 細(xì)菌培養(yǎng)過程應(yīng)注意保持細(xì)菌的通氣性：（1）培養(yǎng)基的體積不能占培養(yǎng)管的體積太多（2）培養(yǎng)管的體積不用蓋太緊（3）培養(yǎng)管傾斜培養(yǎng)：可增大細(xì)菌與氧氣接觸面積（4）轉(zhuǎn)速為200rmp：快一點的轉(zhuǎn)速有利于保持其的通氣性153 細(xì)菌培養(yǎng)后可通過肉眼觀察分辨是否有雜菌：大腸桿菌的應(yīng)為乳白色或淡黃色，有雜菌的會發(fā)紅4 氯仿有毒性，見光會產(chǎn)生有毒光氣，所以要保存于棕色瓶里，任何涉及氯仿的操作

10、都要在通風(fēng)廚內(nèi)使用。并且氯仿會溶解塑料，吸取時把離心管靠近些RNaseA可加入TE中，也可加入Solution中加入溶液、溶液搖勻時一定要溫和，不能劇烈搖動16六、思考題1 為什么真核生物基因組為什么真核生物基因組DNA不能用堿法抽提？不能用堿法抽提？ 答：堿法提取質(zhì)粒是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒和線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異。當(dāng)線性的基因組DNA遇到強(qiáng)堿后，產(chǎn)生不可逆的變性，而質(zhì)粒DNA由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開，當(dāng)條件適合時，質(zhì)粒DNA又恢復(fù)了原來的結(jié)構(gòu)。 真核生物的基因組DNA為雙螺旋結(jié)構(gòu)，在在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變形，而基因組DNA分子量相對較大，在堿

11、性PH條件下其線性的大分子量基因組DNA不能復(fù)性，而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)等共沉淀。 172 異丙醇和無水乙醇對核酸沉淀的優(yōu)缺點異丙醇和無水乙醇對核酸沉淀的優(yōu)缺點 答：異丙醇和乙醇都能與與任意比例的水相混合。異丙醇比較疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去鹽，它比異丙醇更親水，所以能去掉一些鹽離子。 異丙醇沉淀量多，但雜質(zhì)也多，增加了后續(xù)實驗風(fēng)險。其優(yōu)點為：所需容積小且速度快，適用于濃度低，而體積大的DNA樣品的沉淀。一般不需要在低溫條件下長時間放置。缺點為：易使鹽類（如NaCl、蔗糖）與DNA共沉淀；在DNA沉淀中異丙醇難以揮發(fā)除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首選的有機(jī)溶劑，對鹽類沉淀少，DN

12、A沉淀中所含的衡量乙醇易蒸發(fā)去處，不影響以后的實驗。在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，2倍樣品容積的95乙醇可有效沉淀DNA。其缺點是總體積較大。需在-20放置很長時間，30分鐘-1小時，同時DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使部分DNA溶解損失 183 核酸沉淀時為什么要加高濃度鹽（核酸沉淀時為什么要加高濃度鹽（ NaAc）？）？ 答：在pH為8為左右的溶液中，分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的或，使中和分子上的負(fù)電荷，減少分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分形成鈉鹽而聚合，這樣就造成沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的中，由于過多的鹽雜

13、質(zhì)存在，影響的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀19實驗二實驗二 瓊脂凝膠電泳瓊脂凝膠電泳20一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法，并掌握檢測質(zhì)粒DNA的純度、濃度與分子量的方法21二、實驗原理 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔行濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。 DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。

14、 溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5ng以上的DNA。本實驗用的顯色劑為Golden view,原理與EB相似。 質(zhì)粒DNA有環(huán)狀超螺旋、開環(huán)、和線性，電泳遷移率為超螺旋線性開環(huán)。22三、實驗材料、試劑和儀器1 材料 試驗一提取的質(zhì)粒pSK和MP32 試劑 瓊脂糖、10 xTBE 電泳緩沖液。10 x載樣緩沖液、EB母液（0.5mg/ml）、DNA(Hind）3 儀器與用具 微波爐，電泳儀，微型電泳槽，凝膠成像系統(tǒng) 微量取

15、液器、吸管頭若干、加樣板、量筒、三角瓶 透明膠帶23四、 實驗步驟一、制膠1、稱取1g瓊脂糖加入盛有100ml 0.5TBE電泳緩沖液的5000ml三角瓶中，搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。在微波爐或者電爐上加熱至瓊脂糖完全溶解，放在天平上加蒸餾水至原重量。冷卻到約60后，加入5ul的Goldview（終濃度0.5ug/ml），并搖勻。2、插入適當(dāng)?shù)氖嶙拥街颇z板,將溶解的瓊脂糖倒入其中，直至厚度約4-6mm。3、冷卻至室溫:待成形后可放入冰箱內(nèi)（4,10min)加速凝固4、充分凝固后拔出梳子，用鑷子撬開凝膠，要保證點 樣孔完好 5、將凝膠放入電泳槽中，加電泳緩沖液 至液面覆蓋凝膠1-2mm2

16、4 2.點樣點樣 1xTE或ddH2O:7L10ul混合液 10 xloading buffer : 1ul 樣品:2 ul 混合后點入點樣孔中。其中最左邊的兩個孔點5ulMarker3和DS2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。3.電泳電泳 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5v/cm即100V，可見溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，約一小時可觀察254 觀察 用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳好的凝膠，打開紫外燈，可以看到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶的粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，可粗略估計樣品DNA的濃度。同時根據(jù)已知的分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA-，通過線性DNA條帶的想對位置初步估計樣品分子量26五、實驗注意事項五、實驗注意事項1 用微波煮膠時，膠

