生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱課程類別：專業(yè)基礎(chǔ)適用專業(yè)：本科臨床學(xué)專業(yè)課程總學(xué)時(shí)： 實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)： 32 實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書：生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程開課實(shí)驗(yàn)室名稱：生化實(shí)驗(yàn)室一 、目的和任務(wù)生物化學(xué)是一門在分子水平上研究生命現(xiàn)象的學(xué)科，也是一門重要的實(shí)驗(yàn)性較強(qiáng)的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)課程隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，該學(xué)科已滲透到醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究工作。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)是生物化學(xué)教學(xué)的重要組成部分，它與理論教學(xué)既有聯(lián)系，又是相對(duì)獨(dú)立的組成部分，有其自身的規(guī)律和系統(tǒng)。我們根據(jù)國(guó)家教委對(duì)醫(yī)學(xué)生物化學(xué)課程基本技能的要求，開設(shè)了大分子物質(zhì)的常用定量分析法、酶活性分析、電泳法、層析技術(shù)、

2、離心技術(shù)及臨床生化，使學(xué)生對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)有一個(gè)比較系統(tǒng)和完整的概念，培養(yǎng)學(xué)生的基本技能和科學(xué)思維的形成，提高學(xué)生的動(dòng)手能力。二、基本要求1.通過實(shí)驗(yàn)過程中的操作和觀察來驗(yàn)證和鞏固理論知識(shí)，加深學(xué)生對(duì)理論課內(nèi)容的理解。2.通過對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的觀察，逐步培養(yǎng)學(xué)生學(xué)會(huì)觀察，比較，分析和綜合各種現(xiàn)象的科學(xué)方法，培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考和獨(dú)立操作的能力。3.通過對(duì)各類實(shí)驗(yàn)的操作和總結(jié)，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。4.進(jìn)行本學(xué)科的基本技能的訓(xùn)練，使學(xué)生能夠熟練各種基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的操作。三、考試方法及成績(jī)?cè)u(píng)定方法占總成績(jī)之比總分分?jǐn)?shù)分配考核目的要求30%30移液管正確使用方法10考察學(xué)生平時(shí)對(duì)移液管的使用是否正確與

3、熟練程度移液槍的正確使用方法10考察學(xué)生平時(shí)對(duì)移液槍的使用情況是否正確與熟練程度紫外分光光度計(jì)的正確使用方法10考察學(xué)生平時(shí)對(duì)紫外分光光度計(jì)的使用情況是否正確與熟練程度 四、說明 實(shí)驗(yàn)教材及參考書：1.揭克敏主編：生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第2版）?？茖W(xué)出版社，2010參考資料：1.袁道強(qiáng)主編：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第1版）?；瘜W(xué)工業(yè)出版社，2011五、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目數(shù)據(jù)表序號(hào)實(shí)驗(yàn)名稱學(xué)時(shí)類別要求類型設(shè)備套數(shù)每組人數(shù)每組常規(guī)儀器設(shè)備名稱，數(shù)量每組主要消耗材料名稱、數(shù)量、消耗額1蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)3201310人水浴鍋1臺(tái)試管2支、濾紙3張2影響酶活性的因素3201310人水浴鍋1臺(tái)試管5支3血清醋酸纖維素

4、薄膜電泳6202125人電泳儀1臺(tái)電泳槽1臺(tái)薄膜條1張干4血清膽固醇的測(cè)定3201125人分光光度計(jì)1臺(tái)試管3支5轉(zhuǎn)氨基作用6201125人烘干箱1臺(tái)層析缸1個(gè)層析濾紙1張6血清尿素氮的測(cè)定3201125人分光光度計(jì)1臺(tái)試管2支、移液管4支7動(dòng)物組織基因組DNA的提取6202125人分光光度計(jì)1臺(tái)EP管6支、移液槍3支8實(shí)驗(yàn)基本操作考核2203125人分光光度計(jì)1臺(tái)試管1支、移液槍1支、移液管1支注 1）類別：2：指為技術(shù)（或?qū)I(yè)基礎(chǔ)）課開設(shè)的教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。2）要求：0：必修 1選修3）類型：0：演示 1：驗(yàn)證 2：綜合 3：設(shè)計(jì)4）每組人數(shù)：指教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中一次實(shí)驗(yàn)在每套儀器設(shè)備上完成實(shí)驗(yàn)項(xiàng)

