生物技術(shù)綜合試驗(yàn)終稿

1、精品文檔生物技術(shù)綜合試驗(yàn)?zāi)康模褐饕峭ㄟ^本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生受到嚴(yán)格的基因工程和分子生物學(xué)等技術(shù)實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練，熟悉現(xiàn)代生物技術(shù)儀器的基本操作使用和應(yīng)用范圍，加深對(duì)生物技術(shù)系列相關(guān)課程基本理論、基本技術(shù)原理的理解認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的小量提取實(shí)驗(yàn)二、雙酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)三、PET28-a質(zhì)粒載體的膠回收實(shí)驗(yàn)四、引物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)五、目的片段的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)六、PCR產(chǎn)物的雙酶切反應(yīng)實(shí)驗(yàn)七、PCR產(chǎn)物的膠回收實(shí)驗(yàn)八、目的片段OMP31、BLS與PET28-a載體的連接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)九、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)十、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十一、菌落PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)十二、IPTG誘導(dǎo)OMP31和BLS融

2、合基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)十三、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用試劑盒提取質(zhì)粒DNA的技術(shù)2、掌握用分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度的方法二、基本原理在染色體外能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺產(chǎn)的遺傳因子稱為質(zhì)粒，大小在1kb-200kb之間，是雙鏈閉合環(huán)狀的DNA分子。在細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在，其中細(xì)菌質(zhì)粒存在最為普遍，在基因工程中常用作基因載體。堿變性法又稱堿抽提法或堿裂解法，是一種用的最廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，此法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，

3、雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)分離。當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)起pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。三、儀器、材料和試劑1 .儀器：微量移液器、微量離心管（又稱Eppendof管）、常用玻璃器皿、臺(tái)式高速離心機(jī)、分光光度計(jì)2 .材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a3 .試劑及溶液：LB培養(yǎng)基、葡萄糖養(yǎng)基、葡萄糖質(zhì)粒小提試劑盒操作步驟1 質(zhì)粒DNA的提取1） 培養(yǎng)細(xì)菌：將帶有

4、質(zhì)粒的單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37oC，200r/min,過夜震蕩培養(yǎng)；2）柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL,12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請(qǐng)使用當(dāng)天處理過的柱子）3）取過夜培養(yǎng)白細(xì)菌培養(yǎng)液3mL于Eppendof管中，轉(zhuǎn)速12000r/min離心1min,去掉上清夜,用濾紙吸干；4）向留有菌體沉淀的離心管中加入250ul溶液P1（確保已加入RNaseA）,用槍頭混勻；5）向離心管中加入250膜溶液P2,溫和上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。6）向離心管中加入350仙l溶液P3,立即溫和上下翻轉(zhuǎn)6-

5、8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。7）將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）盡量不要吸出沉淀。12000rmp離心30-60S,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。8）向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW（加入無水乙醇），12000rmp離心30-60S,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。9）重復(fù)步驟8。10）將吸附柱CP3放入收集管中，12000rmp離心2分鐘，目的是將吸附柱中的殘留的漂洗液去除。11）將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間部位滴加50-1

6、00U1洗脫緩沖液EB,溫室放置2分鐘，12000rmp離心2分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。2用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度五、問題討論（1）提取質(zhì)粒DNA有多種方法，所有這些方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)胞楨質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。可采用溶菌酶破壞菌體細(xì)胞壁，SDS（十二烷基硫酸鈉）可使細(xì)胞壁裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS處理后，在堿性條件下細(xì)菌染色體DNA和質(zhì)粒DNA都變性，而當(dāng)加入乙酸鉀在中性條件下，巨大的染色體DNA分子難以復(fù)性，而質(zhì)粒DNA很快得以復(fù)性，離心時(shí)染色體DNA與細(xì)胞碎片一起被沉淀下來，而質(zhì)粒DNA則留在上清夜中，用異丙醇或乙醇沉淀后洗滌，可得到質(zhì)粒DNA

7、。（2）利用核酸的紫外吸收測(cè)定核酸濃度的光學(xué)定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。組成核酸的五種堿基（G,A,T,C,U）均在260nm處有強(qiáng)吸收峰，正是利用這一強(qiáng)吸收峰而對(duì)核酸進(jìn)行定量的。堿基的種類不同，最大吸收波長(zhǎng)以及吸光系數(shù)不同，即使是相同堿基，也會(huì)隨pH的變化，吸光系數(shù)也會(huì)產(chǎn)生變化，一般在中性附近進(jìn)行測(cè)定。采用本法能夠?qū)兌容^好的核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，對(duì)純度不高的樣品，因?yàn)樘呛偷鞍踪|(zhì)均具有紫外吸收，常會(huì)產(chǎn)生定量不準(zhǔn)的結(jié)果。另外純化核酸所用的試劑如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量時(shí)需注意，特別是苯酚有很強(qiáng)的吸收，用苯酚處理過的樣品定量時(shí)要特別的小心。核酸樣品在260nm和280n

