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1、第二章第二章 遺傳信息的傳送遺傳信息的傳送第二節(jié)第二節(jié) DNA生物合成生物合成 大腸桿菌的復制起點為大腸桿菌的復制起點為oriC,是由,是由245個堿基對組成,這些序列在大多數(shù)細菌個堿基對組成,這些序列在大多數(shù)細菌中是高度保守的,關(guān)鍵序列是三個中是高度保守的,關(guān)鍵序列是三個13bp和四個和四個9bp的反復序列。的反復序列。 四個四個9bp的反復序列的反復序列 dnaA結(jié)合位點結(jié)合位點 三個三個13bp的反復序列的反復序列 復制叉 (replication fork) 復制時雙鏈翻開,分開成兩股,新鏈沿著張開的模板生成,復制中構(gòu)成的這種Y字形的構(gòu)造稱為復制叉或生長點。35535353復制方向 單
2、向復制單向復制 雙向復制雙向復制 復制眼復制眼replication eye:電子顯微鏡下察看正在復制的:電子顯微鏡下察看正在復制的DNA,復制的區(qū)域形如一只眼睛。,復制的區(qū)域形如一只眼睛。復制的多方式復制的多方式 :單起點、一方向單起點、一方向原核原核多起點、一方向多起點、一方向真核真核單起點、雙方向原核單起點、雙方向原核多起點、雙方向真核多起點、雙方向真核 DNA復制的體系:復制的體系: 1.底物:底物:dNTP (dATP、dGTP 、 dCTP 、dTTP) ; 2.模板模板(template):解開成單鏈的:解開成單鏈的DNA母鏈;母鏈; 3.引物引物(primer):提供:提供3-
3、OH末端的寡核末端的寡核苷酸;苷酸; 4.聚合酶聚合酶(polymerase):依賴:依賴DNA的的DNA聚合酶,聚合酶, 簡寫為簡寫為DNA-pol; 5.其它的酶和蛋白質(zhì)因子其它的酶和蛋白質(zhì)因子1DNA聚合酶聚合酶(DNA polymetases)2引物酶引物酶(peimase)和引發(fā)體和引發(fā)體(primosome) :啟動:啟動RNA引物鏈的合成。引物鏈的合成。 (3DNA銜接酶銜接酶DNA ligase4DNA解螺旋酶解螺旋酶(DNA helicase) (5單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白(single-strand binding protein,SSB):結(jié)合在解開的:結(jié)合在解開的DNA
4、單鏈單鏈上,防止重新構(gòu)成雙螺旋。上,防止重新構(gòu)成雙螺旋。 (6拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)兼具內(nèi)切酶和銜接酶活力,能迅速將切酶和銜接酶活力,能迅速將DNA超螺超螺旋或雙螺旋緊張形狀變成松馳形狀,便旋或雙螺旋緊張形狀變成松馳形狀,便于解鏈。于解鏈。解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解鏈酶解鏈酶RNA引物引物引物酶和引物酶和引發(fā)體引發(fā)體DNA聚聚合酶合酶ISSB335355RNA引物引物 DNA聚合酶聚合酶 催化催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復制的主復制的主要酶。要酶。全稱叫依賴全稱叫依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶DNA depen
5、dent DNA polymerase或或DNA指指導的導的DNA聚合酶聚合酶DNA-directed DNA polymerase,均縮寫為,均縮寫為DDDP。 聚合反響機理:53OPGOPA模板鏈CTA35引物3355OHOPGOPAOOHTP模板鏈CTA35引物333555POOHTPP35 聚合反響的特點:聚合反響的特點:(1) 以單鏈以單鏈DNA為模板為模板(2) 以以dNTP為原料為原料(3) 引物提供引物提供3-OH(4) 聚合方向為聚合方向為53 2.核酸外切酶活性3 3 55 外切酶活性:外切酶活性:切除錯配的核苷酸切除錯配的核苷酸5 5 33 外切酶活性:外切酶活性:切除引