17、液的量不應(yīng)超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出2 煮好的膠應(yīng)冷卻至50左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機(jī)會3 如果用紫外投射檢測儀觀察，要戴上防護(hù)觀察罩，并最好穿長袖4 跑好的凝膠放到成像系統(tǒng)內(nèi)觀察時最好少一些的水分，放置時先放好一邊，緩緩放下，不要出現(xiàn)氣泡5 核酸吸收260nm紫外線 ，導(dǎo)致DNA的斷裂，因此回收DNA應(yīng)在長波紫外線下觀察較好，以減少對DNA的損傷 。并且熒光易淬滅，注意觀察的時期，不要反復(fù)在紫外下照射。27六、實驗結(jié)果分析六、實驗結(jié)果分析Marker 3DS2000 上圖為凝膠的觀察結(jié)果，最左邊的兩條泳帶為Marker 3和DS2000做為分子量標(biāo)準(zhǔn)。從右邊數(shù)倒數(shù)第三

18、條帶為我的樣品的條帶，所得條帶比較亮，可見所提質(zhì)粒濃度比較高 。MINE28七、思考題1 DNA分子在堿性中帶什么電荷？電泳時向哪一極運(yùn)動？分子在堿性中帶什么電荷？電泳時向哪一極運(yùn)動？ 答：DNA分子是兩性解離分子， pH8.0-8.3時，堿基幾乎不解、 離，而磷酸基團(tuán)解離，所以核酸分子帶負(fù)電，所以DNA分子在 堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場作用下向正極泳動。2 Loadingbuffer的成分是什么？各有什么作用？的成分是什么？各有什么作用？答： Loadingbuffer由蔗糖（或甘油）和溴酚藍(lán)（或二甲苯FF） 組成。 蔗糖（或甘油）蔗糖（或甘油）的作用是增加樣品密度，使其比重增加， 以

19、確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)，不漂浮在緩沖液中。溴酚藍(lán)溴酚藍(lán) （或二甲苯（或二甲苯FF）起指示劑的作用，在電泳中形成肉眼可見的指 示帶，可預(yù)測核酸電泳的速度和位置；并且使樣品呈色，使加樣操作更方便293 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA有哪些構(gòu)型？其遷移率有何差異？有哪些構(gòu)型？其遷移率有何差異？ 答：質(zhì)粒有超螺旋、線性和開環(huán)三種構(gòu)型。 其中超螺旋的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA（SC）的泳動速度最快，一條鏈斷裂的開環(huán)狀質(zhì)粒DNA（OC）泳動速度最慢，二條鏈斷裂的線性DNA（L）居中，通過凝膠電泳和EB染色的方法可將不同構(gòu)型的DNA分別開來。304 DNA熒光染料的發(fā)光原理熒光染料的發(fā)光原理 答 ：以溴化乙錠為例，溴

20、化乙錠含有一個可以嵌入 DNA堆積堿基之間的一個三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA 的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽 和溶液中，大約每2.5個堿基插入一個溴化乙錠分子。 當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并 通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團(tuán)的固定 位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料 呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。 DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而 被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。 這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的 590nm處重新發(fā)射出來。315 什么是遷移率？影響遷移率的因素有哪些？什么是遷移

21、率？影響遷移率的因素有哪些？什么是分辨率？分辨率與凝膠濃度有什么關(guān)系？什么是分辨率？分辨率與凝膠濃度有什么關(guān)系？ 答：電泳遷移率（m）是指在單位電場強(qiáng)度（1V/cm）時帶電分子的遷移速度。 遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。 分辨率是指凝膠的有效分離范圍。分辨率隨著凝膠濃度的增大而減小。 32實驗三、實驗三、DNA的濃度測定的濃度測定及酶切及酶切33一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測定DNA溶液濃度及斑點實驗法定量DNA溶液濃度及利用限制性內(nèi)切酶切割DNA的方法，并通過電泳檢測酶切的效果，為以后的連接作準(zhǔn)備。34二、實驗原理 DNA的吸收光譜在260nm處

22、，據(jù)計算，測定此波長下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時，雙鏈DNA 含量約為50ug/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計測定溶液中DNA 含量。由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm處，在測定DNA含量時，還常計算OD260/OD280 之值，如改值為1.8-2.0時，認(rèn)為已達(dá)到較高的純度，如低于此值，表明其內(nèi)含雜質(zhì)較多，可能影響酶切反應(yīng)。 目前已發(fā)現(xiàn)三類不同的限制性內(nèi)切酶即型、型、和型。其中型能專一識別堿基順序，并在該處切斷雙鏈DNA，因而在基因工程中得到廣泛應(yīng)用。DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性末端或平端。35 目前已發(fā)現(xiàn)三類不同的限制性內(nèi)切酶即I型 II 型和 III型。其中II型

23、可以專一識別堿基序 列，并在該處切斷DNA,得到廣泛應(yīng)用。DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用產(chǎn)生兩種斷裂狀態(tài)：粘性 末端和平齊末端。限制性內(nèi)切酶III識別的堿基序列是： 5-AAFCTT-3 3-TTCGAA-5 酶切作用后產(chǎn)生5突出粘性末端 A 5 -AGCTT TTCGA-5 A36三、實驗材料、試劑和儀器1 實驗材料： 提純后的質(zhì)粒DNAmp3和psk2 試劑：限制性內(nèi)切酶HindIII及對應(yīng)的緩沖液、無菌雙蒸水、10TBE電泳緩沖液、0.8瓊脂糖、載樣緩沖液3 儀器 分光光度計、電泳儀、微型電泳槽、紫外投射檢測儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱 微量移液器、微量離心管、吸管頭軟干、點樣板、保鮮膜、一次性手套37四、實驗步驟1. DNA濃度純度的測定 （1）紫外分光光度計法 取實驗一的DNA 2L（約100-200ng）至一干凈的離心管，加入198LddH2O稀