8、m波長(zhǎng)下均有一定的光吸收值。如果比較純的核酸樣品，其OD260/OD280是固定的，對(duì)DNA樣品而言其值大約為1.82.2,如高于2.2則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染，因此可用測(cè)定樣品OD260/OD280的方法來分析核酸樣品的純度。六、試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算并記錄你所提取的質(zhì)粒DNA的濃度和純度。實(shí)驗(yàn)二、雙酶切反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握雙酶切反應(yīng)的基本原理2 .掌握雙酶切反應(yīng)獲得質(zhì)粒載體的基本方法二、實(shí)驗(yàn)原理DNA酶切一般分為質(zhì)粒直接酶切和PCR產(chǎn)物酶切。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類：1類、II類

9、、田類。I類和田類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。II類由兩種酶組成：一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）,它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。II類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了精品文檔精品文檔廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)II類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核甘酸的回文對(duì)稱特異核甘酸序列。DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí)，會(huì)影響其進(jìn)一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí)，每次都要用新的吸

10、管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70C低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)一獲得的PET28a質(zhì)粒載體實(shí)驗(yàn)試劑：EcoRI、XhoI、10xHbuffer、滅菌水、冰、37c水浴四、雙酶切反應(yīng)體系（20口Hbuffer(10x)2nL1NLEco

11、RI1NL0.51iLXhoI1NL0.51iLDNA4nL5nLddH2O12L3nLTotal2010L五、實(shí)驗(yàn)步驟1）將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorfff（最好0.5ml）編號(hào)，用微量移液槍按照體積京大到小的順序加入上述溶液，再加入重蒸水使總體積為18卜J2）將管內(nèi)溶液混勻后加入2仙酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，要防止錯(cuò)加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時(shí)間，以免活性降低。3）混勻反應(yīng)體系后，將eppendorft置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?7C水浴保溫2-3小時(shí)，使酶切反應(yīng)完

12、全。4）每管加入2卜l0.1mol/LEDTA（pH8.0），混勻，以停止反應(yīng)，置于冰箱中保存?zhèn)溆?。注：將加好的反?yīng)體系放入37。叵溫水浴鍋中反應(yīng)。如果是載體，則反映時(shí)間為56h,如果是DNA則反應(yīng)時(shí)間是12h。附：(A)(B)(C)BamHIHindmr1xKEcoRIHindm1xmEcoRIBamHIr1xKBamHIXhoI1xKHindmXhoI1xm實(shí)驗(yàn)三、PET28-a質(zhì)粒載體的膠回收一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握瓊脂糖凝膠的制備方法2 .掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的方法3 .掌握DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒的使用二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的

13、目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。電泳過程中或電泳完畢，直接利用低濃度的熒光染料EB（澳化乙錠）進(jìn)行染色，EB可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基當(dāng)中，在紫外激發(fā)下，發(fā)出熒光，即可確定DNA條帶在凝膠中的位置而且靈敏度很高，少知170ng的DNA條帶即可直接在紫外燈下檢出。不同濃度的瓊脂糖凝膠的分離范圍凝膠中的瓊脂糖含量（）線犬DNA分子的有效分離范圍（Kb）0.35600.61200.70.8100.90.57.01.20.46.0

14、1.50.23.02.00.12.0瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠試劑盒回收酶切產(chǎn)物。試劑盒中有一個(gè)特制的Column,將硅膠填制到這個(gè)特制的管中，利用硅膠在高鹽低PH下吸附DNA,在低鹽和高PH的條件下DNA可以再次被洗脫的原理，進(jìn)行DNA的回收和純化。三、主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑主要儀器：電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、水浴鍋、微波爐、離心機(jī)等。主要實(shí)驗(yàn)試劑：1、50>TAE（2MTris,1M醋酸，50mMEDTA（pH8.0）2、10Xt樣緩沖液（loadingbuffer）3、分子量標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker4、瓊脂糖5、EB（澳化乙錠）（黑暗保存）6、DNA回收純化試劑盒（AxyPrep

