題目食品致病微生物最新檢測(cè)方法介紹

1、題目：食品致病微生物最新檢測(cè)方法介紹組員：洪碩蓮、黃建元、楊至平、閻瑩潔 食品及其相關(guān)加工品容易受到食品病原細(xì)菌的污染，而造成食物中毒，而快速鑑別有害細(xì)菌的方法，可用以加強(qiáng)檢驗(yàn)的工作及避免食品中毒事件發(fā)生。食品中主要之污染細(xì)菌種類，包括有 Citrobacter spp. ,Clostridium spp., Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, E. coli（含E. coli O157:H7及其他病原性大腸桿菌），Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholera,Staphylococcus aureus, Salm

2、onella spp.包括Salm. Typhimurium, Salm. Enteritidis, Salm. Typhi, Salm. Choleraesuis, Pseudomonas spp., Campylobacter spp., Clostridium spp., Shigella spp.等；傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括有預(yù)培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)、生化型鑑定及血清型鑑定等，常需時(shí)數(shù)天，因此快速檢測(cè)方法相當(dāng)重要。 由食品污染所引起的疾病已在許多發(fā)展中國(guó)家受到注意，以臺(tái)灣地區(qū)為例，根據(jù)行政院衛(wèi)生署民國(guó)70年至93年，對(duì)臺(tái)灣地區(qū)食品中毒事件案例之統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，排行前六名依序?yàn)?腸炎弧菌(Vibr

3、io parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、仙人掌桿菌 (Bacillus cereus)、沙門氏菌(Salmomella spp)、病原性大腸桿菌(pathogenic E. coli)以及肉毒桿菌(Clostridium botulinum)。於歐美國(guó)家，由沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌所引起之食物中毒案件急速增加，而在日本，由沙門氏菌、腸炎弧菌及仙人掌桿菌所引起之食物中毒案件亦受到相當(dāng)?shù)闹匾暋Ｒ虼?，為了有效的快速檢測(cè)可能存在的食品病原菌，開(kāi)發(fā)食品病原菌快速檢驗(yàn)法對(duì)目前從事食品檢驗(yàn)研究者十分重要。更由於食品中毒樣品或檢體中，其中可能包

4、含至少一種以上之病原菌，因此如何找到一種可以同時(shí)、快速、方便的方法來(lái)進(jìn)行多種不同病原菌之鑑定或檢測(cè)相當(dāng)?shù)闹匾?近年來(lái)，利用DNA 探針及其相關(guān)技術(shù)所發(fā)展的微生物快速檢測(cè)方法，如P C R方法；P C R fingerprinting、multiplex-PCR、DNA定序法、PCR-RFLP (Polymerase chain reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism)、RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA)、gene-specific probe hybridization、ribot

5、yping 等方法已陸續(xù)用於病原菌的檢測(cè)之用。然而，這些方法所面臨的重要問(wèn)題是如何克服面臨大量樣品時(shí)的操作方便性，以及同時(shí)能否鑑別不同種屬的菌株等問(wèn)題。以PCR方法為例，目前所發(fā)展的PCR技術(shù)的缺點(diǎn)是對(duì)於不同的目標(biāo)基因或目標(biāo)菌必須要用不同的引子組來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在目標(biāo)菌種不明確時(shí)，進(jìn)行較為因難，例如，如何選擇適當(dāng)?shù)囊咏M；即是一個(gè)問(wèn)題。因此必須發(fā)展更新更靈敏的檢測(cè)方法，供作快速篩檢多種目標(biāo)菌之用。利用高密度的基因晶片技術(shù)為解決此一問(wèn)題最好的方法，微生物檢測(cè)用的生物晶片，即利用晶片上每一菌種具有專一性的DNA片段，作為探針，亦作為不同菌種鑑定及檢測(cè)之用。而DNA序列的差異可分為不同等級(jí)，利用不同等級(jí)

6、的差異可鑑定出分屬不同科、屬、種的菌株。每一種細(xì)菌在晶片上具有不同的DNA雜交圖譜，藉由不同的雜交圖譜，來(lái)鑑定不同的病原菌，因此只要利用同一張晶片便可以鑑定不同細(xì)菌的屬、種。生物晶片相較於傳統(tǒng)分子生化分析方法的主要特點(diǎn)是能夠同時(shí)快速、大量的處理樣品，縮短在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)或試驗(yàn)時(shí)間，而且它的可信度及精確性高、分析速度快，同時(shí)又可獲得大量整體性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。生物晶片能在短時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)不同病原菌或不同基因的測(cè)試，且對(duì)食品病原菌及疾病的診斷相當(dāng)有效。生物晶片有幾種型式，例如寡核N酸晶片、基因微陣列、蛋白質(zhì)晶片、抗體晶片與微流體晶片等，這些不同的晶片各有其應(yīng)用的相關(guān)研究，而其原理也大致相同。食品病原性

