生物制藥技術(shù)(三)

1、 第三章第三章細胞工程制藥細胞工程制藥細胞是一切生命活動的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。細胞是一切生命活動的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。 uMuller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細胞。uVirchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。uLuginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。uLange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發(fā)生融合的過程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。u1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙

2、臺病毒具有觸發(fā)動物細胞融合的效應(yīng)。u1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細胞。u20世紀80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。幾種細胞融合成功的例子幾種細胞融合成功的例子植物融合細胞成長狀態(tài)對比植物融合細胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞細胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細胞 動物細胞融合實驗使用的小白鼠 病毒促使細胞融合的主要步驟如下：病毒促使細胞融合的主要步驟如下：用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細胞融合過程示意

3、圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細胞融合過程示意圖 u聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細胞融合劑。uPEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。uPEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細胞。uPEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEG）法）法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程）法細胞融合過程PEG的作用機理的作用機理： 由于由于PE

4、G分子具有輕微的負極性，分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。成為可能。 PEG誘導(dǎo)融合的特點誘導(dǎo)融合的特點：其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。設(shè)備；融

5、合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害?？赡軐毎卸竞?。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法細胞融合步驟細胞融合步驟（1）將兩種不同親本細胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng) 液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細胞。3、電融合法、電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細胞融合技術(shù)，在直流電脈沖

6、的誘導(dǎo)下，細胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：電融合法的優(yōu)點：u融合率高、重復(fù)性強、對細胞傷害??；u裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；u免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。電融合的基本過程：電融合的基本過程：細胞膜的接觸：細胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使

7、原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖電融合誘導(dǎo)法原理示意圖第二節(jié)第二節(jié) 動物細胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用4、激素、激素5、酶、酶6、病毒殺蟲劑、病毒殺蟲劑7、腫瘤特異性抗原、腫瘤特異性抗原8、單克隆抗體、單克隆抗體9、細胞本身、細胞本身 （anchoraged-independent ce

8、ll ） 缺點：缺點： （1）提供激素及低分子量營養(yǎng)物。）提供激素及低分子量營養(yǎng)物。（2）提供結(jié)合蛋白質(zhì)，能識別維生素、脂類、）提供結(jié)合蛋白質(zhì)，能識別維生素、脂類、 金屬和其他激素等。金屬和其他激素等。（3）有些情況下，結(jié)合蛋白能與有毒金屬和熱）有些情況下，結(jié)合蛋白能與有毒金屬和熱 原結(jié)合，起到解毒作用原結(jié)合，起到解毒作用（4）起酸堿度緩沖劑作用。）起酸堿度緩沖劑作用。（5）提供蛋白酶抑制劑，使細胞傳代時使用的）提供蛋白酶抑制劑，使細胞傳代時使用的 胰蛋白酶失活，保護細胞不受損傷。胰蛋白酶失活，保護細胞不受損傷。血清對實驗的負面影響：血清對實驗的負面影響： 空氣提升式生物反應(yīng)器兩種構(gòu)型：空氣提

9、升式生物反應(yīng)器兩種構(gòu)型： 內(nèi)循環(huán)式、外循環(huán)式內(nèi)循環(huán)式、外循環(huán)式 空氣流速一般控制在空氣流速一般控制在0.010.06m3/m3.min,反應(yīng)器高徑比一般為反應(yīng)器高徑比一般為(3:1)(12:1) （1）沒有移動部件，產(chǎn)生的湍動溫和而均勻，）沒有移動部件，產(chǎn)生的湍動溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，細胞損傷率比較低。剪切力相當(dāng)小，細胞損傷率比較低。 （2）完全密封，便于無菌操作，不易污染。）完全密封，便于無菌操作，不易污染。 （3）設(shè)計簡單，便于放大生產(chǎn)。）設(shè)計簡單，便于放大生產(chǎn)。 （4）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體循環(huán)量大，使細胞和營養(yǎng)成分能均勻地分布于培

10、養(yǎng)循環(huán)量大，使細胞和營養(yǎng)成分能均勻地分布于培養(yǎng)基中。基中。（3 3）、中空纖維生物反應(yīng)器）、中空纖維生物反應(yīng)器 第三節(jié)第三節(jié) 植物細胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用葉綠體線粒體細胞壁細胞膜液泡細胞質(zhì)光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞核粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基體二、植物細胞培養(yǎng)的二、植物細胞培養(yǎng)的 誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期對數(shù)增殖對數(shù)增殖 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 衰減期衰減期 靜靜 止止0 40 80 120 160 200 細細胞胞濃濃度度(g/L)培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間(h)植物細胞生長曲線植物細胞生長曲線植物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的比較植物細胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的比較特性特性 微生物微生物 植物細胞植物細胞大小大小 2 mm3 3 10105