15、DNA凝膠回收試劑盒）四、實(shí)驗(yàn)步驟瓊脂糖凝膠的制備:1、將洗凈的電泳槽洗凈，置于平整的臺(tái)面上，并調(diào)節(jié)水平；2、用1XTAE電泳緩沖液配制0.8%的瓊脂糖，微波爐加熱使其溶解；3、待瓊脂糖溶液冷卻至60°C左右時(shí)，緩緩將瓊脂糖倒入膠模中，厚度約5至7mm；4、插入梳子，靜待瓊脂糖凝固；5、將膠模放進(jìn)電泳槽中，向電泳槽倒入1XTAE電泳緩沖液，沒過膠約5mm；6、小心拔掉梳子，用20ul移液器吸取DNA溶液（20ulDNA力口23ul10xloadingbuffer）,緩緩加入點(diǎn)樣孔；并在最右邊的點(diǎn)樣孔加6ulDNAMaker；7、接通電源，（注意電源的正負(fù)極?。╇娪局翖l帶前緣到達(dá)膠的2

16、/3左右，約2030分鐘；8、電泳完畢，關(guān)閉電源。從膠模中取出瓊脂糖凝膠，放入EB染色液中，染色6-8min,然后置于紫外燈下觀察。酶切產(chǎn)物凝膠回收：1、在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，計(jì)算凝膠重量。（100mg凝膠，計(jì)100ul體積）（盡量縮短暴露UV燈下的時(shí)間?。?、加入3個(gè)凝膠體積的BufferDE-A（600ul）,混合均勻后，于65°C加熱，直至凝膠完全熔化。3、力口0.5個(gè)BufferDE-A體積的BufferDE-B（300ul），混合均勻，當(dāng)分離的DNA片段小于400bp時(shí)，加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇。4、吸取3中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管（置于2ml離心管

17、中），12000r/min離心1min,棄濾液。5、將制備管置回2ml離心管中，力口500ulBufferW1,12000r/min離心30seG棄濾液。6、將制備管置回2ml離心管中，力口700ulBufferW2,12000r/min離心30seG棄濾液。重復(fù)一次。7、將制備管置回2ml離心管中，12000r/min離心1min。徹底去除殘余的液體。8、將制備管置于1.5ml離心管中，在制備膜中央,加2530ul65°CEluent或去離子水，室溫靜置1min。12000r/min離心1min洗脫DNA。五、思考題：1、如何有效提高凝膠純化PCR產(chǎn)物的效率？2、瓊脂糖凝膠電泳中D

18、NA分子遷移率受哪些因素的影響？實(shí)驗(yàn)四、引物設(shè)計(jì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆找镌O(shè)計(jì)的方法和原理二、實(shí)驗(yàn)步驟1、在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA,在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象。2、用PrimerPremier5搜索引物精品文檔精品文檔打開PrimerPremier5，點(diǎn)擊File-New-DNAsequence,出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇As）,此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer,進(jìn)入引物窗口。此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search

19、按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCRprimers,“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度。在SearchParameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長(zhǎng)度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300500bp.點(diǎn)擊OK，軟件即開始自動(dòng)搜索引物，搜索完成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3'不要出現(xiàn)連續(xù)的3

20、個(gè)堿基相連的情況，比如GGG或CCC,否則容易引起錯(cuò)配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應(yīng)該在5570度之間，GC%應(yīng)該在45%55%間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為“None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于

21、引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5.在Primer5窗口中，若覺得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Currentpair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息。3、用Oligo驗(yàn)證評(píng)估引物在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)被保存為Seq文件），會(huì)跳出來兩個(gè)窗口，分別為InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊

22、最左下角的按鈕，會(huì)出來引物定位對(duì)話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過點(diǎn)擊ChangeCurrentoligolength來改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。 Analyze中，第一項(xiàng)為Keyinfo，點(diǎn)擊Selectedprimers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計(jì)算，會(huì)比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口

23、中還給出引物的DeltaG和3端的DeltaG.3端的DeltaG過高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過9。 Analyze中第二項(xiàng)為DuplexFormation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇Upper/Lower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計(jì)的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其DeltaG值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過4.5kcal/mol，結(jié)合堿基對(duì)不要超過3個(gè)。O

24、ligo此項(xiàng)的分析窗口中分別給出了3端和整個(gè)引物的二聚體圖示和DeltaG值。 Analyze中第三項(xiàng)為HairpinFormation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，DeltaG值不要超過4.5kcal/mol，堿基對(duì)不要超過3個(gè)。Analyze中第四項(xiàng)為CompositionandTm，會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC%需要控制在40%60%,而且上下游引物之間的GC不要相差太大。Tm值共有3個(gè)，分別采用三種方法計(jì)算出來，包括nearestneighbormethod、GCmethod和2(AT)4(G+C)method,最后一