5、目的人數(shù)。六、各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目教學(xué)大綱 實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)【預(yù)習(xí)要求】 預(yù)習(xí)四個(gè)小實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)原理和操作內(nèi)容?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1. 加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)； 2. 了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】（一）蛋白質(zhì)的鹽折1. 原理 大量中性鹽類如硫酸銨(NH4)2SO4)、硫酸鈉(Na2SO4)和氯化鈉(NaCl)等加入到蛋白質(zhì)溶液后，可引起蛋白質(zhì)顆粒因失去水化膜和電荷而沉淀。各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和電荷數(shù)量不同，用不同濃度中性鹽可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中沉淀。當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到飽和時(shí)血清中的白蛋白使沉淀下來。鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)能保持

6、蛋白質(zhì)不變性，加水稀釋降低鹽濃度，能使沉淀的蛋白質(zhì)重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用鹽析法可達(dá)到分離提純蛋白質(zhì)的目的。2. 操作步驟 取小試管1支、加入5雞蛋清溶液20滴，飽和硫酸銨溶液20滴，充分搖勻后靜置5min，記錄結(jié)果。 另取1小試管置于試管架上，插入準(zhǔn)備好的濾紙和漏斗。將操作“1”之混合液傾入漏斗內(nèi)過濾。觀察結(jié)果。 向操作“2”的濾液中逐步加入米粒大小固體(NH4)2SO4, 邊加邊搖勻，直至飽和為止。觀察結(jié)果。再向管內(nèi)加入少量蒸餾水，觀察結(jié)果有何變化。 將操作“2”的濾液漏斗置于1支小試管上，用玻棒戳穿濾紙尖部，加少量蒸餾水將濾紙上的沉淀粉洗入試管內(nèi)，搖勻后觀察和解釋結(jié)果。（二

7、）重金屬鹽和三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)1. 原理重金屬粒子如Pb2+、Cu2、Hg2+、Ag+等可與蛋白質(zhì)分子上的羧基結(jié)合生成不溶性蛋白質(zhì)金屬鹽而沉淀。三氯乙酸屬于生物堿試劑，能與蛋白質(zhì)分子上的氨基結(jié)合而沉淀。它們均可引起蛋白質(zhì)分子的變性和失去生物學(xué)活性。2. 操作步驟 編號(hào)2支小試管，各加5雞蛋清溶液20滴。 向試管1加入0.1mol/L NaoH溶液1滴，混勻。加入3CuSO4溶液4滴，混勻。 向試管2加入5三氯乙酸溶液10滴，混勻。 記錄結(jié)果。（三）乙醇沉淀蛋白質(zhì)1.原理某些可與水混合的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇和丙酮等，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，降低其在溶液中的穩(wěn)定性。當(dāng)加入少量中性鹽如NaCl等或溶液

8、pH接近等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)膠粒上的電荷被中和。加入上述有機(jī)溶劑可使蛋白質(zhì)沉淀。反應(yīng)在04下進(jìn)行，并應(yīng)立即分離沉淀物，否則蛋白質(zhì)會(huì)變性。2.操作步驟a)  編號(hào)2支小試管，各加5雞蛋清溶液10滴。b)  每管內(nèi)均加入95乙醇20滴，邊加邊混勻，靜置片刻后觀察結(jié)果。c)  向試管1內(nèi)加入飽和NaCl溶液12滴，觀察結(jié)果。（四）、加熱沉淀蛋白質(zhì)1、原理：幾乎所有的蛋白質(zhì)都可因加熱而凝固，這是由于溫度升高，則容易出現(xiàn)沉淀。在酸性、堿性條件下，蛋白質(zhì)則易變性，此時(shí)若溫度升高，雖變性并不出現(xiàn)沉淀，在冷卻后加酸或加堿調(diào)節(jié)PH值達(dá)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則有