6、物切除引物 切除突變的片段切除突變的片段C T T C A G G AG A A G T C C G G C G5335 DNADNA聚合酶的種類聚合酶的種類1. 1. 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶pol-Ipol-Ipol-IIpol-IIpol-IIIpol-III5 5 33 聚合酶活性聚合酶活性+ + + +3 3 55 外切酶活性外切酶活性+ + + +5 5 33 外切酶活性外切酶活性+ +功功 能能切除引物切除引物填補空隙填補空隙修復合成修復合成修復修復復制的復制的主要酶主要酶 DNA-pol I:單一肽鏈的大分子含量最多可被水解成兩個片段小片段(N端):具有53
7、外切酶活性;大片段(C端):具有聚合活性和35 外切酶活性,也稱為Klenow片段,是常用的工具酶。 DNA-pol III:由10種亞基組成的不對稱聚合體催化效率最高 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶中的亞基中的亞基 亞基亞基 全酶中的亞基數(shù)全酶中的亞基數(shù) 分子量分子量 2 13200 2 27000 2 10000 2 71000 2 52000 1 35000 1 33000 1 15000 1 12000 4 37000中中心心酶酶銜接蛋白銜接蛋白滑動鉗滑動鉗復合物復合物 DNApol和和 DNApol 的主要特性和功能比較的主要特性和功能比較 1、 DNA聚合酶活性:兩者都有。聚合
8、酶活性:兩者都有。 條件模板、引物條件模板、引物 DNApol主要用于主要用于DNA 的修復和的修復和RNA引物的交換引物的交換 DNApol DNA鏈的延伸鏈的延伸 聚合方向:聚合方向: 535 OHT C AT C A C 5 OH 3ppp OH C+ ppi 3、 35 外切核酸酶活性:兩者都有。外切核酸酶活性:兩者都有。 校正功能校正功能(proofreading) 4、 53外切核酸酶活性:外切核酸酶活性: 只需只需DNApol具有。具有。 DNApol的的53外切活性有以下三個特點:外切活性有以下三個特點: 必需有必需有5磷酸末端磷酸末端 被除去的核苷酸必需是曾經(jīng)配對的被除去的核
9、苷酸必需是曾經(jīng)配對的 被除去的可以是脫氧核糖核苷酸,也可以是核糖被除去的可以是脫氧核糖核苷酸,也可以是核糖 核苷酸核苷酸 口口增殖細增殖細胞核抗胞核抗原原PCNA 解旋解鏈酶類解開并理順DNA雙鏈,維持DNA 處于單鏈形狀。主要有解螺旋酶、 DNA拓撲異構(gòu)酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白。 解螺旋酶解螺旋酶 (helicase) : 模板對復制的指點作用在于堿基模板對復制的指點作用在于堿基的準確的準確配對,而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。配對,而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只需把只需把DNA解開成單鏈,它才干起模解開成單鏈,它才干起模板作用。板作用。 解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復制有解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復制有關(guān)的蛋
10、關(guān)的蛋 白質(zhì),當時稱為白質(zhì),當時稱為rep蛋白。作用是利蛋白。作用是利用用ATP供供 能,解開能,解開DNA雙鏈。雙鏈。 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 (SSB) :在大腸桿菌,它是由在大腸桿菌,它是由177個氨個氨基酸殘基組成的同四聚體,結(jié)合基酸殘基組成的同四聚體,結(jié)合單鏈單鏈DNA的跨度約的跨度約32個核苷個核苷 酸單酸單位。位。SSB與解開的與解開的DNA單鏈嚴密單鏈嚴密結(jié)合,防止結(jié)合,防止 重新構(gòu)成雙鏈,并免受核酸酶降重新構(gòu)成雙鏈,并免受核酸酶降解。在復制解。在復制 中維持模板處于單鏈形狀。中維持模板處于單鏈形狀。 DNA拓撲異構(gòu)酶 (topoisomerase) : 拓撲:是指物體