25、種應(yīng)該是Primer5所采用的方法，Tm值可以才5制在5070度之間。第五項(xiàng)為FalsePrimingSites，即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)，在Primer5中雖然也有Falsepriming分析，但不如oligo詳細(xì)，并且oligo會(huì)給我正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率，一般的原則要使誤引發(fā)效率在100以下，當(dāng)然有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到400500,錯(cuò)誤引發(fā)效率超過100幅度若不大的話，也可以接受。Analyze中，有參考價(jià)值的最后一項(xiàng)是“PCR”，在此窗口中，是基于此對(duì)引物的PCR反應(yīng)Summary，并且給出了此反應(yīng)的最佳退火溫度，另外，提供了對(duì)于此對(duì)引物的簡(jiǎn)短評(píng)價(jià)。若該引物有不利于PCR

26、反應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在，并且DeltaG值偏大的話，Oligo在最后的評(píng)價(jià)中會(huì)注明，若沒有注明此項(xiàng)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)能值較小，基本可以接受。引物評(píng)價(jià)完畢后，可以選擇File-Print,打印為PDF文件保存，文件中將會(huì)包括所有Oligo軟件中已經(jīng)打開的窗口所包括的信息，多達(dá)數(shù)頁。因此，打印前最好關(guān)掉Tm窗口和DeltaG窗口，可以保留引物信息窗口、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析窗口(若存在可疑的異常的話)和PCR窗口。4、引物確定后，對(duì)于上游和下游引物分別進(jìn)行Blast分析，一般來說，多少都會(huì)找到一些其他基因的同源序列，此時(shí)，可以對(duì)上游引物和下游引物的blast結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，只要沒有交叉的其他基因的同源序列就可以。

27、三、注意事項(xiàng)：1 .引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3 .引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對(duì)PCR影

28、響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。5 .盡可能使用兩條引物的Tm值相同(最好相差不要超過5)，退火溫度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過改變引物的長(zhǎng)度來平衡兩條引物的退火溫度。引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,在Oligo軟件中使用的是最鄰近法（thenearestneighbormethod。）6 .A值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3

29、9;端AG值較低（絕對(duì)值不超過9）,而5'端和中間AG值相對(duì)較高的引物。引物的3'端的AG值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8 .對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。9 .引物序列應(yīng)該都是寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在2度之內(nèi)。10 .密碼子的簡(jiǎn)并，如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。實(shí)驗(yàn)五、聚合

30、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）一實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .學(xué)習(xí)并掌握PCR!因擴(kuò)增的操作方法2 .理解PCR!因擴(kuò)增技術(shù)在DNAM乍中的重要性二實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)出一對(duì)寡聚核甘酸引物可與目的DN砌子互補(bǔ)，以至于能被DN咪合酶相向延伸，那么被該引物結(jié)合的摸板區(qū)就可通過變性、退火和聚合的循環(huán)來大量擴(kuò)增，這一過程被稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該技術(shù)1985年由Mullis及同事們?cè)O(shè)計(jì)并研究成功，其原理類似于DNA勺天然復(fù)制過程，是將待擴(kuò)增的DNAt段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡聚核甘酸引物經(jīng)過變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNAT增倍數(shù)可達(dá)2n倍，該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必須工具。PCR的工作程序如下：在第一個(gè)循

31、環(huán)中，目的DNAS加熱至95C,60s左右的條件下分成兩條單鏈；當(dāng)降溫至55C（約30s）左右時(shí)，引物首先與模板雜交復(fù)性；退火后溫度再升至72c（60s-90s）以進(jìn)行聚合反應(yīng)，聚合反應(yīng)要消耗反應(yīng)混合物中的dNTPs，并需要Mg2+。第一次聚合反應(yīng)中不同的目標(biāo)分子從引物3末端開始擴(kuò)增，不斷對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行拷貝，新合成分子的長(zhǎng)度可以各不相同。當(dāng)溫度再次升高到95，變性所有新合成分子的第二次循環(huán)開始。每一對(duì)PCR引物長(zhǎng)度約為18-30個(gè)核甘酸，并且成對(duì)引物間的G+輸量應(yīng)相似，以致使它們?cè)谙嘟臏囟认屡c其互補(bǔ)序列結(jié)合。短的寡核苷酸的退火溫度可用下列公式計(jì)算：Tm=2（A+T）+4（G+C），引物與目的

32、序列的相應(yīng)鏈退火，結(jié)果可通過向3端加核甘酸相向延伸，較短的片段較易擴(kuò)增。三、實(shí)驗(yàn)材料及試劑1.模板DNA（含有OMP3和BLS基因的PET28aW粒載體）2對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物3. 10XPCRBuffer4. 2mMdNTPmix含dATRdCTPdGTPdTTP各2mM5. Taq酶四、操作步驟1在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。10XPCRbuffer2.5屋dNTPmix（2mM2屋引物1（10pM1叱1引物2（10pM1叱1Taq酶（2U/nl）0.5屋DNA模板（50ng-1仙g/膜）0.5屋加ddH2OE2512 .調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，