11、 5 mm3 3 單一細胞單一細胞 經(jīng)常經(jīng)常 一般以群體發(fā)育一般以群體發(fā)育由單細胞生長成細胞群由單細胞生長成細胞群 是是 少有少有加成時間加成時間 大于大于1 1h 1d d接種濃度接種濃度 小小 細胞在培養(yǎng)液中濃度為細胞在培養(yǎng)液中濃度為5% 5% 20% 20%染色體數(shù)目染色體數(shù)目 單或雙倍體單或雙倍體 單、雙、多及不定倍體混合生長單、雙、多及不定倍體混合生長切力切力 不敏感不敏感 敏感敏感單一培養(yǎng)的變異單一培養(yǎng)的變異 安定安定 變異很大變異很大發(fā)育發(fā)育 可形成孢子或假菌絲可形成孢子或假菌絲 形成器官或胚形成器官或胚通氣需求通氣需求 高，高，1 1 2 2m3/m3.min 低，低，0.2

12、0.30.3m3/m3.min 產(chǎn)物形成產(chǎn)物形成 進入菌絲進入菌絲 進入液泡進入液泡 有有13種植物必需的元素種植物必需的元素 N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl，前前6種為大量元素，后種為大量元素，后7種種屬微量元素。屬微量元素。I雖不是植物生長所必需的，但幾雖不是植物生長所必需的，但幾乎所有組織培養(yǎng)基中都有，有些培養(yǎng)基還加入乎所有組織培養(yǎng)基中都有，有些培養(yǎng)基還加入Co、Ni、Ti、Be，、，、Al等元素。等元素。 。 這些物質(zhì)不是植物細胞生長所必需的，這些物質(zhì)不是植物細胞生長所必需的，但對細胞生長有益。如活性炭可以降低組織培但對細胞生長有益。如活性炭可以降低

13、組織培養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對細胞生長有利。液養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對細胞生長有利。液體培養(yǎng)基中加入瓊脂糖，可改善培養(yǎng)細胞的供體培養(yǎng)基中加入瓊脂糖，可改善培養(yǎng)細胞的供氧狀況。氧狀況。 植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，它們的作用是供給一些必需的微量營養(yǎng)成它們的作用是供給一些必需的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素物質(zhì)等。分、生理活性物質(zhì)和生長激素物質(zhì)等。 2 2、光、光 植物細胞代謝產(chǎn)物的合成受光質(zhì)和植物細胞代謝產(chǎn)物的合成受光質(zhì)和光量的調(diào)節(jié)。光量的調(diào)節(jié)。 對于黃酮、黃酮醇、花色素苷、萘對于黃酮、黃酮醇、花色素苷、萘醌、多酚、揮發(fā)油、萜烯和其他次級代醌、多酚、揮發(fā)

14、油、萜烯和其他次級代謝的合成和積累來講，光質(zhì)和光量具有謝的合成和積累來講，光質(zhì)和光量具有重要的影響。重要的影響。 最適生長溫度最適生長溫度25253030，此外，溫，此外，溫度對培養(yǎng)基成分的利用速度也有一定的度對培養(yǎng)基成分的利用速度也有一定的影響。影響。 KessellKessell和和CarrCarr在驗證溶解氧對攪動通氣在驗證溶解氧對攪動通氣培養(yǎng)的胡蘿卜細胞生長和分化的影響時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的胡蘿卜細胞生長和分化的影響時，發(fā)現(xiàn)有一個臨界氧水平。在臨界水平之上，生長不有一個臨界氧水平。在臨界水平之上，生長不受溶解氧的影響，根據(jù)干重或細胞數(shù)目計算的受溶解氧的影響，根據(jù)干重或細胞數(shù)目計算的生長呈指數(shù)增

