項(xiàng)目常見問題與解答

1、RNA-Seq項(xiàng)目常見問題與解答這兩年隨著測(cè)序成本的下降和轉(zhuǎn)錄組研究的日漸火熱，RNA-seq儼然已經(jīng)成為了分子生物學(xué)課題組推進(jìn)項(xiàng)目的首選方向。在我們接觸的轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目中，有些老師對(duì)項(xiàng)目分析結(jié)果存在或多或少不清楚或有疑惑的地方。那么春天來了，花兒開了，今天福利也到了，我們特意將轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目中常見的一些問題進(jìn)行了匯總，各位老師可以按需自取哈。1如何判定生物學(xué)重復(fù)一致性的高低？生物學(xué)重復(fù)統(tǒng)計(jì)方法及公式答：（1）皮爾遜相關(guān)系數(shù)r可以作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)，理想的生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)r20.92?？紤]到個(gè)體差異、取材環(huán)境、時(shí)間以及人員操作熟練程度等因素對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的影響，一般r20.8為可接受范圍。（2）

2、Pearson（皮爾遜）相關(guān)系數(shù)：皮爾遜相關(guān)也稱為積差相關(guān)（或積矩相關(guān)）是英國(guó)統(tǒng)計(jì)學(xué)家皮爾遜于20世紀(jì)提出的一種計(jì)算直線相關(guān)的方法。2DEG基因用Transcripts還是Unigenes？答：DEG基因用的是Unigene。3transcript-id代表什么意思？為什么有的基因有多個(gè)transcript-id？答：基因轉(zhuǎn)錄本id；因?yàn)榭勺兗羟械木壒?，一個(gè)基因可能有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。4在miRNA鑒定中，可能成為miRNA的reads是怎樣計(jì)算的？哪些條件會(huì)影響到mrd值？micro RNA在不同組織有異構(gòu)體的存在，是如何處理的？答：與 Rfam， miRbase， RepBase和 ExonIn

3、tro 序列庫進(jìn)行比對(duì)，獲得 sRNA 注釋信息，以此作為預(yù)測(cè)新的 miRNA 的基礎(chǔ)。miRNA的鑒定是利用miRDeep2軟件進(jìn)行已知及新（保守及非保守）的miRNA鑒定。miDeep2會(huì)在reads比對(duì)到基因組上的位置兩端分別延伸75、15bp進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，此軟件認(rèn)為極可能與可能是miRNA的根據(jù)是通過mrd值來區(qū)分的，mrd>-10為可能，mrd>0為極可能；影響mrd值的有reads在基因組上的分布和堿基結(jié)合的自由能等；5對(duì)于有生物學(xué)重復(fù)的項(xiàng)目，怎樣計(jì)算差異基因？答：兩兩比對(duì)使用的是R的EBseq包, 是基于負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，重復(fù)間的比

4、對(duì)使用的是R的DEseq包，是基于分層貝葉斯模型的原理對(duì)組合內(nèi)樣品進(jìn)行分析。6外顯子，內(nèi)含子及基因間區(qū)各自的比例如何評(píng)估建庫情況？答：理論上，來自成熟mRNA的reads應(yīng)該比對(duì)到外顯子區(qū)。但是，由于基因組注釋水平、可變剪切導(dǎo)致的內(nèi)含子序列保存，以及很多RNA（比如lncRNA）就來自基因間區(qū)和內(nèi)含子，因此有比對(duì)到內(nèi)含子和基因間區(qū)的reads。受物種等的影響外顯子所占比例不同，一般情況下外顯子區(qū)域所占比例超過70%即比較理想。7影響組裝Contig結(jié)果的因素？答：a物種的特異性；b測(cè)序質(zhì)量；c測(cè)序的數(shù)據(jù)量；dSNP的雜合率；e組裝參數(shù)的選擇。(1)、在不考慮物種特異性和測(cè)序質(zhì)量的情況下，測(cè)序的

5、數(shù)據(jù)量越大，SNP的雜合率越高，得到的短片段Contig的數(shù)目就越多。根據(jù)Trinity組裝Contig的策略，將Reads構(gòu)建K-mer庫，選取頻數(shù)最高的K-mer，按照k-1的overlap進(jìn)行延伸，用于延伸的K-mer全部從庫中清掉，因此測(cè)到的reads越多，SNP的雜合率越高，延伸完后的短片段就越多。(2)、對(duì)于組裝參數(shù)的選擇，是用于過濾低頻數(shù)K-mer，選擇的參數(shù)不同，過濾掉的K-mer數(shù)目不同，如果過濾掉的越多，那么留下的短片段的Contig就會(huì)少。所以即使用同一個(gè)軟件（Trinity）進(jìn)行組裝，如果不知道組裝參數(shù)的時(shí)候，對(duì)于組裝結(jié)果沒有很大的可比性。(3)、組裝結(jié)果的好壞最主要的