33、立即置PCRa上，執(zhí)行擴(kuò)增。程序：在93c預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93c40s-58c30s-72C60s,循環(huán)30次，最后在72c保溫7min。3 .結(jié)束反應(yīng)，PCRT物放置于4c待電泳檢測(cè)或-20C長(zhǎng)期保存。五、PC網(wǎng)應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10XPCRBuffer）、脫氧核甘三磷酸底物（dNTPmiX、耐熱DNAR合酶（Taq酶）、寡聚核甘酸引物（PrimeU,Primer2）、靶序列（DNA真板）五部分組成。各個(gè)組份都能影響PCRg果的好壞。1 .反應(yīng)緩沖液：一般隨TaqDNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mMKCl10mMTris-HCl

34、（pH8.3室溫），1.5mMMgCl2Mg2+勺濃度對(duì)反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核甘酸濃度為200時(shí)，Mg2效1.5mM較合適。若樣品中含EDTAE其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+勺濃度。在高濃度DNASdNT陳件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+勺濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn),一般以1.5-2mM（終濃度）較好。2 .dNTP:高濃度dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PC"常用終濃度為50-400nM的dNTP四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高

35、或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTFth與Mg2+吉合，使游離的Mg2然度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2然度。3 .TaqDNA聚合酶酶：在100屋反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個(gè)核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對(duì)PCRE應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如20屋或50小），一般酶的用量仍不小于2U,否則反應(yīng)效率將降低。4 .引物：引物是決定PCRg果的關(guān)鍵，引

36、物設(shè)計(jì)在PCRE應(yīng)中極為重要。要保證PCRK應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA1行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：引物的長(zhǎng)度以15-30bp為宜，一般（G+C的含量在45-55%,Tm值高于55CTm=4（G+C）+2（A+T）。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)喋吟或喀呢的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。引物的3端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對(duì)堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過3個(gè)由于影響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。人工

37、合成的寡聚核甘酸引物需經(jīng)PAG或離子交換HPLC!行純化。引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一股用0.25-0.5pM/叱1較好。引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100仙M,保存于-20C。使用前取出其中一部分用ddH2O0已制成10仙M或20仙M的工作液。5 .模板：PCR寸模板的要求不高，單、雙鏈DNA勻可彳為PCR勺樣品。雖然PCRT以用極微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性

38、，一般還宜用Ng水平的基因組DNM104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCRC應(yīng)。6 .PCR循環(huán)加快，即相對(duì)減少變性、復(fù)性、延伸的時(shí)間，可增加產(chǎn)物的特異性。四、注意事項(xiàng)1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。2純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。3所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。4.PCR試劑配制應(yīng)使用最

39、高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22濾膜過濾除菌或高壓滅菌。5試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。6試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。實(shí)驗(yàn)六、PCR產(chǎn)物的雙酶切反應(yīng)（同實(shí)驗(yàn)二）實(shí)驗(yàn)七、PCR產(chǎn)物的膠回收（同實(shí)驗(yàn)三）實(shí)驗(yàn)八、目的片段OMP31、BLS與PET28-a載體的連接反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰高B反應(yīng)的條件、原理二、實(shí)驗(yàn)材料及試劑實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)三得到的PET28a質(zhì)粒載體、實(shí)驗(yàn)七得到的目的片段（Omp31和Bls）實(shí)驗(yàn)試劑：T4DN

40、Aligase、10xT4Buffer、ATP、滅菌水三、酶連體系：10xT4Buffer1.0NL目的DNA片段1.0L載體1.0LT4DNAligase0.51iLddH2O6.51iLTotal10NL將加好的反應(yīng)體系混勻后，放入16c金屬浴中連接3h實(shí)驗(yàn)九、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌Bb（DE）3感受態(tài)細(xì)胞二、實(shí)驗(yàn)原理人們發(fā)現(xiàn)用含C1的溶液處理的大腸桿菌細(xì)胞會(huì)易于吸收外源DNA這一過程被稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用R、MT表示。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如電擊法、CaCb,

41、RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能允許許多有外源DNA勺載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞。在一定條件下，將帶有外源DNA勺載體分子與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫，使載體DNA子進(jìn)入受體細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DN吩子通過復(fù)制、表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。三.儀器、材料和試劑1 .儀器和材料：恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、離心管、大腸桿菌BL21（DE）32 .試劑：（1）基本培養(yǎng)基在三角瓶中，將15克瓊脂與725mL*混合并高壓滅菌。待冷卻至55c在到培養(yǎng)皿之前向瓊脂溶液中加入：250mL滅過菌的4倍鹽溶液，2mL滅過菌的1moL/L的Mg