15、加。而低于這個臨界值時，干重生長呈指數(shù)增加。而低于這個臨界值時，干重增加呈線性，而細胞數(shù)目仍以指數(shù)形式增加。增加呈線性，而細胞數(shù)目仍以指數(shù)形式增加。 1 1 組織培養(yǎng)：組織培養(yǎng)： 植物細胞工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)首先是細胞生物量的植物細胞工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)首先是細胞生物量的增長，細胞即為重要的產(chǎn)品之一。如人參細胞制增長，細胞即為重要的產(chǎn)品之一。如人參細胞制成人參細胞粉，既是保健食品原料，也可作為藥成人參細胞粉，既是保健食品原料，也可作為藥材，其中除含人參皂苷（人參皂苷含量材，其中除含人參皂苷（人參皂苷含量7%，超，超過了原植物過了原植物 ）外，還）外，還含有天然人參所不具有的酶含有天然人參所不具有的酶類及其

16、活性成分，其保健作用優(yōu)于天然人參。類及其活性成分，其保健作用優(yōu)于天然人參。 日本曾用煙草細胞培養(yǎng)收集煙草細胞作為煙日本曾用煙草細胞培養(yǎng)收集煙草細胞作為煙草原料。草原料。2 2、初級及次級代謝物的生產(chǎn)、初級及次級代謝物的生產(chǎn)化合物化合物細胞來源細胞來源作用作用紫草素紫草素紫草細胞紫草細胞抗炎劑，食用色素抗炎劑，食用色素辣椒素辣椒素朝天椒細胞朝天椒細胞食品，化妝品色素食品，化妝品色素甘草精甘草精甘草細胞甘草細胞甜味劑甜味劑香豆素香豆素薰衣草細胞薰衣草細胞香料香料薄荷醇薄荷醇薄荷細胞薄荷細胞香料香料黃連素黃連素黃連細胞黃連細胞止瀉藥止瀉藥類胰島素類胰島素苦瓜細胞苦瓜細胞治療糖尿病治療糖尿病毛地黃毒素

17、毛地黃毒素毛地黃細胞毛地黃細胞強心藥強心藥利血平利血平羅夫杉細胞羅夫杉細胞降血壓藥降血壓藥奎寧堿奎寧堿金雞納樹金雞納樹抗瘧疾抗瘧疾長春花堿長春花堿長春花長春花治療白血病治療白血病可卡因可卡因古柯植物古柯植物抗阿米巴病抗阿米巴病尼古丁尼古丁煙草煙草殺蟲藥殺蟲藥嗎啡嗎啡罌粟罌粟止痛藥止痛藥九、植物細胞培養(yǎng)的幾個技術(shù)難題九、植物細胞培養(yǎng)的幾個技術(shù)難題 植物細胞生產(chǎn)周期一般為植物細胞生產(chǎn)周期一般為25 3535d d， 由于生產(chǎn)效率低，設(shè)備周轉(zhuǎn)慢，能源、勞力由于生產(chǎn)效率低，設(shè)備周轉(zhuǎn)慢，能源、勞力 消耗多，因而成本高。消耗多，因而成本高。 成塊后使細胞生長速度變慢，細胞的性成塊后使細胞生長速度變慢，細胞

18、的性質(zhì)有差異，有效成分的含量不一樣，影響產(chǎn)質(zhì)有差異，有效成分的含量不一樣，影響產(chǎn)品的質(zhì)量的產(chǎn)量，另外造成管路堵塞等麻煩。品的質(zhì)量的產(chǎn)量，另外造成管路堵塞等麻煩。 選用松散易分散的起始材料，培養(yǎng)過程選用松散易分散的起始材料，培養(yǎng)過程中隨時除去細胞團塊，提高生長素的濃度向中隨時除去細胞團塊，提高生長素的濃度向培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入EDTA-NaEDTA-Na螯合劑和果膠酶等。螯合劑和果膠酶等。 包括特異性免疫包括特異性免疫( (Specific Specific immunity)immunity)和非特異性免疫。和非特異性免疫。 一、免疫系統(tǒng)一、免疫系統(tǒng) 當(dāng)機體受到抗原刺激后，一當(dāng)機體受到抗原

19、刺激后，一類小淋巴細胞類小淋巴細胞- -依賴胸腺的依賴胸腺的T T細胞細胞發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細發(fā)生增生、分化，直接攻擊靶細胞或間接地釋放一些淋巴因子，胞或間接地釋放一些淋巴因子，從而使機體達到免疫的過程。從而使機體達到免疫的過程。 細胞免疫：細胞免疫： 單克隆抗體：單一的特異性抗體即為單一單克隆抗體：單一的特異性抗體即為單一B細胞克隆抗體，細胞克隆抗體，B型淋巴細胞的增生過程是一個型淋巴細胞的增生過程是一個無性繁殖過程，即由一個無性繁殖過程，即由一個B細胞分裂而形成的細細胞分裂而形成的細胞 群 ， 稱 為 一 個 克 隆 。 單 克 隆 抗 體胞 群 ， 稱 為 一 個 克 隆 。 單