7、微生物檢測(cè)用晶片上探針的設(shè)計(jì)常利用23S、16S與ITS的DNA片段上序列之差異，這些片段的末端與23S 的前端具有保留區(qū)域，利用此二個(gè)保留區(qū)可來(lái)增殖ITS片段，不同的食品病原菌其ITS序列有差異，因而可利用此一片段作為設(shè)計(jì)不同屬(genus)或種(species)的細(xì)菌檢測(cè)用DNA晶片的探針。將這些探針以寡核N酸探針的形式放置在所設(shè)計(jì)的微陣列上，並依據(jù)親源關(guān)係的遠(yuǎn)近做為晶片安排上的設(shè)計(jì)方式。而不同的種類的病原菌株，除了專一性的探針之外，也可根據(jù)其部分專一，但非絕對(duì)專一性之探針，在不同的參考點(diǎn)之雜交訊號(hào)，來(lái)提供作為特定菌株之確認(rèn)。另一方面，亦可採(cǎi)用以隨機(jī)引子放大(random primeram

8、plification)之方式來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)菌株之DNA，再與晶片上不同目標(biāo)基因設(shè)計(jì)之不同菌株之特異性探針雜交，取得雜交訊號(hào)，同時(shí)供多種不同病原菌之檢測(cè)。而在晶片設(shè)計(jì)上所會(huì)遇到的困難，包括如何設(shè)計(jì)為數(shù)眾多的專一性探針，如何使晶片上各不同探針的反應(yīng)黏合溫度保持一定，也要有標(biāo)準(zhǔn)的方法；此外，所採(cǎi)用的雜交呈色方法包括雜訊、雜交敏感度等，也必需要考量。 生物晶片乃是將大量的各種探針排列在一小片固相基質(zhì)(solid phase)上，使研究者能利用生物晶片雜交後的圖譜以及訊號(hào)的強(qiáng)弱，使研究者能以巨觀的方式提出對(duì)策。因此這種利用Microarray技術(shù)將成千上萬(wàn)的生物訊息密碼，在一片固相基質(zhì)的，就如同可儲(chǔ)存大量

9、資料的電腦晶片，就被稱作生物晶片(Microarray or Biochip)。 生物晶片技術(shù)是將探針（通常是DNA或complementary DNA(cDNA)），以高密度點(diǎn)陣技術(shù)將DNA或cDNA固定排列在經(jīng)除孔處理過(guò)的玻璃(non-porous glass slide)、帶正電的尼龍紙片(nylon membrane)、或表面經(jīng)過(guò)特殊處理之塑膠片 (plastic membrane)及其他固態(tài)基質(zhì)的表面上，而受測(cè)的樣本則是標(biāo)的物與其互補(bǔ)的探針做雜交。樣本中標(biāo)的核酸，會(huì)與cDNA 微點(diǎn)陣上含有互補(bǔ)的核酸序列的探針的點(diǎn)進(jìn)行雜交；再經(jīng)過(guò)一連串的清洗將沒(méi)有雜交的樣本核酸去掉，然後進(jìn)行數(shù)據(jù)的判讀

10、，如此就可以記錄下有雜交反應(yīng)點(diǎn)的位置，也只需要一次的實(shí)驗(yàn)cDNA微點(diǎn)陣技術(shù)就能夠?qū)⒊汕先f(wàn)的基因表現(xiàn)的樣式(gene expression patterns)記錄下來(lái)。一、微生物基因體與生物晶片 微生物與人類的生活關(guān)係密切，生活的食物、水、土壤及環(huán)境中，微生物無(wú)所不在。甚至在極端環(huán)境中，亦有微生物的蹤跡。目前在微生物的基因體研究中，已完成定序工作的微生物共有235 株（bacteria complete chromosome, 226 株及fungi complete genome, 9 株）（至2005 年6 月14 日止）。其中不乏環(huán)境微生物，食品用微生物及人類病原菌。在病原菌的研究中，例

11、如會(huì)引起胃炎之致病菌(Helicobater pyroli) (Accession No. NC_000915 及NC_000921)的基因體已完成定序，並進(jìn)行基因的註解。而在原生保健性菌種中，亦有已完成的基因體定序工作的乳酸菌，包括Lactobacillus acidophilus (Accession No.NC_006814)、Lactobacillus plantarum(Accession No. NC_004567)、Streptococcus thermophilus (Accession No. NC_006449 及NC_006448)。酵母菌 (Saccharomyces