9、沉淀析出。2、操作：1）取試管4支，編號(hào)，按下表操作 管號(hào)試劑 （滴） 1 2 3 4 5%蛋白質(zhì)溶液 20 20 20 201% 醋酸 1 10% 醋酸 10 10% NaOH 10 2）將上述試管同時(shí)放入沸水浴中加熱，觀察并記錄各試管出現(xiàn)的現(xiàn)象，解釋變化原因。3）取出試管，冷卻后于第3管中慢慢滴入10%氫氧化鈉溶液并觀察現(xiàn)象。4）向第4管中慢慢滴入10%的醋酸溶液并觀察現(xiàn)象?！窘虒W(xué)方法】1. 課堂講授2. 指導(dǎo)學(xué)生操作3. 課堂提問4. 課外實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè)【復(fù)習(xí)思考題】 1. 什么因素可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的沉淀作用？舉例說明。2. 蛋白質(zhì)的沉淀有幾種？試舉例說明。3. 蛋白質(zhì)的沉淀與變性之間有何關(guān)系

10、？蛋白質(zhì)在發(fā)生沉淀和變性后，其性質(zhì)發(fā)生哪些變化？ 實(shí)驗(yàn)二 影響酶活性的因素 【預(yù)習(xí)要求】 預(yù)習(xí)各小實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)原理和操作內(nèi)容【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?驗(yàn)證酶的特異性，觀察影響酶促反應(yīng)的一些因素，加深對(duì)酶性質(zhì)的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 1）、實(shí)驗(yàn)原理 淀粉酶能催化淀粉水解，生成的麥芽糖屬于還原性糖，能使班氏試劑中二價(jià)銅離子還原成一價(jià)亞銅，生成磚紅色的氧化亞銅。淀粉酶不能催化蔗糖水解，所以不能產(chǎn)生具有還原性的葡萄糖和果糖，蔗糖本身又無還原性，故不與班氏試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解，生成大小不同的糊精及最后水解成麥芽糖。淀粉及糊精遇碘各呈不同的顏色反應(yīng)。直鏈淀粉遇碘呈藍(lán)色，糊精按分子的大小遇碘可

11、呈藍(lán)色、紫色、暗褐色和紅色。最小的糊精和麥芽糖遇碘不顯色。根據(jù)顏色反應(yīng)，可以了解淀粉水解的程度。由于在不同的溫度、不同的酸堿度下唾液淀粉酶活性高低不同，所以淀粉水解的程度也不同。因此，通過與碘產(chǎn)生的顏色反應(yīng)判斷淀粉水解的程度，來了解溫度、pH、和激活劑與抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響。 2）、實(shí)驗(yàn)操作1、稀釋唾液的配制 將痰吐盡，用水漱口，再含蒸餾水做咀嚼運(yùn)動(dòng)，2分鐘后吐入燒杯中，再用濾紙過濾后待用。2、酶的特異性實(shí)驗(yàn)取2支試管標(biāo)號(hào)后按下表加入試劑。 試劑管號(hào)緩沖液（pH6.8）淀粉溶液（1%）蔗糖溶液（1%）稀釋唾液120滴10滴-5滴220滴-10滴5滴各管混勻后，放入37水浴中保溫10分鐘，然后

12、每管加入班氏試劑20滴，放入沸水中煮沸，觀察結(jié)果。3、溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響（1）取三支試管，編號(hào)，每管加入pH6.8緩沖液20滴。1%淀粉溶液10滴。（2）將第一支試管放入37恒溫水浴，第二支試管放入沸水浴，第三支試管放入冰浴。 （3）放置5分鐘后，分別向各試管中加入稀釋唾液5滴，再放回原處。（4）10分鐘后，分別向各試管中加入碘液1滴，觀察三支試管中顏色的區(qū)別，說明溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響。4、pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響(1) 取3支試管,編號(hào)后按下表加入各種試劑。劑試管號(hào)pH5.0緩沖液pH6.8緩沖液pH8.0緩沖液淀粉溶液1%稀釋唾液120滴-10滴5滴2-20滴-10滴5滴3-20滴10滴5滴

