利用啤酒和味精廢水開發(fā)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基及其應(yīng)用研究

1、利用啤酒和味精廢水開發(fā)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基及其應(yīng)用研究學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院年級： 2008級專業(yè)：食品科學(xué)與工程指導(dǎo)老師：楊小蘭姓名：趙立學(xué)號： 2008314038摘要：利用啤酒和味精廢水.經(jīng)稀釋添加某些成分后，成功研制出微生物發(fā)酵培養(yǎng)基。比較研究了真菌、細菌和鏈霉菌(生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌)利用食品工業(yè)廢水發(fā)酵培養(yǎng)基的可能性。結(jié)果表明，井岡霉素菌和阿維菌素菌不能利用廢水培養(yǎng)基，分離、保存的特異灰色鏈霉菌西藏變種TAS-1和代號為HX-0501乳黃色細菌能利用廢水發(fā)醉培養(yǎng)基。經(jīng)生物測試，其發(fā)酵代謝產(chǎn)物對多種病原真菌具有很高的拮抗作用。該研究為利用食品工業(yè)廢水生產(chǎn)生物農(nóng)藥微生物處理廢水及廢物再生利用找到了一

2、條新的途經(jīng)。關(guān)鍵詞:食品工業(yè)廢水發(fā)酵培養(yǎng)基微生物生物農(nóng)藥1概述我國是世界第一大啤酒和味精生產(chǎn)國：2005年產(chǎn)啤酒3189/104t，每生產(chǎn)It啤酒平均排出約15m，廢水，目前每年生產(chǎn)啤酒產(chǎn)生的廢水在47835/104t以上。目前我國味精產(chǎn)量約130x104t。每年生產(chǎn)味精排出的廢水達3250xl04t左右。啤酒發(fā)酵廢水中主要污染因子是化學(xué)需氧量、生化需氧量和懸浮物，其濃度含量為化學(xué)需氧量1000一2500mg/L生化需氧量1500mg/L、懸浮物300-600mg/L、TN30-70mg/L(不同廠家濃度不同),pH值為4.5-7.0(顯微酸性)。味精廢水中化學(xué)需氧量含量高達(4-8)*100

3、00mg/L、生化需氧量(2-3)*10000mg/L、懸浮物為(l-2)*10000mg/L、菌體1.0%-15%、總氮約1.0%。味精廢水中有機物含量較高，有大量的氨態(tài)氮和硫酸根等，pH約3.0-3.4，是高濃度酸性有機廢水。生產(chǎn)啤酒和味精的原料主要是谷物類粉、蛋白質(zhì)、氨基酸等，其產(chǎn)生的廢中含有大量的淀粉、植物蛋白和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)。這些廢水如不能得到很好處理就直接排放，將對生態(tài)環(huán)境造成嚴重污染，同時也浪費了大量資源。TAS-l是從西藏高原土壤中分離到的l株特異灰色鏈霉菌，其活體和代謝產(chǎn)物對多種病原真菌具有極強的拮抗作用;AA、CL菌是稗草生防潛力菌禾長蠕抱菌改良的優(yōu)異特性的供體菌，同時也

4、是開發(fā)真菌蛋白農(nóng)藥的原始菌種以啤酒、味精發(fā)酵廢水為主要成分，添加少量其他元素研制成發(fā)酵培養(yǎng)基，一些特異的真菌、細菌和鏈霉菌能有效利用這些發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生菌絲團或發(fā)酵代謝產(chǎn)物。TAS-1和HX-0501發(fā)酵原液及稀釋10倍、50倍后，對多種病原真菌具有很好的研制效果。過去廢水處理主要依靠機械、物理及化學(xué)的方法。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，一些經(jīng)濟、高效、生態(tài)、可再生利用的生物處理廢水的技術(shù)得到開發(fā)并逐步應(yīng)用到實際中去。在味精廢水生物處理中，主要是利用味精廢水研制發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)蘇云金芽抱桿菌(B.t)生產(chǎn)生物農(nóng)藥。在利用廢水培養(yǎng)微生物進而處理廢水方面國內(nèi)已有一些研究報道，有人在利用

5、啤酒廢水養(yǎng)殖螺旋藻、培養(yǎng)單細胞蛋白(SCP)方面作過嘗試;在利用味精廢水培養(yǎng)微生物方面主要集中在培養(yǎng)、馴化蘇云金芽抱桿菌B.t菌株，達到既處理廢水又生產(chǎn)生物農(nóng)藥的目的。本研究試圖利用啤酒、味精工業(yè)廢水作為主要成分研制微生物發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)真菌、細菌和鏈霉菌。達到既處理廢水又能利用廢物、培養(yǎng)目標(biāo)菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的目的。2材料和方法2.1材料2.1.1發(fā)酵菌種灰色鏈霉菌西藏變種、交鏈抱菌、彎抱菌。HX-0501(乳黃色細菌，未鑒定)、井岡霉素菌、阿維菌素菌。2.1.2供測病原菌稻瘟病菌、紋枯病菌、稻葉鞘腐敗病菌、稻惡苗病菌、蘭花炭疽病菌等。井岡霉素菌、阿維菌素菌分別由浙江桐廬匯豐生物化工有限公司和