42、SO2mL滅過菌的50mmoL/LCaC2,20mL滅過菌的10%8萄糖以及2mL滅過菌的10mg/mL維生素B1（過濾除菌）。（4倍鹽溶液：6gNazHPO,3gKH2PO,0.5gNaCl,1gNH,Cl,加水至250mL并調(diào)pH至7.4）。（2） LB培養(yǎng)基（1L）:將10g胰蛋白陳，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高壓滅菌，若要配置含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，則將15克瓊脂加1LLB培養(yǎng)液中高壓滅菌，待冷卻至55C,向其中加入1.5mL100mg/ml的卡那霉素。（3） 0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2（含20%eT油）兩者均調(diào)pH值至7.2并高壓滅菌備用。

43、四.操作步驟氯化鈣法a）用劃線培養(yǎng)法將大腸桿菌接種于基本培養(yǎng)基平皿上，于37c倒置培養(yǎng)1d-2d.b）將單個(gè)菌落接種于10mLLB培養(yǎng)液的試管中，37c振蕩（200r/min）培養(yǎng)過夜。c）向兩個(gè)裝有200mLLEBt#M勺500mL角瓶中各加入4mLM夜培養(yǎng)細(xì)胞，37c振蕩培養(yǎng)至光密度（ODo。）值在0.5-0.6之間。（約需1h-2h）.d）將每份細(xì)菌培養(yǎng)物分別倒入一個(gè)預(yù)先冰浴的無菌250mL離心瓶并置于冰上保持20min.于4下離心10min,(8000r/min),棄去上清夜。e)將每份沉淀輕緩的懸于100mL冰冷的0.1mol/LMgC2(Ph7.2)溶液中，按上述方法再次離心。f)

44、去上清夜，并將每一份沉淀輕緩的懸浮于20mL冰冷白含20%T油的0.1mol/LCaCl2(Ph7.2)溶液中。g)分裝于微量離心管中，(每支1mL)，80儲(chǔ)存?zhèn)溆?。注意? .為了獲得高感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)選用處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，。展0值不應(yīng)高于0.6，并且在整個(gè)試驗(yàn)過程中均需將細(xì)胞置于冰上。2 .細(xì)胞在冰凍后即獲得了感受性，在80幾小時(shí)后感受性達(dá)到最高值，幾個(gè)月內(nèi)均能維持高水平的感受態(tài)。五.討論1.試劑的質(zhì)量與污染.所用的試劑如CaCl2等應(yīng)是高質(zhì)量的,且最好保存于干燥的暗涼處.整個(gè)過程需要注意防止雜菌和其他DNA勺污染；所用器皿如離心管.分裝用的微量離心管等一定要洗干凈,最好用新的;并在整個(gè)

45、過程中要無菌操作.少量其他試劑在器皿中殘留或DNA勺污染均會(huì)影響轉(zhuǎn)化率.實(shí)驗(yàn)中凡涉及溶液的移取,分裝等敞開實(shí)驗(yàn)器皿的操作,最好在無菌超凈臺(tái)中進(jìn)行以防污染.六.結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)十、目的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 .了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程及其在分子生物學(xué)研究中的意義.2 .外源質(zhì)粒DNA專入受體菌感受態(tài)細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法.二.實(shí)驗(yàn)原理:連接反應(yīng)中形成的重組子及其他質(zhì)粒分子的混合體必須通過轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞將它們相互分離進(jìn)而復(fù)制(克隆)，人們發(fā)現(xiàn)用含C重的溶液處理的大腸桿菌細(xì)胞會(huì)易于吸收外源DNA這一過程被稱為轉(zhuǎn)化(transformation).將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)

46、化體(transformation),即可能帶有異源DNA分子的重組細(xì)胞.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過程是將質(zhì)粒分子溶液或連接反應(yīng)的混合物與感受態(tài)細(xì)胞的懸浮液混合放置,將混合溶液于42熱處理1min-2min(一般90s),會(huì)誘導(dǎo)質(zhì)粒DNAib子進(jìn)入細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)化效率.然后加適量生長(zhǎng)培養(yǎng)基液于轉(zhuǎn)化細(xì)胞,并在室溫下培養(yǎng),最終涂布于瓊脂平板表面,培養(yǎng)至形成細(xì)菌單菌落.同一克隆中的所有細(xì)胞均起源于某一單獨(dú)個(gè)體的分裂繁殖,因此所有細(xì)胞具相同的基因型,這里不包括自發(fā)突變,只包括轉(zhuǎn)化步驟中引入的質(zhì)粒(換言之,即是克隆或克隆群).在單一亞克隆實(shí)驗(yàn)中,要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)充分體現(xiàn)重組子克隆的產(chǎn)率,例如可采用堿性磷酸酶處理載體.