13、（2）將上面三支試管放入37恒溫水浴中保溫10分鐘。（3）取出試管，分別加入1滴碘液，觀察三支試管顏色的區(qū)別，說明pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響。5、激活劑和抑制劑的影響 管號(hào) 試劑1%淀粉溶液（滴）1%NaCl（滴）1%硫酸銅（滴）1%硫酸鈉（滴）蒸餾水（滴）稀釋唾液（滴）1202-10220-2-10320-2-10420-210取4 支試管，編號(hào)，按照下表加入試劑。將上面4支試管放入37恒溫水浴中保溫10分鐘。取出分別滴加碘液23滴，搖勻，觀察現(xiàn)象，說明原因?！窘虒W(xué)方法】 1.課堂講授 2.指導(dǎo)學(xué)生操作 3.課堂提問 4.課外實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè) 【復(fù)習(xí)思考題】 1、影響酶活性的因素有哪些，舉例說明。 2

14、、酶的特異性分了幾大類，我們實(shí)驗(yàn)當(dāng)中驗(yàn)證的是哪一類？ 3、何為激活劑？何為抑制劑？ 實(shí)驗(yàn)三 血清醋酸纖維素薄膜電泳【預(yù)習(xí)要求】預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理和各步操作 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、 掌握血清蛋白質(zhì)電泳的基本原理和基本操作過程。2、 熟悉血清蛋白質(zhì)醋纖維素薄膜電泳圖譜的含義及臨床意義?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】一、實(shí)驗(yàn)原理帶電顆粒在電場(chǎng)中向著與其電性相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。 電泳時(shí)不同的帶電粒子在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同。帶電顆粒 ( 球形分子 ) 在電場(chǎng)中的電泳速度 (V)，從上式看出，帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度 (V) 與顆粒帶電荷量 (Q) 以及電場(chǎng)強(qiáng)度 (E) 成正比，與球形分子的大小 (半徑為 r ) 及所在介

15、質(zhì)的粘度 () 成反比。因此 ,在同一電場(chǎng)、同一介質(zhì)中進(jìn)行電泳時(shí)，帶不同電荷，不同大小的顆粒就可以通過電泳而被分離。在實(shí)際操作中，為了不考慮不同電壓對(duì)電泳速度的影響，我們常用遷移率（ move rate,M）來表示帶電顆粒的電泳特性，遷移率指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的電泳速度，即可見，帶電顆粒的凈電荷越多，分子顆粒越小，在電場(chǎng)中的遷移率就越快；反之越慢。但電泳速度和電泳遷移率是兩個(gè)不同的概念，后者有利于不同電場(chǎng)強(qiáng)度下電泳結(jié)果的比較，各種帶電顆粒在一定條件下測(cè)得的遷移率是一個(gè)常數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)操作1、 點(diǎn)樣 將醋酸纖維薄膜 (2.5cm×8cm)一條，浸于巴比妥緩沖液，待完全浸透后，取出輕

16、輕夾于濾紙中，吸去多余的溶液，再于薄膜的無光澤面的一端 2.0cm處，用小玻片蘸取少許血清，垂直印于膜上，待血清滲入薄膜后，以無光澤面向下，兩端用數(shù)層浸濕的濾紙 ( 或紗布 )貼緊，加蓋，平衡 2 3min ，然后通電。2、通電 一般電壓用 110 140V ，電流約 0.4 0.6mA cm ，時(shí)間 45 60min 。3、 染色 關(guān)閉電源后立即將膜取出，放入染色液中浸染 2 3min，然后移入漂洗液中漂洗數(shù)次，至蛋白條帶清晰，背景無色為止。4、定量 取試管 6 支，編號(hào)依次為 0 （空白）、 A 、 1 、 2 、 、 ，將電泳圖譜亦按 A 、1 、 2 、 、 蛋白區(qū)帶剪開，分別裝入相應(yīng)