6、浙江升華拜克生物股份有限公司提供外，其他菌種均為本研究室分離保存。2.1.3培養(yǎng)基質(zhì)啤酒廢水培養(yǎng)基、味精廢水培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖(葡萄糖)培養(yǎng)基(PD)。2.2方法2.2.1廢水培養(yǎng)基的制備2.2.1.1 PD發(fā)酵培養(yǎng)基:按200g去皮馬鈴薯在1000mL水中煮沸后再煮15一20min，加人189蔗糖或葡萄糖即可。2.2.1.2 啤酒廢水培養(yǎng)基:按啤酒廢水與水體積比為1:4.5-5.5進行稀釋，調(diào)節(jié)值至6.5-7.2，葡萄糖或蔗糖1.0%-2.0%(g/mL)、尿素1.0%-2.0%(g/mL)、，以及常用和常規(guī)量的無機鹽、微量元素。2.2.1.3 味精廢水培養(yǎng)基:按味精廢水與水體積比為l:4-

7、6進行稀釋，調(diào)節(jié)pH值至6.5-7.2，葡萄糖或蔗糖1.5%一2.0%(g/mL)、淀粉2.0%一3.0%(g/mL)、，以及常用和常規(guī)量的無機鹽，添加量為0.1%-0.15%(g/mL)、微量元素維生素C、,添加量為0.03%-0.05%(g/mL)。2.2.2 保存在冰箱中的上述各菌種移人PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)5一6d備用。啤酒、味精廢水培養(yǎng)基分別取200mL裝人500mL三角瓶中，用“妙潔”牌PE保鮮錫膜封口，在121、0.15MPa高溫高壓下滅菌30min，取出冷卻備用。2.2.3 真菌、細菌、放線菌利用廢水培養(yǎng)基試驗發(fā)酵菌種AA菌、CL菌、HX一0501菌、TAS-1菌、井岡霉素菌和

8、阿維菌素菌各取直徑7mm的菌塊5塊，分別接人上述滅菌培養(yǎng)基中，以不接菌的培養(yǎng)基為空白對照。封口錫膜用接種針打7個小孔以利通氣。2.2.4接種后的三角瓶置空氣恒溫搖床，在(28土0.5)、125-130r/min振蕩發(fā)培養(yǎng)7d，觀察發(fā)酵液濁度、利用情況、真菌菌絲團大小，測定菌絲團質(zhì)量。2.2.5發(fā)酵濾液生物測定TAS-1和HX-0501菌在啤酒、味精廢水及PD發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵液在13000r/min高速離心15min，濾出上清液備用。原液對峙培養(yǎng)測定將7mm直徑滅菌吸水濾紙浸吸發(fā)酵原液放人PDA培養(yǎng)基平板，距吸水濾紙15mm處接種7mm直徑被測菌塊，置28恒溫培養(yǎng)，在3d和7d(紋枯菌在3d和

9、7d)測量菌落直徑。將發(fā)酵濾液加人PDA培養(yǎng)基稀釋配成一定濃度的發(fā)酵液一PDA培養(yǎng)基。測定對稻瘟病菌、紋枯病菌、葉鞘腐敗病菌、惡病菌、蘭花炭疽病菌等的抑菌效果。取上清液與PDA培養(yǎng)基混合，配成稀釋10、50、100倍的上清液一PDA培養(yǎng)基，倒入直徑為90mm滅菌培養(yǎng)皿中，制成不同濃度發(fā)酵上清液一PDA平板，以不加發(fā)酵液的PDA為對照。將直徑7mm的供測病原真菌菌塊接入上述平板中央，置28恒溫培養(yǎng)，在3d、7d(紋枯病菌在3d、7d)測定菌落直徑，計算抑菌率。3結(jié)果與分析3.1廢水發(fā)酵培養(yǎng)基利用試驗測定了AA、CL(真菌)，井岡霉素菌、阿維菌素菌、TAS-l(鏈霉菌)和HX-0501(細菌)對廢

10、水發(fā)酵培養(yǎng)基的利用。結(jié)果表明，AA和CL菌能很好的利用啤酒、味精廢水為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)后產(chǎn)生大量的菌絲團(球)，菌絲團黃褐色一黑色、直徑大小不等。CL菌在3種廢水酵培養(yǎng)基中生長情況好于AA菌。培養(yǎng)液由發(fā)酵前的渾濁狀，變成淺黃至金黃色清澈的液體，對廢水起到凈化作用。TAS-1和HX-0501也能利用3種廢水培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。HX-0501菌在啤酒、味精廢水培養(yǎng)基中形成大量渾濁狀細菌，顏色由乳黃色到淺黃色。TAS-1在上述3種廢水培養(yǎng)基中發(fā)酵，產(chǎn)生大量細小的放線菌球，菌球乳黃色一淺黃色，發(fā)酵液淺黃至金黃色(見表l)。但井岡霉素菌和阿維菌素菌不能利用啤酒、味精廢水培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。3.