20、 克 隆 抗 體(Monoclonal antibody,McAb) 也稱為單抗。也稱為單抗。 多克隆抗體多克隆抗體(Polyclonal antibody) ：多多種種B型淋巴細胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物。型淋巴細胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物。 19751975年，英國年，英國Milstein Milstein 和和KohlorKohlor將經(jīng)將經(jīng)綿羊細胞免疫的小鼠脾綿羊細胞免疫的小鼠脾B B淋巴細胞與小鼠骨淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞在仙臺病毒的誘導(dǎo)下進行融合，利髓瘤細胞在仙臺病毒的誘導(dǎo)下進行融合，利用用HATHAT選擇性培養(yǎng)基篩選出融合后形成的雜選擇性培養(yǎng)基篩選出融合后形成的雜交細胞，這種細胞既有

21、小鼠骨髓瘤細胞在體交細胞，這種細胞既有小鼠骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的本領(lǐng)，又有外培養(yǎng)條件下大量繁殖的本領(lǐng)，又有B B淋巴淋巴細胞分泌特異性抗體的能力，使得單克隆抗細胞分泌特異性抗體的能力，使得單克隆抗體在體外生產(chǎn)成為可能。體在體外生產(chǎn)成為可能。1 1 、新型診斷試劑：、新型診斷試劑：紅細胞表面的糖蛋白：紅細胞表面的糖蛋白：A、B型型AB型：兩種都帶型：兩種都帶O型：兩種血型物質(zhì)都不帶型：兩種血型物質(zhì)都不帶 法國輸血中心還研制出了可分辯法國輸血中心還研制出了可分辯A型、型、B型、型、AB型血型的單克隆抗體診斷盒。型血型的單克隆抗體診斷盒。 單克隆抗體可用在體內(nèi)定位診斷上，單克隆抗體可用

22、在體內(nèi)定位診斷上，不同的癌癥或腫瘤在體內(nèi)所表現(xiàn)出的癌不同的癌癥或腫瘤在體內(nèi)所表現(xiàn)出的癌抗原或瘤抗原不同，可以獲得各種特異抗原或瘤抗原不同，可以獲得各種特異的單克隆抗體，再采用合適的同位素標(biāo)的單克隆抗體，再采用合適的同位素標(biāo)記表使特異的單克隆抗體上帶有放射性記表使特異的單克隆抗體上帶有放射性標(biāo)記。標(biāo)記。 單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正顯示著巨大的優(yōu)勢，其中治療效果較好顯示著巨大的優(yōu)勢，其中治療效果較好的有白血病、淋巴瘤、腎癌、肉瘤、黑的有白血病、淋巴瘤、腎癌、肉瘤、黑色素瘤、肝癌以及胃腸道腫瘤等。色素瘤、肝癌以及胃腸道腫瘤等。 1、放射性核素標(biāo)記的抗體治療藥物 抗體

23、作為放射性核素的導(dǎo)向載體，操作簡單、用量小，且能觀察到藥物在體內(nèi)的分布和藥物動力學(xué)，放射性標(biāo)記的抗體有較大的殺傷范圍，有利于克服腫瘤表面抗原的異質(zhì)性，對腫瘤細胞的殺傷也不依賴抗原抗體結(jié)合后的吸收作用，由于分子量小，容易穿透到達腫瘤部位。 2、抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物 （1）、常用抗癌藥 氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺等，以人血清白蛋白為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的氨甲喋呤量，使體外細胞毒性提高倍。 （2）、抗體類藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥性 腫瘤細胞對抗原藥物可產(chǎn)生多藥耐藥性。 毒素偶聯(lián)的抗體藥物 1、免疫毒素及其換代制品 毒素和抗體的交聯(lián)物稱為免疫毒素免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、