17、號(hào)碼試管中。再在圖譜兩端無蛋白部位剪一條寬約 1帶的空白帶放入空白管中。各管中加 0.4mol/L NaOH 4ml ，振搖數(shù)次，使染料色澤浸出， 30min 后，在620nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，以空白管校正零點(diǎn)，讀取清蛋白及 1 、 2 、 及 球蛋白各管的吸光度。5、計(jì)算 吸光度總和 T 為各種蛋白吸光度的總和： T = A + 1 + 2 + + 。 分別按下面算式計(jì)算各組分蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)：清蛋白 (%) (A/T)×100% 1 球蛋白 (%) ( 1 /T)×100% 2 球蛋白 (%) ( 2 /T)×100% 球蛋白 (%) ( /T)×10

18、0% 球蛋白 (%) (/T)×100%現(xiàn)在許多實(shí)驗(yàn)室采用光密度計(jì)定量法。待薄膜完全干燥后，浸于透明液中約 5 10min，取出平貼在玻璃板上，完全干燥后成為透明的膜。然后在光密度計(jì)上測(cè)定吸光密度，并可繪制成曲線，或者直接計(jì)算出各種蛋白質(zhì)的百分含量。3）、 臨床意義 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳在臨床上常用于分析血、尿等樣品中的蛋白質(zhì)，供臨床上診斷肝、腎等疾病參考。如腎病綜合癥患者，血漿蛋白中小分子量的白蛋白漏出隨尿液排出體外，導(dǎo)致醋酸纖維素薄膜電泳圖譜中白蛋白區(qū)帶明顯變小變淺。又如，慢性肝炎和肝硬化患者，由于肝細(xì)胞受損，肝臟合成血漿蛋白質(zhì)的能力大大下降，使血漿白蛋白顯著降低， 球蛋白

19、相對(duì)顯著增加。多發(fā)性骨髓瘤患者血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳圖譜中可見不正常的球蛋白條帶。4）、注意事項(xiàng) 1. 電泳時(shí)，電壓應(yīng)控制在 110 140V，不能過高，若電壓太高，產(chǎn)熱量大，則蛋白質(zhì)標(biāo)本會(huì)破壞，并且電壓高則帶電顆粒移動(dòng)速度快，分離效果不理想。2. 醋酸纖維素薄膜在電泳前，一定要在緩沖液中浸透，否則有礙電泳分離，最好是浸泡過夜，效果最佳。3、點(diǎn)樣時(shí)樣品一定要點(diǎn)在無 光澤面，否則很難吸入，點(diǎn)樣量 不宜過多（血清樣品最適宜 3l）。其原因是醋酸纖維素薄膜承受蛋白質(zhì)有限。量過多則分子量相近的物質(zhì)相互爭(zhēng)奪遷移而重疊，影響結(jié)果觀察。4、電泳開始后，不能再取放薄膜，以防觸電。如必需進(jìn)行，要先關(guān)閉電源

20、。【教學(xué)方法】 1.課堂講授 2.指導(dǎo)學(xué)生操作 3.課堂提問 4.課外實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè)【復(fù)習(xí)思考題】 1 、電泳后，泳動(dòng)在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成份？請(qǐng)分析原因。 2、 電泳時(shí)，點(diǎn)樣端置于電場(chǎng)的正極還是負(fù)極，為什么？ 3、 電泳已開始，發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)（膜條放置錯(cuò)誤，濾紙未浸入緩沖液或電泳槽與電泳儀連線有錯(cuò)）怎樣糾正（操作）？ 4、 肝硬化和腎衰病人的醋酸纖維素薄膜電泳圖譜和區(qū)帶定量測(cè)定結(jié)果有何異常，為什么？ 實(shí)驗(yàn)四 血清膽固醇的測(cè)定【預(yù)習(xí)要求】 預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理和具體操作內(nèi)容。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握血清總膽固醇測(cè)定原理、方法及其臨床意義?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、實(shí)驗(yàn)原理 用無水乙醇提取血清中膽固