11、2 TAS-l和HX-0501發(fā)酵濾液的生物測定3.2.1原液對峙測定先用發(fā)酵濾液原液采用對峙培養(yǎng)法測定對水稻稻瘟病菌、紋枯病菌、惡苗病菌、葉鞘腐敗病菌，蘭花炭疽病菌和葉斑病菌的拮抗作用。TAS一l在啤酒、味精培養(yǎng)基中發(fā)酵原液對稻瘟、紋枯、炭疽和葉斑病菌的拮抗作用較強，抑制率均在80%以上、對惡苗和鞘腐病菌稍差，抑制率在63%-77%。TAS-1在PD培養(yǎng)基中發(fā)酵原液對炭疽病菌抑制率在80%以上外，對其他5個病原菌抑制率均在80%以下。HX-0501在4種發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵原液對稻瘟病菌的抑制率超過80%，在啤酒、味精培養(yǎng)基中發(fā)酵原液對水稻紋枯、葉鞘腐敗病菌，蘭花炭疽和葉斑抑制率在75%-82%

12、，對惡苗病菌較差，抑制率為68.8%-73.8%。HX-0501在PD培養(yǎng)基中發(fā)酵原液除對稻瘟菌抑制率為81.2%外，對其他5個病原菌抑制率在67.5%-70.5% (見圖1、2，圖中: 1、啤酒廢水發(fā)酵葡萄酒，2、味精廢水發(fā)酵培養(yǎng)基，3、PD發(fā)酵培養(yǎng)基)。3.2.2發(fā)酵原液稀釋測定將TAS-l和HX-0501在啤酒、味精和PD培養(yǎng)基中的發(fā)酵原液分別稀釋10、50、100倍，測定了對稻瘟病菌強致病力菌株中AI和中Bl、惡苗病菌和紋枯病菌的抑菌效果。TAS-1在啤酒、味精中的發(fā)酵原液稀釋10、50倍時，培養(yǎng)7d(紋枯菌5d)對稻瘟菌、惡苗菌和紋枯菌的抑制率在59.8%-822%，在PD中的發(fā)酵液

13、抑菌效果比啤酒、味精中的稍差。TAS-1在3種培養(yǎng)基中的發(fā)酵原液稀釋100倍后對供試的所有菌抑菌率菌明顯下降。Hx-0501在啤酒、味精、PD培養(yǎng)基中發(fā)酵原液稀釋10倍對稻瘟菌、紋枯菌和惡苗菌拮抗較強，稀釋50倍后效果有所下降，稀釋100倍后抑菌效果下降明顯。HX-0501對紋枯菌的拮抗作用強于TAS-1，結(jié)果見表2、3。3 結(jié)論本研究利用啤酒、味精廢水為主要原料，成功研制出發(fā)酵培養(yǎng)基。試驗證明我們分離、保存的AA、CL真菌，TAS-1放線菌和HX-0501細菌均能在上述工農(nóng)業(yè)發(fā)酵廢水培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，TAS-l和HX-0501發(fā)酵培養(yǎng)后可產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。生物測試結(jié)果表明，TAS-1和HX-05

14、01代謝產(chǎn)物對水稻多個病原真菌和蘭花病原菌具有較好的防治效果?，F(xiàn)正優(yōu)化廢水培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)TAS-1和HX-0501的工藝參數(shù)，以獲得兩菌的高發(fā)酵效價。利用廢水研制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)特定微生物生產(chǎn)生物農(nóng)藥目前正申請國家發(fā)明專利。是否可利用食品工業(yè)廢水大規(guī)模生產(chǎn)食用菌菌種也值得進一步研究。隨著生活水平的提高，人們對自身健康、糧食、食品及環(huán)境安全等越來越重視，要求改善生產(chǎn)、生活環(huán)境的呼聲越來越高。黨和政府高度重視環(huán)境保護，已將其作為基本國策。利用生化方法和微生物技術(shù)相結(jié)合處理工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的廢水，一方面達到凈化、處理廢水的目的;另一方面可充分利用廢水中的有機營養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)生物蛋白、絮凝劑、生物農(nóng)藥等。這

15、種變廢為寶、廢物循環(huán)再生利用，具有經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益同步的效果。這類方法和技術(shù)必將得到進一步的重視和發(fā)展，應(yīng)用前景十分廣闊。4 參考文獻1林劍.利用味精廢水深層培養(yǎng)蘇云金桿菌.化工環(huán)保，1999，19(2):100-103.2黃世文，盧繼英，段桂芳，等.兩株放線菌對病原真菌的生測及其發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選.見:中國植物保護學(xué)會第九屆全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文集.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2005，664-670.3黃世文，余柳青，AlanKWatson.影響鏈格飽菌生長及產(chǎn)抱的因子.中國生物防治，17(1):16-19.4黃世文，段桂芳，顏秋生，等.稗彎抱菌原生質(zhì)體的制備.科學(xué)技術(shù)與工程，

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