11、或圖像作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。拓撲異構(gòu)酶:是一類可改動DNA拓撲性質(zhì)的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能銜接磷酸二酯鍵。松弛DNA超螺旋,有利于DNA解鏈。正超螺旋正超螺旋 正超螺旋為雙螺旋旋正超螺旋為雙螺旋旋轉(zhuǎn)過度,經(jīng)過分子整轉(zhuǎn)過度,經(jīng)過分子整體的左旋來解去過度體的左旋來解去過度的螺旋。的螺旋。分子整體右旋一圈來分子整體右旋一圈來補雙螺旋上的一圈補雙螺旋上的一圈缺乏。缺乏。 拓撲異構(gòu)酶Itopo I: 主要作用是切開DNA雙鏈中的一股,使 DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中不打結(jié),DNA變?yōu)樗沙?形狀再封鎖切口。 拓撲異構(gòu)酶II topo II: 在原核生物又叫旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)。能切斷DN
12、A雙鏈,使螺旋松弛。在ATP參 與下,松弛的DNA進入負超螺旋,再銜接 斷端。 正超螺旋正超螺旋負超螺旋負超螺旋Replication machineryreplicationPositive supercoilBreak DNATopoisomerase IIpass DNA through the breaknegative supercoil 引物酶和引發(fā)體引物酶 (primase):依賴DNA的RNA聚合酶。 催化RNA引物的合成。RNA引物:在DNA模板的復制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合,構(gòu)成短片段的RNA,為DNA 聚合提供3-OH末端。 引發(fā)體 (primosome): 是
13、由Dna B、Dna A、Dna C以及其他復制 因子一同構(gòu)成復合體,再結(jié)合引物酶構(gòu)成 較大的聚合體,結(jié)合到模板DNA上。 復制開場時,在引發(fā)體的下游解開雙鏈, 再由引物酶催化引物的合成。 復制相關(guān)蛋白質(zhì):復制相關(guān)蛋白質(zhì):Dna A、Dna B、Dna C Dna X Dna A:識別復制起始位點:識別復制起始位點 Dna B:解螺旋酶:解螺旋酶 Dna C:輔助解螺旋酶使其在起始點:輔助解螺旋酶使其在起始點上上結(jié)結(jié) 合并翻開雙鏈。合并翻開雙鏈。 DNA銜接酶DNA ligase 銜接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端,構(gòu)成磷酸二酯鍵,從而把兩段相鄰的DNA鏈銜接成完好的鏈。反響需求
14、ATP。 所需條件:所需條件: a、 切刻的切刻的 3OH 和和 5P 相鄰相鄰 b、 切刻各自堿基處于配對形狀切刻各自堿基處于配對形狀 c、 需求能量:需求能量: 原核原核ATP、NAD 真核真核ATP在復制中的用途:在復制中的用途:DNADNA鏈合成后引鏈合成后引物被切除,并被物被切除,并被DNADNA替代。此時替代。此時DNADNA鏈上仍存在缺口,鏈上仍存在缺口,DNADNA銜接酶銜接酶會催化構(gòu)成磷酸二酯鍵,將斷裂會催化構(gòu)成磷酸二酯鍵,將斷裂的缺口連上,構(gòu)成完好的的缺口連上,構(gòu)成完好的DNADNA鏈。鏈。銜銜接接酶酶銜銜接接切切口口Mg2+銜接酶銜接酶ATP或或NADPPi或或NMNAT