21、醇同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)，向提取液中加入硫磷鐵顯色劑，膽固醇與濃硫酸及三價(jià)鐵作用，生成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，求得其含量。 二、實(shí)驗(yàn)操作 1.無蛋白提取液的制備準(zhǔn)確吸取血清0.20ml，置入干燥的小試管中，對(duì)準(zhǔn)血清吹入無水乙醇 4.8ml，使蛋白質(zhì)分散成細(xì)小的沉淀，用力振蕩約10s，放置5min，再次搖勻沉淀，置2000rmin離心約10min。2顯色取干燥試管三支，分別標(biāo)記，按下表操作：試劑（ml）管號(hào)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管抽 提 上 清 液-2.0膽固醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液-2.0-無 水 乙 醇3.01010顯色劑(沿管壁慢慢加入)3.03.03.03. 測(cè)定顯色劑加畢，

22、立即振搖1520次，置室溫下冷卻15min，然后用550nm波長(zhǎng)以空白調(diào)零點(diǎn)，測(cè)出各管吸光度。計(jì)算測(cè)定管吸光度×4×25 血清總膽固醇mg/dl（mg/100ml）標(biāo)準(zhǔn)管吸光度 血清總膽固醇(mgd1)× 0.02586(或除以38.67) mmolL正常值 2.96.OmmolL(110230mgd1)【教學(xué)方法】 1.課堂講授 2.指導(dǎo)學(xué)生操作 3.課堂提問 4.課外實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè)【復(fù)習(xí)思考題】 (1)離心后上清液必須清亮透明，為什么不能混有細(xì)微沉淀顆粒，如果有為什么要重新離心。 (2)加入顯色劑為什么必須與乙醇分成兩層，然后再混合，為什么不能邊加邊搖？ 實(shí)驗(yàn)五

23、 轉(zhuǎn)氨基作用【預(yù)習(xí)要求】 預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理，理解什么是紙層析?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1、學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的基本原理。 2、掌握氨基酸紙層析的操作原理。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、實(shí)驗(yàn)原理：轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝過程中的一個(gè)重要反應(yīng)，在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的-酮酸與-酮基的互換反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨基作用廣泛地存在于機(jī)體各組織器官中，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應(yīng)時(shí)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，此酶催化氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一酮基酸上。各種轉(zhuǎn)氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）催化如下反應(yīng)： 酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨

24、酸的出現(xiàn)，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強(qiáng)，水被吸附在濾紙的纖維素的纖維之間形成固定相。有機(jī)溶劑與水不相溶，把預(yù)分離物質(zhì)加到濾紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此向另一端移動(dòng)，這樣物質(zhì)隨著流動(dòng)相的移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷分配。由于物質(zhì)分配系數(shù)的差異，而使移動(dòng)速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢(shì)較大的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就慢，反之，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較大的成分，移動(dòng)速度快，最終不同的組分彼此分離，物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速率可以用比值Rf表示： 物質(zhì)在一定的溶液中的分配系數(shù)是一定的，故比值Rf也相對(duì)穩(wěn)定，因此在同一層析體系中可用Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。二、實(shí)驗(yàn)操作1肌勻漿

25、的制備（由同學(xué)們自己制備）取小白鼠一只，猛擊頭部處死后，立即剪頸放血，剖腹取出肝臟，用0.9%NaCl溶液洗去血液并用濾紙吸干，稱取肝臟約1.0g置電動(dòng)勻漿器中，再加0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液5.0ml磨成勻漿。2.轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)：取小試管2支編號(hào)，所加試劑以滴為單位。              編  號(hào)  試  劑         1 &

26、#160;        2肌勻漿         10          10將2號(hào)管置沸水浴中5分鐘，然后取出冷卻1%谷氨酸鉀         10          101%丙酮酸鈉&

27、#160;        10          10混勻后同置40水浴中保溫45分鐘（或60分鐘）。在保溫過程中，時(shí)加振搖。取出兩管各加入2%醋酸2滴，再同置沸水浴中5分鐘，使蛋白質(zhì)完全凝固，冷卻后，離心（200r/min）5分鐘，（或靜置10分鐘），將上清液作氨基酸的紙層析。3、層析操作1）向?qū)游龈字醒b入飽和水的酚（其深度約1.5cm）。2）取寬 4.5cm，長(zhǎng)18cm濾紙一條，（手指不可接觸紙面）在濾紙條一端 2cm處劃一水平線（