6、還是看Unigene的組裝數(shù)據(jù)，包括組裝出的數(shù)目和N50。一般來說，組裝出的Unigene的數(shù)目在一個(gè)合理范圍內(nèi)（比如10W以內(nèi)），N50越大，組裝的結(jié)果越好。8轉(zhuǎn)錄組測(cè)序Contig 與transcript的區(qū)別？答：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原始數(shù)據(jù)包含了很多的reads，通過序列的拼接，具有重疊區(qū)的reads會(huì)被組裝成更大的片段，稱之為contig。將reads比對(duì)回contig，通過paired-end reads能確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同contig 以及這些contig之間的距離，將這些contig連在一起，最后得到兩端不能再延長(zhǎng)的序列，稱之為Unigene。Transcript即轉(zhuǎn)錄本。9不同

7、ID號(hào)代表的基因相同嗎？不同ID號(hào)功能注釋相同的，為什么？答：不同的ID可以認(rèn)為是代表不同的基因。不同的基因注釋的功能相同，原因有：一是有些長(zhǎng)的基因沒有組裝出完整的序列，而是分成了多個(gè)小片段，這種情況去進(jìn)行注釋的話會(huì)注釋到同一個(gè)功能蛋白；二是基因的核酸序列不同，但是蛋白序列具有一定的相似性或者具有相似的功能區(qū)域，這些基因在比對(duì)注釋用的蛋白序列時(shí)，會(huì)注釋到相同的功能。10多個(gè)Unigene注釋一樣，序列長(zhǎng)度不同，相似性較低，為什么？答：1)首先某一基因可能比較長(zhǎng)，但無參考基因組裝出的片段即Unigene很難組裝得到全長(zhǎng)，得到的是這個(gè)基因上的大小不等的片段，在進(jìn)行比對(duì)的時(shí)候就會(huì)比對(duì)到同一個(gè)基因上，

8、因此他們的注釋信息一致;2)從序列來看Unigene基因的序列相似度不高，但是因?yàn)楸葘?duì)的是蛋白，所以可能他們的蛋白相似度會(huì)比較高，因此會(huì)注釋到同一基因上。11transcript_id、gene_id、length、effective_length、expected_count、TPM、FPKM、IsoPct這幾個(gè)字段的意思？答：一個(gè)Unigene可能對(duì)應(yīng)多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。Transcript id：為組裝轉(zhuǎn)錄本編號(hào)；gene_id：Unigene編號(hào)；length：Unigene的長(zhǎng)度；effective_length：各個(gè)轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度；TPM：Transcripts per million，

9、公式為：Unigene 的reads數(shù)×106/總reads數(shù)；FPKM即RPKM（雙端Reads數(shù)目/（比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù)*轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度）；IsoPct：某一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量占相應(yīng)的組裝原件表達(dá)量的百分比。12同一ID下有多條序列，想得到此序列的核苷酸信息應(yīng)選哪一條？答：同一個(gè)ID號(hào)下面好幾條序列，這個(gè)應(yīng)該是組裝過程中裝出來的轉(zhuǎn)錄本序列，來自同一個(gè)Component（具體見Trinity組裝的第二步），其ID前綴相同，后面跟著seq+數(shù)字的編號(hào)。Trinity軟件認(rèn)為這些轉(zhuǎn)錄本來源于同一個(gè)基因，因此，選取其中最長(zhǎng)的那個(gè)轉(zhuǎn)錄本的序列作為該基因的序列。13生物云轉(zhuǎn)錄組APP上的差異

10、篩選閾值采用的是哪種方法？p值與FDR值的區(qū)別是？答：生物云轉(zhuǎn)錄組APP在差異表達(dá)分析過程中采用了公認(rèn)有效的Benjamini-Hochberg方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性p值（p-value）進(jìn)行校正，并最終采用校正后的p值，即FDR（False Discovery Rate）作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)，以降低對(duì)大量基因的表達(dá)值進(jìn)行獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)帶來的假陽性。p值與FDR之間沒有單純的換算公式，是在linux操作系統(tǒng)下，運(yùn)用R語言編寫的程序完成的fisher精確檢驗(yàn)，在篩選過程中，默認(rèn)將FDR<0.01且差異倍數(shù)（Fold Change）2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。14生物云轉(zhuǎn)錄組在分析

