已整理現(xiàn)代分子生物學(xué)復(fù)習(xí)要點(diǎn)和習(xí)題

1、 第一章 緒論分子生物學(xué)分子生物學(xué)的基本含義 (p8)分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭開(kāi)生物世界的奧秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。分子生物學(xué)與其它學(xué)科的關(guān)系分子生物學(xué)是由生物化學(xué)、生物物理學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、以至信息科學(xué)等多學(xué)科相互滲透、綜合融會(huì)而產(chǎn)生并發(fā)展起來(lái)的，凝聚了不同學(xué)科專長(zhǎng)的科學(xué)家的共同努力。它雖產(chǎn)生于上述各個(gè)學(xué)科，但已形成它獨(dú)特的理論體系和研究手段，成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科。生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系最為密切 :生物化學(xué)是從化學(xué)角度研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，它著重研究生

2、物體內(nèi)各種生物分子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)變與新陳代謝。傳統(tǒng)生物化學(xué)的中心內(nèi)容是代謝，包括糖、脂類、氨基酸、核苷酸、以及能量代謝等與生理功能的聯(lián)系。分子生物學(xué)則著重闡明生命的本質(zhì)-主要研究生物大分子核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能、生命信息的傳遞和調(diào)控。細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系也十分密切:傳統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)主要研究細(xì)胞和亞細(xì)胞器的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與功能。探討組成細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)比單純觀察大體結(jié)構(gòu)能更加深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，因此現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展越來(lái)越多地應(yīng)用分子生物學(xué)的理論和方法。分子生物學(xué)則是從研究各個(gè)生物大分子的結(jié)構(gòu)入手，但各個(gè)分子不能孤立發(fā)揮作用，生命絕非組成成分的隨意加和或混合，分子生物學(xué)還需要進(jìn)一步研究各生

3、物分子間的高層次組織和相互作用，尤其是細(xì)胞整體反應(yīng)的分子機(jī)理，這在某種程度上是向細(xì)胞生物學(xué)的靠攏。第一章序論1859年發(fā)表了物種起源，用事實(shí)證明“物競(jìng)天擇，適者生存”的進(jìn)化論思想。指出：物種的變異是由于大自然的環(huán)境和生物群體的生存競(jìng)爭(zhēng)造成的，徹底否定了“創(chuàng)世說(shuō)”。達(dá)爾文第一個(gè)認(rèn)識(shí)到生物世界的不連續(xù)性。意義：達(dá)爾文關(guān)于生物進(jìn)化的學(xué)說(shuō)及其唯物主義的物種起源理論，是生物科學(xué)史上最偉大的創(chuàng)舉之一，具有不可磨滅的貢獻(xiàn)。細(xì)胞學(xué)說(shuō) 建立及其意義德國(guó)植物學(xué)家施萊登和動(dòng)物學(xué)家施旺共同提出：一切植物、動(dòng)物都是由細(xì)胞組成的，細(xì)胞是一切動(dòng)植物的基本單位。經(jīng)典遺傳學(xué)兩條基本規(guī)律:統(tǒng)一律：當(dāng)兩種不同植物雜交時(shí)，它們的下一

4、代可能與親本之一完全相同；分離規(guī)律：將不同植物品種雜交后的F1代種子再進(jìn)行雜交或自交時(shí)，下一代就會(huì)按照一定的比例分離，因而具有不同的形式。1865年發(fā)表植物雜交試驗(yàn)，直到1900年才被人們重新發(fā)現(xiàn)。孟德?tīng)柋还J(rèn)為經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人?，F(xiàn)代遺傳學(xué)Morgan及其助手第一次將代表某一特性的基因同染色體聯(lián)系起來(lái)，使科學(xué)界普遍認(rèn)識(shí)了染色體的重要性并接受了孟德?tīng)柕倪z傳學(xué)原理。Morgan特別指出：種質(zhì)必須由某些獨(dú)立的要素組成，我們把這些要素稱為遺傳因子或基因。第二節(jié) 分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史準(zhǔn)備和醞釀階段（19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初）對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的兩點(diǎn)重大突破：1確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)2確

5、定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段（20世紀(jì)50年代初到70年代初）:這一階段以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開(kāi)創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。在此期間的主要進(jìn)展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的意義：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；提出了堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為認(rèn)識(shí)核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。Crick于1954年所提出的中心法則（Central Dogma ）：

6、初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開(kāi)始改造生命的深入發(fā)展階段（20世紀(jì)70年代后至今） 基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為標(biāo)志。其間的重大成就包括：重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展基因組研究的發(fā)展單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域第三節(jié) 分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容 一DNA重組技術(shù)（recombinant DNA technology）定義：又稱為基因工程，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的原理，將一種生物的遺傳物質(zhì)DNA轉(zhuǎn)移到另一生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。DNA重組技術(shù)的應(yīng)用：利用微生物基因工程生產(chǎn)重組基因工程藥物、轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物體細(xì)胞克隆、基因表達(dá)與調(diào)

7、控的基礎(chǔ)研究。二生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究三基因組、功能基因組與生物信息學(xué)的研究基因組、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)基因組(Genome)：細(xì)胞或生物體一條完整單體的全部染色體遺傳物質(zhì)的總和。人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project, HGP）： 測(cè)定出人基因組全部DNA3109鹼基對(duì)的序列、確定人類約5-10萬(wàn)個(gè)基因的一級(jí)結(jié)構(gòu) ?；蚪M、蛋白質(zhì)組與生物信息學(xué)蛋白組計(jì)劃（Proteome project）:又稱為后基因組計(jì)劃或功能基因組計(jì)劃，用于揭示并闡明細(xì)胞、組織乃至整個(gè)生物個(gè)體全部蛋白質(zhì)及其功能。生物信息學(xué)（Bioinformatics）:是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信