24、B鏈的完整的毒素和抗體的交聯(lián)物，應(yīng)用有限， 第二代免疫毒素利用抗體或抗體片段與毒素作用，在體內(nèi)有一定的抗腫瘤作用； 第三代免疫毒素重組免疫毒素，特異性好，穩(wěn)定性強，滲透性好，免疫原性低，可大量制備。 2、免疫毒素的制備 來源:主要是細菌毒素和植物毒素。 載體種類：小分子抗體FV和SCFV；細胞生長因子可與細胞膜上的受體結(jié)合；激素，可識別細胞表面的受體；CD4可識別HIV表達的糖蛋白。 先克隆出細胞基因，再利用基因重組技術(shù)去除毒素中非特異性結(jié)合部位基因，經(jīng)過改造的毒素基因再與載體基因的互補DNA重組，轉(zhuǎn)入受體菌中表達，形成融合蛋白，再經(jīng)純化可得到重組的免疫毒素。 3、免疫毒素的臨床應(yīng)用 可用于治

25、療腫瘤、自身免疫病、并能克服組織移植排斥反應(yīng)，可單獨給藥也可包裹在脂質(zhì)體及其他微粒中給藥，在胞漿物質(zhì)代謝中發(fā)揮作用，相對分子量小，滲透力強、效果好。 抗HBsAg的單克隆抗體生產(chǎn)工藝 抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)單克隆抗體是專一性識別HBsAg的單一抗體，能與HBsAg產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 臨床上用于檢測乙型肝炎病毒的感染并用于生產(chǎn)預(yù)防乙肝的免疫制劑，目前生產(chǎn)抗HBsAg的單克隆抗體技術(shù)有基因工程與細胞工程。 免疫大鼠脾淋巴細胞與大鼠骨髓瘤的IR983F細胞融合技術(shù)制造抗HBsAg單克隆抗體的工藝。 (1)(1)工藝流程工藝流程 大鼠骨髓瘤細胞+免疫大鼠脾淋巴細胞 融合混合物 雜種細胞混合物 雜

26、交瘤克隆系 細胞種質(zhì) 培養(yǎng)液 粗制McAb 層析液 濃縮液 McAb精品 (2)工藝過程工藝過程 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： 大鼠骨髓瘤IR983 F細胞系的培養(yǎng)基為改良的改良的 (DMEM)培培養(yǎng)基。養(yǎng)基。 使Eagle培養(yǎng)基中15種氨基酸濃度增加1倍， 8種維生素濃度增加3倍而成，用于細胞培養(yǎng)，提高了細胞生長效果。 其中尚需10%滅活小牛血清，1%非必需氨基酸，0.1molL丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺及50mgmI慶大霉素；雜交瘤細胞篩選系統(tǒng)用含HAT的DMEM培養(yǎng)基。 飼養(yǎng)細胞制備： 在細胞融合前23天，取健康大鼠處死，向腹腔內(nèi)注入10mlDMEM培養(yǎng)液 輕壓腹腔使細胞懸浮，打開腹壁皮膚，暴露腹膜，提

27、起腹膜中心，插入注射針頭，吸出全部細胞懸液； 500g離心5min，用pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液洗滌2-3次； 收集細胞，用含10小牛血清、100Uml青霉素和鏈霉素及HAT的DMEM培養(yǎng)液制成106細胞ml懸浮液； 使用24孔板時，每孔加0.1ml，當(dāng)使用96孔板時，則制成2x105細胞ml的懸浮液，每孔加0.1ml， 然后置37的CO2培養(yǎng)箱中溫育，備用。 親本細胞準備：親本細胞準備： 取對8氮鳥嘌呤抗性的Louc大鼠非分泌型漿細胞瘤IR983F細胞，用常規(guī)方法制成細胞懸浮液，按1.5x105細胞ml接種量接種于DMEM培養(yǎng)液中，于37CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)常規(guī)消化分

28、散法用DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸浮液，即為待融合用骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞親本，備用。 另取HBsAg用pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液溶解并稀釋成20gml的溶液，加等體積福氏完全佐劑充分乳化后，取2ml注入Louc大鼠腹腔，2周后進行第2次免疫，3個月后于融合前34天進行加強免疫，3次免疫的劑量和注射途徑均相同，唯第3次免疫時不加福氏佐劑， 于細胞融合前處死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后對右上腹部消毒，剖開腹部，用無菌剪刀與鑷子取出脾臟脾臟，用pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液洗去血液，在無菌燒杯或培養(yǎng)皿中切成1mm3小塊，再用磷酸緩沖液洗滌34次，直至澄清，傾去洗滌液， 加入組織塊56倍