47、通常的篩選方法是分別從若干克隆中制備質(zhì)粒DNA然后用瓊脂糖電泳進(jìn)行分析.本實(shí)驗(yàn)以E.coliBL21(D63菌株為受體細(xì)胞，用CaC2處理受體菌使其處于感受態(tài)，然后PET28板粒共保溫實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化.PET28a質(zhì)粒帶有卡那霉素抗性基因的特性.將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的全部受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)修飾,在含卡那霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng),只有轉(zhuǎn)化體才能存活,而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗卡那霉素的能力而死亡,轉(zhuǎn)化體經(jīng)擴(kuò)增后,可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析，限制型內(nèi)切酶圖譜的制作以及DNAM序等實(shí)驗(yàn).三.儀器、材料和試劑1. 儀器和材料:恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)、分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、離心管、大腸桿菌

48、BL21(D63、PET28a質(zhì)粒DNA、Eppendorf管、移液器、液氮2. 試劑:(1)基本培養(yǎng)基在三角瓶中，將15克瓊脂與725mL*混合并高壓滅菌。待冷卻至55c在到培養(yǎng)皿之前向瓊脂溶液中加入：250mL滅過菌的4倍鹽溶液，2mL滅過菌的1moL/L的MgSQ2mL滅過菌的50mmoL/LCaC2,20mL滅過菌的10%8萄糖以及2mL滅過菌的10mg/mL隹生素B1(過濾除菌)。4倍鹽溶液：6gNazHPO,3gKHPO,0.5gNaCl,1gNH4Cl,加水至250mL并調(diào)pH至7.4)。(2) LB培養(yǎng)基(1L)將10g胰蛋白陳，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高壓滅

49、菌，若要配置含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)基，則將15克瓊脂加1LLB培養(yǎng)液中高壓滅菌，待冷卻至55C,向其中加入1.5mL100mg/ml的氨卞青霉素。(3) 0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2(含20%T油)兩者均調(diào)pH值至7.2并高壓滅菌備用。(4) TSS溶液：10%PEG8000,5%DMSO,20mmol/LMgSOU:各成分溶于100mLLBW養(yǎng)7中，過濾除菌(由于高壓滅菌會(huì)使TSS液轉(zhuǎn)化效果下降，PEG可以單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌).四.操作步驟1) 氯化鈣法制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1 .將1ng-10ng質(zhì)粒DNA加于1.5mL無菌離心管中，再用緩沖液(Tris10mmol

50、/L,pH7.7,0.1mmol/LEDTA)將體積調(diào)至100mL置于冰上.2 .待感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化后，向含有質(zhì)粒DNA勺離心管中加入200仙L,混勻并在冰上靜置30min.3 .將離心管放入42水浴中90s對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱處理.4 .向上述試管中加入1mL預(yù)熱(37)的LB培養(yǎng)液,于37下振蕩培養(yǎng)(200r/min)1h.5 .將50世L-100世L上述培養(yǎng)液平鋪于含有合適抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)過夜.五.討論(一)為提高轉(zhuǎn)化率需考慮以下幾個(gè)重要因素:1 .細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度.細(xì)胞生長(zhǎng)密度不足或過高均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降,一般以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5x107個(gè)范圍為好.要使用新鮮的培

51、養(yǎng)液，否則效果不佳.受體菌生長(zhǎng)狀況可用分光光度計(jì)來測(cè)定，不同菌株的合適OD值是不一樣的，因?yàn)镺D值與細(xì)胞數(shù)值之間的關(guān)系隨菌株的不同而異.2 .轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA勺濃度和質(zhì)量.轉(zhuǎn)化率與所加DNAS度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的DNA量過多或體積過大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降.用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNAK主要是cccDNA.3 .若在不該長(zhǎng)出菌落的平板長(zhǎng)出菌落,首先要考慮是否已失效,若排除了這一因素,則說明實(shí)驗(yàn)有污染;如果長(zhǎng)出的菌落相當(dāng)于平板上長(zhǎng)出的菌落而言,數(shù)量極少（一般在5個(gè)以下）,則此次轉(zhuǎn)化還算成功,可繼續(xù)以后的實(shí)驗(yàn);如果長(zhǎng)出的菌落很多,則需設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn),找出原因后,再重新進(jìn)行轉(zhuǎn)化.4 .本實(shí)驗(yàn)方法使用