15、CGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板鏈模板鏈模板鏈模板鏈 DNA銜接酶在復制、DNA修復、 重組、剪接中均起縫合缺口作用。 是重要的工具酶之一。 1.DNA復制的起始:就是要解開雙鏈和生成引物。DNA解成單鏈 由拓撲異構(gòu)酶松弛超螺旋,解螺旋酶 解開雙鏈,SSB結(jié)合到單鏈上使其穩(wěn)定。 引發(fā)體引物酶的作用下在原點處合成一小段引發(fā)體引物酶的作用下在原點處合成一小段RNA引物引物10-60個堿基不等個堿基不等 。引物的合成方向。引物的合成方向也是也是53方向方向 ,然后由,然后由DNA聚合酶合成聚合酶合成D
16、NA鏈。鏈。前導鏈合成一個引物,滯后鏈斷續(xù)合成多個引物。前導鏈合成一個引物,滯后鏈斷續(xù)合成多個引物。 Dna ADna BDna CDNA拓異構(gòu)酶5335 2.復制的延伸 在DNA聚合酶催化下,以解開的 單鏈為模板,以四種dNTP為原料,進 行聚協(xié)作用。即新進入的 dNTP 與引物 3OH構(gòu)成磷酸二酯鍵,由53方向延伸子鏈。 535DNA-pol IIIdCTPdTTPdGTPdATPdTTPdCTPdATPdGTP 在在DNA復制中,復制中,DNA新鏈的合成是沿新鏈的合成是沿53的的方向進展的。由于方向進展的。由于DNA分子的兩條鏈是反向平行分子的兩條鏈是反向平行的,所以分別以兩條鏈為模板的
17、的,所以分別以兩條鏈為模板的DNA鏈的復制方鏈的復制方式是不同的。一條延續(xù)合成,另一條不延續(xù)合成。式是不同的。一條延續(xù)合成,另一條不延續(xù)合成。半不延續(xù)復制:半不延續(xù)復制:DNA的一條鏈復制以的一條鏈復制以35DNA母鏈為模板,母鏈為模板,DNA鏈的復制是沿鏈的復制是沿53的方向延續(xù)進展的,的方向延續(xù)進展的,稱為前導鏈。稱為前導鏈。另一條以另一條以53DNA母鏈為模板,母鏈為模板,DNA鏈的鏈的復制不能延續(xù)進展,稱為后隨鏈,后隨鏈的復制不能延續(xù)進展,稱為后隨鏈,后隨鏈的合成方向與前導鏈相反。合成方向與前導鏈相反。 前導鏈 (leading strand)順著解鏈方向生成的子鏈,其復制是延續(xù)進展的
18、,得到一條延續(xù)的子鏈。53355解鏈方向3 后隨鏈 (lagging strand) 復制方向與解鏈方向相反,須等解開足夠長度的模板鏈才干繼續(xù)復制,得到的子鏈由不延續(xù)的片段所組成。53355解鏈方向33553:k:z:ki:, .ukz:ki: 當雙鏈當雙鏈DNA解鏈后,前導鏈與后隨鏈分別解鏈后,前導鏈與后隨鏈分別被同一個被同一個DNA聚合酶聚合酶的不對稱二聚體所合成,的不對稱二聚體所合成,為保證二者聚合的方向一樣,后隨鏈必需繞成一為保證二者聚合的方向一樣,后隨鏈必需繞成一個突環(huán)。個突環(huán)。 一分子的一分子的 DNA pol III. 協(xié)同合成前導鏈和后隨鏈協(xié)同合成前導鏈和后隨鏈 DNA復制的半
19、不延續(xù)模型圖復制的半不延續(xù)模型圖3.3.復制的終止復制的終止 不延續(xù)片段的銜接3553RNA酶POH3553DNA聚合酶P3553dNTPDNA連接酶3553ATP原核細胞原核細胞DNADNA的半不延續(xù)復的半不延續(xù)復制過程制過程復制叉的復制叉的挪動方向挪動方向拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶DNA聚合聚合酶酶III解螺旋酶解螺旋酶RNA引物引物DNA聚聚合酶合酶ISSB335前導鏈前導鏈后隨鏈后隨鏈35復制的起始復制的起始DNADNA鏈的合鏈的合成與延伸成與延伸DNADNA鏈合成鏈合成的終止的終止5RNA引物引物33DNA銜銜接酶接酶復制忠實性的保證復制忠實性的保證 在大腸桿菌在大腸桿菌DNA的復制中,每