28、原線），在此線上以間隔相等的距離用鉛筆畫四個(gè)直徑約24mm的小圓圈，標(biāo)明號(hào)碼。3）用毛細(xì)管向各小圈中央點(diǎn)上各種不同的氨基酸溶液，并記錄之。例如：第一點(diǎn)為谷氨酸，第二點(diǎn)為丙氨酸，第三點(diǎn)及第四點(diǎn)為轉(zhuǎn)氨基作用實(shí)驗(yàn)中的1號(hào)及2號(hào)試管溶液。點(diǎn)樣直徑以3mm為宜。4）待干燥后可重復(fù)點(diǎn)樣一、二、三次（3-5滴，前一滴干燥后才可點(diǎn)后一滴），再干燥。然后將此紙條插入上述準(zhǔn)備好的層析缸中。先將紙條懸掛于玻璃缸內(nèi)的橫玻棒上（或用棉線代替），調(diào)節(jié)其高度，使紙條的下端浸入酚內(nèi)約 1 cm ( 勿使氨基酸小點(diǎn)與溶劑直接接觸)，然后把蓋蓋緊。（如圖20所示）。     &#

29、160;                        圖20上行法紙層析5）經(jīng)11.5小時(shí)，當(dāng)溶劑上升至約1015 cm高時(shí)，取出濾紙，置烘箱烘干或用電吹風(fēng)吹干，使酚蒸發(fā)。6）將已烘干的濾紙浸入茚三酮酒精溶液（噴入茚三酮乙醇溶液，量要適中，不要過多，也不能太少。），再置80度干燥箱中烘干（或用電吹風(fēng)吹干），這時(shí)在紙的不同位置上，可見紫紅色的斑點(diǎn)出現(xiàn)，用鉛筆描繪溶劑前

30、沿和斑點(diǎn)的中心位置?！窘虒W(xué)方法】 1.課堂講授 2.指導(dǎo)學(xué)生操作 3.課堂提問 4.課外實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè)【復(fù)習(xí)思考題】 1、在實(shí)驗(yàn)過程中，為什么不能用手直接觸膜層析濾紙？ 2、為什么谷氨酸和丙氨酸在層析濾紙上會(huì)處在不同的位置？ 3、RF值是什么，跟哪些因素有關(guān)系？ 實(shí)驗(yàn)六 血清尿素氮的測(cè)定【預(yù)習(xí)要求】 預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理和具體操作內(nèi)容。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1、了解血清尿素氮在生理代謝上的重要意義。 2、掌握測(cè)定血清尿素氮的方法和原理。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 1）、實(shí)驗(yàn)原理：尿素在強(qiáng)酸、加熱條件下，與二乙酰一肟縮合成紅色二嗪化合物，其顏色深淺與尿素含量成正比，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液在540鈉米處比色，求得尿素含量。 2）、實(shí)

31、驗(yàn)操作：1、取試管3支，按下表操作： 管號(hào)試劑（ml） 測(cè)定管 標(biāo)準(zhǔn)管 尿素氮標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用 - 0.11：5稀釋血清 0.1 -尿素氮試劑 5.0 5.02%二乙酰一肟液 0.5 0.5 2、混勻,置沸水浴中煮沸10分鐘后用冷水冷卻5分鐘,在波長(zhǎng)540nm處比色測(cè)定,以空白管調(diào)零.計(jì)算：血清尿素氮含量=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度*0.7*5（mmol/l）正常值：3.2-7.1 mmol/l【教學(xué)方法】 1.課堂講授 2.指導(dǎo)學(xué)生操作 3.課堂提問 4.課外實(shí)驗(yàn)報(bào)告作業(yè)【復(fù)習(xí)思考題】 、注意操作誤差；、此份血清本來是否正常？、時(shí)間是否充足？ 實(shí)驗(yàn)七 動(dòng)物組織細(xì)胞基因組DNA的提取【預(yù)習(xí)要求】 預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理和具體操作內(nèi)容?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1、掌握動(dòng)物組織細(xì)胞基因組DNA提取的原理和操作方法。 2、掌握相對(duì)分子質(zhì)量較大的DNA純度檢測(cè)技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】 一、實(shí)驗(yàn)原理真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。蛋白酶K的