12、cerevisiae)的基因體研究極早，其完整的序列已收錄在公開(kāi)的資料庫(kù)中，目前已有以酵母菌作為DNA生物晶片，其目的不在疾病偵測(cè)，而是在醫(yī)藥生技領(lǐng)域之應(yīng)用。 重組蛋白藥物許多是利用基因工程技術(shù)，藉由酵母菌的發(fā)酵生產(chǎn)。該酵母菌的DNA晶片用於研究基因表現(xiàn)的差異，以有效的控制發(fā)酵製程，縮短發(fā)酵時(shí)間，尋找適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，減少發(fā)酵成本。在酒類發(fā)酵的製程中，酵母菌代謝的研究可決定風(fēng)味的變化，監(jiān)測(cè)及控制酒精發(fā)酵的能力。二、生物晶片主要核心技術(shù) 生物晶片研究在國(guó)際上已有相當(dāng)成果，如基因晶片 (Gene chip, DNA chip or Microarray)、蛋白質(zhì)晶片 (protein chip)、微

13、流體晶片 (Microfluidics) 及晶片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)等之設(shè)計(jì)與應(yīng)用。基因晶片依DNA樣品製備的方式不同主要可分為二種。第一種是Affymetrix 公司研發(fā)出的光學(xué)蝕刻法 (photolithography) 與化學(xué)合成法相結(jié)合的光引導(dǎo)原位合成法 (light-directed synthesis)。第二種是美國(guó)Stanford 大學(xué)所使用的接觸式點(diǎn)樣法，係利用生物晶片點(diǎn)陣儀將預(yù)先合成好的DNA或PCR products，快速及高密度的固定到載體上，這種高密度整齊排列的晶片，稱為生物晶片技術(shù)(Microarray technology)。基因微矩陣技術(shù)是將探針，

14、通常是將數(shù)千或數(shù)萬(wàn)個(gè)DNA或cDNA，以高密度點(diǎn)陣固定在經(jīng)表面化學(xué)塗布處理過(guò)的玻璃等固態(tài)載體表面上，而受測(cè)的樣品則是cDNA 標(biāo)的核酸，再將玻璃片與樣品進(jìn)行雜交試驗(yàn)。 由於DNA為雙股螺旋結(jié)構(gòu)具有互補(bǔ)的專一特性，樣本中的標(biāo)的核酸，會(huì)雜交固定在cDNA 微點(diǎn)陣玻璃上含有互補(bǔ)的核酸序列的探針的點(diǎn)；再經(jīng)過(guò)清洗將沒(méi)有雜交的樣本核酸去掉，就可以記錄下有雜交反應(yīng)的點(diǎn)的位置，將成千上萬(wàn)的基因表現(xiàn)的樣式記錄下來(lái)。由於生物晶片上含有上千至萬(wàn)的基因樣點(diǎn)，並可偵測(cè)到極微細(xì)的細(xì)胞內(nèi)變化，甚至一個(gè)細(xì)胞內(nèi)少數(shù)幾個(gè)mRNA的改變，使得研究者能透過(guò)晶片上的數(shù)據(jù)得整體性訊息。對(duì)於極少量或不易取得的樣品的研究，生物晶片是唯一可提

15、供大量資料的途徑。三、蛋白質(zhì)晶片 (Protein Chip) 由於基因晶片技術(shù)漸趨成熟，基因功能研究將可迅速展開(kāi)，而我們知道生物體內(nèi)的基因表現(xiàn)與蛋白質(zhì)表現(xiàn)並不是完全相同。因此，蛋白質(zhì)組 (Proteomics)的研究將成為生物晶片的下一步重要課題。但如同基因晶片一樣，蛋白質(zhì)晶片一樣能提供快速且整體性的分析，應(yīng)用於protein-protein interactions, protein-small molecular interactions及 protein-substrate reactions 。若蛋白質(zhì)晶片能開(kāi)發(fā)成功，進(jìn)而取代傳統(tǒng)的臨床檢驗(yàn)方法，將會(huì)為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的數(shù)百億商機(jī)。理