52、于E.coli各菌株，但同一菌株與不同質(zhì)粒DNA勺轉(zhuǎn)化率是不一樣的,有的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率會(huì)很低.（二）轉(zhuǎn)化是DNAT增和在體內(nèi)進(jìn)行基因研究的關(guān)鍵步驟.轉(zhuǎn)化有多種方法，常用的有氯化鈣法,氯化銣法,一步法.與其他兩種方法相比一步法很容易,它無需離心，漂洗，熱處理以及特殊儀器（如電穿孔法）.另外在PEG,DMSOMg+存在的情況下可獲得較高的轉(zhuǎn)化率.感受態(tài)細(xì)胞在不做任何處理的情況下在所在容液中可保存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月以上.（三）一般認(rèn)為冰冷氯化鈣溶液處理可使細(xì)菌進(jìn)入”感受態(tài)”,而熱休克則使細(xì)菌的細(xì)胞膜張開，這樣DNA得以進(jìn)入細(xì)胞.迄今人們?yōu)樘岣咿D(zhuǎn)化率為這一技術(shù)進(jìn)行了很多改進(jìn).本實(shí)驗(yàn)所介紹氯化鈣是一種簡(jiǎn)便,快速

53、的方法.使用本法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每微克超螺旋質(zhì)粒（pGEMK列）可產(chǎn)生107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落.（四）感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量可以通過測(cè)定某一特定樣品的轉(zhuǎn)化率來衡量,轉(zhuǎn)化率定義為每微克用于轉(zhuǎn)化的DNAE選擇平板所形成的菌落數(shù).這里DN朋純質(zhì)粒，通常是在克隆實(shí)驗(yàn)中的載體.轉(zhuǎn)化率的變動(dòng)幅度很大,可以從粗放轉(zhuǎn)化程序的105個(gè)菌落/ug到精細(xì)轉(zhuǎn)化程序高于108個(gè)菌落/ug.粗放轉(zhuǎn)化程序只適合將完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)入新的宿主菌,而精細(xì)轉(zhuǎn)化程序所精心制備的感受態(tài)細(xì)胞可用于文庫的構(gòu)建.約105個(gè)菌落/ug的轉(zhuǎn)化率足以滿足簡(jiǎn)單克隆實(shí)驗(yàn).（五）一般培養(yǎng)液中必須含有原平板篩選轉(zhuǎn)化所用的抗生素,以維持對(duì)質(zhì)粒有無的選擇.部分質(zhì)粒在長(zhǎng)期無篩選壓力的生

54、長(zhǎng)條件下會(huì)從宿主菌體內(nèi)丟失,因?yàn)槟切┡既粊G失了質(zhì)粒后以耗能小的方式將會(huì)淘汰那些攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌.擴(kuò)增的質(zhì)粒可以用小量法從培養(yǎng)基中制備.通常在這一時(shí)刻要制備培養(yǎng)物的保存液,方法是將培養(yǎng)物分散于含有一定的甘油溶液中凍存,甘油的作用是保護(hù)細(xì)胞免受冰晶形成的傷害（甘油貯液）.這樣的貯液能使同一菌株（質(zhì)粒）在必要使被接種增殖并再次制備這樣的貯存液保存.六.結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)十一、菌落PCR反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諔?yīng)用PCR的方法大量擴(kuò)增陽性克隆子的技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理將細(xì)菌在無菌水中煮沸5分鐘，其他同質(zhì)粒和基因的PCR反應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀、微量移液管、0.5mlEP管、小槍頭、實(shí)驗(yàn)材料：上

55、述篩選試驗(yàn)中獲得的篩選平板上的單菌落實(shí)驗(yàn)試劑：PCR所需各種試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟1 .用200仙L的槍頭活無菌牙簽從平板上挑取菌落，選取直彳大于1mm的菌落,如要保存菌落拷貝，移動(dòng)前要輕觸平板；2 .將菌轉(zhuǎn)至裝有50pL滅菌水的PCR管，震蕩使細(xì)胞分散；3 .將管置于沸水活99c加熱5min,使細(xì)胞裂解，DNase變性；4.12000/min離心，除去細(xì)胞殘片；5.取10仙L上精液，加入0.5仙L空管中準(zhǔn)備PCR,用之前至于冰上;6.菌落PCR反應(yīng)體系（25L）10Xbuffer0.25pLdNTP0.5pLPi0.5pLP20.5pLTaqE0.25pLMgcl22仙L模板6nLddH2O12.

56、75pL7.PCR循環(huán)（循環(huán)30次）94c4min94c1min55c1min72c2min72c6min注：加樣體系:10Xbuffer1.0NLDNTP0.24aLP10.2pLP20.2pLTaqE0.08pL模板2nLddH2O6.28pLTotal10NL反應(yīng)體系（循環(huán)29次）94c4min94c40s54c50s72c1min30s72c8min4c1h實(shí)驗(yàn)十二、IPTG誘導(dǎo)PMP31和BLS基因的表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握原核表達(dá)的基本方法2 .掌握IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的基本方法二、實(shí)驗(yàn)原理在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被用來研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。這項(xiàng)技術(shù)的主要方法是，將已經(jīng)克