11、差異基因時(shí)，對(duì)于表達(dá)量為0的，如何計(jì)算差異倍數(shù)？答：差異基因分析軟件EBseq在分析表達(dá)量為0的基因的差異倍數(shù)時(shí)，會(huì)采用貝葉斯估計(jì)給出一個(gè)估計(jì)值，然后使用這個(gè)估計(jì)值計(jì)算差異倍數(shù)。由于計(jì)算估計(jì)值時(shí)綜合考慮多項(xiàng)因素，因此不同基因間FPKM和FC不具有一致性。15如何定義的已知micRNA、保守的micRNA以及新預(yù)測(cè)的micRNA?答：已知micRNA指的是序列在miRBase數(shù)據(jù)庫中百分百的比對(duì)到該物種的序列上，如果在該物種上沒有比對(duì)上但比對(duì)上了數(shù)據(jù)庫中的其他物種上我們稱之為保守的micRNA；新預(yù)測(cè)的micRNA：通過miRDeep2軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，有一定的read能夠比對(duì)到基因組上，并且比對(duì)位

12、置的序列可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，那么就會(huì)作為新預(yù)測(cè)的miRNA。16分析時(shí)發(fā)現(xiàn)不同的名，但是他們的前體序列和成熟序列都一樣，表達(dá)量在各個(gè)樣品中也相同，為什么？答：這個(gè)是由于在染色體上的位置不同導(dǎo)致的，可以參考miRBase數(shù)據(jù)庫中的 hsa-mir-1233-1 和 hsa-mir-1233-2 這兩個(gè) ID， 它們對(duì)應(yīng)的前體序列，3' 和 5' 成熟序列均相同，但在基因組上的位置不同，軟件將它們區(qū)別成兩個(gè)不同的小RNA，又因?yàn)樗鼈兊男蛄幸恢拢员葘?duì)上的reads是一樣的，表達(dá)量因此一樣。具體見下：17測(cè)序得到的lncRNA，如何知道哪些是已知的？哪些是未知的？答：目前長(zhǎng)鏈分析結(jié)果

13、中如果分析的物種是比較常見的物種比如人、大鼠、小鼠，這些物種具有比較完整的已知lncRNA數(shù)據(jù)庫，這種情況：(1)通過確切的位置關(guān)系（位置相交則認(rèn)為相同）對(duì)預(yù)測(cè)出來的那些lncRNA鑒定其是否為已知；(2)根據(jù)fa序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)預(yù)測(cè)出的lncRNA序列與數(shù)據(jù)庫中已知的lncRNA序列比對(duì)，達(dá)到一定比對(duì)值的會(huì)認(rèn)為該預(yù)測(cè)長(zhǎng)鏈?zhǔn)且阎拈L(zhǎng)鏈。注：NONCODE DB中包含的物種主要是動(dòng)物方面的，包括：人、小鼠、大鼠、奶牛、雞、果蠅、斑馬魚、線蟲、酵母、擬南芥、黑猩猩、大猩猩、恒河猴、復(fù)鼠、鴨嘴獸、猩猩 18轉(zhuǎn)錄組測(cè)序之后，用QPCR進(jìn)行驗(yàn)證，但驗(yàn)證的基因表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果中不一致，這是什么原因？如何

14、解決呢？答：首先，我們需要確定檢驗(yàn)的樣品是否是同一批次，驗(yàn)證樣品的上下調(diào)關(guān)系是否與測(cè)序結(jié)果中的一致（這個(gè)需要根據(jù)測(cè)序公司具體的分析結(jié)果，比如某個(gè)基因的FC值對(duì)應(yīng)的樣品寫的是T01 vs T02 ，那么T01就是對(duì)照組、T02是實(shí)驗(yàn)組），若樣品不為同一批次或其上下調(diào)關(guān)系顛倒了，則勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致驗(yàn)證基因表達(dá)趨勢(shì)不一致的情況。其次，我們需要查看驗(yàn)證基因的表達(dá)量、樣品和實(shí)驗(yàn)用的引物是否被污染，若驗(yàn)證基因表達(dá)量過低，則有可能導(dǎo)致差異不顯著，若樣品或?qū)嶒?yàn)用的引物被污染則后續(xù)結(jié)果可能也不會(huì)準(zhǔn)確，所以我們盡量不要挑選表達(dá)量太低的基因，同時(shí)，需要保證樣品和實(shí)驗(yàn)引物沒有被污染。當(dāng)以上所有情況都不存在，且結(jié)果依然不一致，這時(shí)我們需要檢查QPCR結(jié)果是否正確。如果僅一個(gè)基因驗(yàn)證結(jié)果不一致，則不足以說明測(cè)序或者驗(yàn)證有問題，但當(dāng)我們選擇了15個(gè)基因甚至更多時(shí)，結(jié)果依然不一致時(shí)，那么我們可能需要分析測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)果是否正確，同時(shí)檢查結(jié)果預(yù)期是否正確。19從NCBI上下載的數(shù)據(jù)都是SAR格式的，如何轉(zhuǎn)化成FASTQ格式？答使用軟件sra2fastq進(jìn)行轉(zhuǎn)