16、論上，蛋白質(zhì)晶片的製備方法與基因晶片方法相似，差異處只是將作用對(duì)象改為蛋白質(zhì)，即生物晶片上的樣品和實(shí)驗(yàn)樣品皆為蛋白質(zhì)。但在實(shí)際的應(yīng)用上卻遇到相當(dāng)困難的問(wèn)題：1.蛋白質(zhì)取得不易、2.蛋白質(zhì)容易失活、3.載體製作不易、4.不容易維持晶片上蛋白質(zhì)的生物活性、5.晶片與受測(cè)檢體間的最佳反應(yīng)條件不一定相同。蛋白質(zhì)若不謹(jǐn)慎處理，容易產(chǎn)生斷裂或變性，而由於每種蛋白質(zhì)有其不同的物理、化學(xué)性質(zhì)，有些蛋白質(zhì)易黏附於載體，某些則不容易，因此在載體的選擇與載體表面處理上將有相當(dāng)多的問(wèn)題，另外蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)(protein's conformation)會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能，且蛋白質(zhì)對(duì)所處環(huán)境要求敏

17、感，它們有可能在不同相(phase)之間發(fā)生變化。因此蛋白質(zhì)晶片仍然有許多問(wèn)題需要解決。四、晶片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip) 生物晶片發(fā)展的最終目標(biāo)是要將樣品製備，化學(xué)反應(yīng)到結(jié)果檢測(cè)的整個(gè)分析過(guò)程集成化在一個(gè)晶片上，以獲得所謂的微型全分析系統(tǒng) (Micro total analytical system) 或新縮微晶片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-Chip)。Lab-on-a-Chip係利用晶片處理微量液體，由l甚至是nl體積於微流體晶片中，透過(guò)微機(jī)電的技術(shù)，以機(jī)械式或非機(jī)械式之幫浦，使生物分子在微管道內(nèi)混合、分離、培養(yǎng)、加熱、PCR等實(shí)驗(yàn)室所用的反應(yīng)。其目的在於將實(shí)驗(yàn)儀器微小化，製作晶片

18、實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-chip)。譬如：DNA定序儀、基因擴(kuò)大反應(yīng)儀、自動(dòng)免疫測(cè)定儀、毛細(xì)管電泳儀、高壓液相層析儀、手提環(huán)境監(jiān)測(cè)儀器、生物武器檢測(cè)儀等，均是體積龐大的機(jī)器設(shè)備。未來(lái)利用微流體晶片來(lái)加以微型化，整合若干微管道及微反應(yīng)器於一塊晶片上，把這些大機(jī)器的功能縮小到像郵票一樣的大小，以完成各種樣品的處理、反應(yīng)或分析檢測(cè)，功能類似一個(gè)實(shí)驗(yàn)室之縮影。 微流體晶片不僅可以使設(shè)備縮小攜帶方便，更能節(jié)省實(shí)驗(yàn)試劑和樣本，增加實(shí)驗(yàn)的效率。目前，已有幾種Lab-on-a-Chip 的產(chǎn)品成功上市，如Agilent Technology 公司研發(fā)出的2100 Bioanalyzer、 5100 Auto

19、mated Lab-on-a-Chip (ALP)、HPLC-Chip 等可用於分析DNA、RNA、蛋白質(zhì)或已標(biāo)誌化的DNA 。然而，上述之生物晶片主要係對(duì)少數(shù)病原菌的genus 加以區(qū)分鑑定，若目標(biāo)基因不以16S rRNA 基因?yàn)橹鳎瑒t可擴(kuò)大可檢測(cè)的微生物的種類，檢測(cè)層次可到達(dá)不同species之區(qū)分，基本上需以不同病原菌特有之基因，包括特定蛋白質(zhì)酵素、毒素、纖毛等基因探針之晶片，分別設(shè)計(jì)晶片上的探針，或能解決多種bacteria species區(qū)分鑑定之問(wèn)題。於此，目前亦已發(fā)展出針對(duì)不同食品病原菌之特異性的DNA探針，佈放於玻璃、塑膠、nitrocellulose paper、微流體生物晶

20、片等晶片材質(zhì)上，並應(yīng)用於螢光標(biāo)誌DNA之雜交，依此原理將可設(shè)計(jì)出的生物晶片可用於食品、農(nóng)畜水產(chǎn)品微生物檢測(cè)工作。以random primer、whole genome amplification、PCR等方法擴(kuò)增並標(biāo)幟目標(biāo)菌之DNA，進(jìn)行雜交工作，此法除需依賴高感度的Cy3或Cy5螢光源外，另需昂貴的螢光掃瞄判讀儀器設(shè)備，成為目前食品生物晶片商業(yè)化之技術(shù)的瓶頸。另一方面，如可改以成本較為低廉的呈色檢測(cè)方法，將可將生物晶片普遍化，但因目前其檢測(cè)靈敏度仍不足，實(shí)驗(yàn)部分尚待進(jìn)一步研發(fā)。另一方面，有關(guān)微生物抗生素耐性基因檢測(cè)用的生物晶片，目前亦頗受重視，此類晶片所得之檢測(cè)結(jié)果與抗生素耐性測(cè)試之結(jié)果，相