20、聚合的復制中,每聚合10 9到到1010個堿基才出現(xiàn)個堿基才出現(xiàn)一個錯誤,至少依賴四種機制:一個錯誤,至少依賴四種機制:控制復制起始的兩個根本元件:復制原點和起始子控制復制起始的兩個根本元件:復制原點和起始子復制原點:可以指點復制原點:可以指點DNA復制起始的整套順式作用復制起始的整套順式作用序列。序列。復制起始子:是特異性識別復制原點中一個復制起始子:是特異性識別復制原點中一個DNA元元件并激活復制起始的一些蛋白質(zhì)。件并激活復制起始的一些蛋白質(zhì)。 為保證一個細胞周期內(nèi)只發(fā)生一次為保證一個細胞周期內(nèi)只發(fā)生一次DNA復制,細胞內(nèi)存復制,細胞內(nèi)存在嚴厲的復制調(diào)控機制來協(xié)調(diào)染色體復制和細胞分裂的關(guān)系
21、。在嚴厲的復制調(diào)控機制來協(xié)調(diào)染色體復制和細胞分裂的關(guān)系。DNA復制獨一可以受調(diào)理的階段是:起始階段復制獨一可以受調(diào)理的階段是:起始階段 四個四個9bp的反復序列的反復序列 DnaA結(jié)合位點結(jié)合位點 三個三個13bp的反復序列的反復序列假設(shè)干假設(shè)干GATC位點位點NNNHNNH2l腺嘌呤腺嘌呤Adenine11 copies in oriC 復制復制Dam甲基化酶甲基化酶甲基化的甲基化的DNA半甲基化的半甲基化的DNA細胞膜抑制物與半甲細胞膜抑制物與半甲基化基化DNADNA的結(jié)合的結(jié)合DNADNA的再甲基化,并釋的再甲基化,并釋放細胞膜抑制物放細胞膜抑制物DnaA蛋白結(jié)合到蛋白結(jié)合到oriC核小
22、體核小體 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 、五種五種 位置位置 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 線粒體線粒體 RNA引物被引物被RNaseH和和MF-1核酸酶核酸酶5-3外外切酶除去后,切酶除去后,DNA聚合酶聚合酶相當于原核生物的相當于原核生物的DNA聚合酶聚合酶擔任填補缺口,然后由擔任填補缺口,然后由DNA銜接銜接酶銜接各個岡崎片段。酶銜接各個岡崎片段。 真核生物線性真核生物線性DNA分子中的前導鏈分子中的前導鏈RNA引物空引物空隙和后隨鏈的最后一個隙和后隨鏈的最后一個RNA引物空隙無法由引物空隙無法由DNA聚聚合酶進展填補,致使線性合酶進展填補,致使線性DNA分子每復制一
23、次,分子每復制一次,DNA分子將截短一些,所以大多數(shù)真核細胞不能無分子將截短一些,所以大多數(shù)真核細胞不能無限地分裂下去。限地分裂下去。 在無限增殖的細胞如生殖細胞、干細胞、癌在無限增殖的細胞如生殖細胞、干細胞、癌細胞中存在細胞中存在DNA末端補齊方式末端補齊方式 。原核細胞原核細胞DNADNA的半不延續(xù)復的半不延續(xù)復制過程制過程復制叉的復制叉的挪動方向挪動方向拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶DNA聚合聚合酶酶III解螺旋酶解螺旋酶RNA引物引物DNA聚聚合酶合酶ISSB335前導鏈前導鏈后隨鏈后隨鏈35復制的起始復制的起始DNADNA鏈的合鏈的合成與延伸成與延伸DNADNA鏈合成鏈合成的終止的終止5RNA引物引物33DNA銜銜接酶接酶 不延續(xù)片段的銜接3553RNA酶POH3553DNA聚合酶P3553dNTPDNA連接酶3553ATP (1) 端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度反復的末端序列高度反復的末端 由于真核生物染色體是線性由于真核生物染色體是線性DNA,它的兩端,它的兩端叫做端區(qū)。端區(qū)是由反復的寡核苷酸序列構(gòu)成的。叫做端區(qū)。端區(qū)是由反復的寡核苷酸序列構(gòu)成的。 不延續(xù)片段的銜接3553RNA酶POH3553DNA聚合酶P3553dNTPDNA連接酶3553ATPG鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGT
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