29、體積(質(zhì)量體積)的0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.67.8)于37度保溫，消化20一40min，每10min輕搖消化瓶1次，直至組織塊松軟為止，傾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸緩沖液洗滌35次，然后加入少量磷酸緩沖液用10ml吸管吹打分散，至大部分組織塊分散為細胞， 用兩層無菌紗布過濾，未分散的組織塊再加少量磷酸緩沖液吹打和分散，合并細胞濾液，離心收集細胞并用磷酸緩沖液洗滌23次，然后用無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋制成細胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細胞親本，備用。 固定化抗大鼠K輕鏈單抗的制備： 本法所用載體也為Sepharose 4B，其活化方法與制備固定化t-PA相同 取30g活化的Sepha

30、rose 4B懸浮于100ml，pH10.2，0.025mol/L硼酸緩沖液中，另取1g抗大鼠K輕鏈的McAb(MARK-1)溶于25ml硼酸緩沖液， 然后加至上述已活化的Sepharose 4B懸浮物中，于10度攪拌反應(yīng)1620h，將其裝柱(直徑2cm*50cm)并用10倍柱床體積(體積體積)的上述硼酸緩沖液以56mlmin流速洗滌柱床，收集流出液， 測A280并根據(jù)流出液計算偶聯(lián)效率然后依次用5倍柱床體積(體積體積)的pH10，0.1mol/L乙醇胺溶液及pH8.0，0.1molL硼酸緩沖液充分洗滌 最后用pH7.4，0.1mo/L磷酸緩沖液洗至流出液A280小于0.01，即得抗HBsAg

31、 McAb的親和吸附劑，將其轉(zhuǎn)移至含0.01NNaN3的pH7.4，0.1mol磷酸緩沖液中，于4貯存，備用。 細胞融合：細胞融合： 取107個IR983 F細胞與108個免疫大鼠脾淋巴細胞于50mi離心管中，混勻，在4度下，1500rmin離心810min，用巴斯德吸管小心吸去上清液，輕彈管底，使沉淀的細胞松動， 于37度水浴中保溫，并于lmin內(nèi)輕輕滴加0.8ml 50%PEG4000，同時用吸管尖輕輕攪動6090s，然后于2min內(nèi)緩慢滴加20mlDMEM培養(yǎng)液，1500rmin離心810min，吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至50ml，制成細胞懸浮液， 得細胞

32、融合混合物.取25ml融合混合物加至兩塊含飼養(yǎng)細胞的24孔微量培養(yǎng)板中，每孔加0.5ml； 余下25ml細胞融合混合物再用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至50m1，依上法再接種兩塊24孔培養(yǎng)板 依此類推，每次融合混合物可按種810塊24孔培養(yǎng)板，按IR983 F計，每孔接種細胞數(shù)約為105個，剩余融合物棄去 若用96孔板，則每孔接種細胞數(shù)約為104個然后于37度，C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24天，每天從各孔中吸去lml原培養(yǎng)液，替換含20%小牛血清及HAT的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至第56天可見小克隆，至910天可見大克隆，中途不換HT培養(yǎng)液。 若培養(yǎng)液出現(xiàn)淡黃色，可取出一部分培養(yǎng)液進行抗體檢

33、測。培養(yǎng)10天后改換含HT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)兩周后改用常規(guī)DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。雜交瘤細胞篩選： 篩選產(chǎn)生抗HBsAg單抗的雜交瘤細胞的方法是用AUSAB酶免疫試劑盒酶免疫試劑盒測定表達抗體的細胞， 即將包被了人HBsAg的聚苯乙烯珠與待測雜交瘤培養(yǎng)上清培育，然后用磷酸緩沖液洗滌34次，加入用生物素偶聯(lián)的HBsAg培育后洗滌，再加過氧化物酶標(biāo)記的親和素培育，最后用鄰苯二胺(OPD)顯色，經(jīng)酶標(biāo)儀定量測定，以確定產(chǎn)生抗HBsAg單抗的陽性孔。 經(jīng)檢測確定為產(chǎn)生抗HBsAg單抗的陽性孔細胞需進行克隆和再克隆，井經(jīng)全面鑒定與分析，最后才能獲得產(chǎn)生抗HBsAg單抗的雜交瘤克隆系。其過程如下： 將陽性孔中的培養(yǎng)細胞經(jīng)常規(guī)消化分散法制成細胞懸浮液，計數(shù)，用含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液依次稀釋成5X104細胞ml，5X103細胞ml、5X102細胞m1及5X10細胞ml細胞懸液， 然后在已有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板的第1一3行中，每孔接種5x10細胞ml細胞懸液0.1ml，每孔細胞數(shù)平均為