21、符性頗高，例如生物晶片技術(shù)目前已成功應(yīng)用在抗藥性及毒性基因之檢測(cè)方面，研究利用PCR產(chǎn)物作為探針，發(fā)展檢測(cè)23種抗藥性基因與25種毒性基因檢測(cè)用之晶片，並有效且快速檢測(cè)Salmonella及E. coli菌株。造成國(guó)內(nèi)發(fā)生食物中毒之前五大病原菌分別為腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、仙人掌桿菌(Bacillus cereus)及病原性大腸桿菌(Pathogenic Escherichia coli)。其中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及病原性大腸桿菌等，亦為禽畜重要的病

22、原菌。此外，彎曲桿菌(Campylobacter spp.)、E. coli O157:H7 及 Listeria monocytogenes，也是國(guó)際間相當(dāng)重視的病原微生物。而快速鑑別這些有害細(xì)菌技術(shù)的研發(fā)，將是杜絕食品中毒與禽畜疫病防治之重要課題。目前國(guó)內(nèi)已有生物晶片公司上市，其中對(duì)於食品及家畜病原菌方面，竹南科學(xué)園區(qū)的晶宇生物科技公司已發(fā)展出相關(guān)檢測(cè)型生物晶片套組商品，目前的產(chǎn)品，包括有食品晶片(Dr. Food Kit)、牛乳晶片(Dr. Milk Kit)、腸病毒生物晶片(Dr. EV Kit)等，目前正積極的開(kāi)發(fā)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中。在國(guó)外相關(guān)生物晶片發(fā)展方面，全美有數(shù)家生物晶片生產(chǎn)公司，

23、如Affymetrix 公司、Illumina 公司、Nanogen 公司等。其中Affymetrix 公司為全美第一家發(fā)展生物晶片技術(shù)的公司，該公司擁有相當(dāng)多生物晶片製造技術(shù)的專利權(quán)。許多其他的生物晶片的生技公司，若需採(cǎi)用類似的製作技術(shù)時(shí)，都必須獲得Affymetrix 公司之授權(quán)。Nanogen公司則一直致力於發(fā)展電子式的生物晶片的技術(shù)，其乃是利用電子吸引力的原理，使得該生物晶片在做雜交時(shí)只需要15秒就可以完成。而Illumina公司的技術(shù)是將DNA片段放在一個(gè)個(gè)非常細(xì)微的小珠上，而晶片上則設(shè)計(jì)一個(gè)個(gè)只能放一個(gè)小珠的凹槽。由於這項(xiàng)設(shè)計(jì)，所以使Illumina公司的DNA晶片成為目前面積最小

24、，密度最高的生物晶片。就Affymetrix公司所發(fā)展之微生物檢測(cè)生物晶片而言，其所發(fā)展之生物晶片則可利用於多重病原性微生物、生物恐怖微生物之檢測(cè)，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬（如Streptococcus pyogenes）、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)等之檢測(cè)工作。 至於在相關(guān)微生物生物晶片之論文發(fā)表，則不勝枚舉，國(guó)內(nèi)方面，相關(guān)於食品病原菌檢測(cè)，則有2006年成功大學(xué)醫(yī)技系張長(zhǎng)泉教授利用微生物之ITS序列設(shè)計(jì)出共通引子組與DNA探針，完成可同時(shí)檢測(cè)多種食品病原菌之寡核N酸生物晶片，以及弘光科技大學(xué)於2006年發(fā)表的以16 rRNA所設(shè)計(jì)之寡核N酸生物晶片等。在工研院方面，近年來(lái)亦有所謂發(fā)燒晶片的研發(fā)，惟尚未商業(yè)化，另在中國(guó)大陸，利用生物晶片檢測(cè)致病菌的研究亦早已開(kāi)始，專業(yè)的書籍亦已出版。生物晶片技術(shù)目前已應(yīng)用於基因表現(xiàn)的檢測(cè)、微生物之鑑定、微生物毒性基因之檢測(cè)及Salmonella 血清型分型等，亦有相關(guān)文獻(xiàn)應(yīng)用於多種病原菌抗藥性基因之檢測(cè)，如erythromycin、quinolone類、tetracycline、rifampin及 -lactams 等抗微生物製劑相關(guān)之抗藥性基因進(jìn)行檢測(cè)等。本研究室亦已開(kāi)發(fā)出快速的方法檢測(cè)Salmonella Enteritidis 、Salmonella Typhimurium 及Salmonella Chole