8、息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。四基因表達(dá)調(diào)控研究第二章 染色體與DNA 本章內(nèi)容1. 染色體2. DNA的結(jié)構(gòu)3. DNA的復(fù)制4. 原核生物和真核生物DNA復(fù)制特點(diǎn)5. DNA的修復(fù)6. DNA的轉(zhuǎn)座第一節(jié) 染色體(chromosome)概念：染色體(chromosome)：原指真核生物細(xì)胞分裂中期具有一定形態(tài)特征的染色質(zhì)?，F(xiàn)在這一概念已擴(kuò)大為包括原核生物及細(xì)胞器在內(nèi)的基因載體的總稱。染色質(zhì)(chromatin)：由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，在分裂間期染色體結(jié)構(gòu)疏松，稱為染色質(zhì)。其實(shí)染色質(zhì)與染色體只是同一物質(zhì)在不同細(xì)胞周期的表現(xiàn)。常染色質(zhì)(euchromatin)：是進(jìn)行活躍轉(zhuǎn)錄的部位，呈疏松的環(huán)

9、狀，電鏡下表現(xiàn)為淺染，易被核酸酶在一些敏感的位點(diǎn)(hypersensitive sites)降解。異染色質(zhì)(heterochromatin)：在間期核中處于凝縮狀態(tài)，無(wú)轉(zhuǎn)錄活性，也叫非活動(dòng)染色質(zhì)(inactive chromatin)，是遺傳惰性區(qū)。在細(xì)胞周期中表現(xiàn)為晚復(fù)制，早凝縮，即異固縮現(xiàn)象(heteropycnosis)。原核細(xì)胞與真核細(xì)胞特征分析染色體特性：分子結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定能夠自我復(fù)制，使親、子代之間保持連續(xù)性能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制整個(gè)生命過(guò)程能夠產(chǎn)生可遺傳的變異真核細(xì)胞染色體的組成 DNA 30%-40% 組蛋白(histone) 30%-40% 非組蛋白(NHP) 變化很大

10、 少量RNA染色體中的蛋白質(zhì)組蛋白(histone)：一類小的帶有豐富正電荷(富含Lys、Arg)的核蛋白，與DNA有高親和力。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。 組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3及H4。 非組蛋白(non-histone protein)：是染色體上與特異DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，所以又稱為序列特異性DNA結(jié)合蛋白。 組蛋白具有如下特性：1、進(jìn)化上的極端保守性。2、 無(wú)組織特異性。3、肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性。4、組蛋白的修飾作用。5、富含賴氨酸的組蛋白H5。非組蛋白：非組蛋白大約占組蛋白總量的6070%，種類很多。（1）HMG蛋白(high mobilit

11、y group protein) ，能與DNA結(jié)合(不牢固)，也能與H1作用,或與DNA超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。（2）DNA結(jié)合蛋白 ：可能是一些與DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)。（3）A24非組蛋白 ：與H2A差不多，位于核小體內(nèi)，功能不祥。非組蛋白的一般特性： 1.非組蛋白的多樣性；非組蛋白的量大約是組蛋白的60%70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見(jiàn)的有15-20種。 2.非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。DNAC值：通常指一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值反?，F(xiàn)象：真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所

12、隔開(kāi)，這就是著名的“C值反常現(xiàn)象”。染色體中的DNA根據(jù)DNA的動(dòng)力學(xué)研究，真核細(xì)胞DNA可分為：高度重復(fù)序列：幾百幾萬(wàn) copy。如：衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。中度重復(fù)序列：10 幾百 copy。如：各種rDNA、tDNA及組蛋白基因。低度重復(fù)序列：2 10 copy。如：血紅蛋白。單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因和基因間間隔序列。只有一個(gè)拷貝。如：蛋清蛋白。染色體折疊DNA核小體螺線管圓筒超螺旋（1）核小體 染色質(zhì)纖維細(xì)絲是許多核小體連成的念珠狀結(jié)構(gòu)。核小體(nucleosome)：DNA繞在組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4各一對(duì))核心外1.8周(146bp)，形成核小體核心

13、顆粒。（2）螺線管10nm的染色質(zhì)細(xì)絲盤繞成螺旋管狀的30nm纖維粗絲，通稱螺線管（solenoid）。螺線管的每一螺旋包含6個(gè)核小體，其壓縮比為6。這種螺線管是分裂間期染色質(zhì)和分裂中期染色體的基本組分。（3）上述螺線管可進(jìn)一步壓縮形成超螺旋。由30nm螺線管纏繞而成一細(xì)長(zhǎng)、中空的圓筒，直徑為4 000nm，壓縮比是40。（4）超螺旋進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色體單體，總壓縮比是7×6×40×5，將近一萬(wàn)倍。原核生物基因組 特點(diǎn)：1、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練2、存在轉(zhuǎn)錄單元 多順?lè)醋觤RNA3、有重疊基因 Sanger1977在Nature上發(fā)表了X174 DNA的全部核苷酸序列，

14、正式發(fā)現(xiàn)了重疊基因。第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu)一、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) 所謂DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。基本特點(diǎn)DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤繞而成的。DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。兩條鏈上的堿基通過(guò)氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥(niǎo)嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對(duì)。2、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通常情況下，DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)分兩大類：一類是右手螺旋，如A-

15、DNA和B-DNA；另一類是左手螺旋，即Z-DNA。3、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類。DNA分子的超螺旋化可以用一個(gè)數(shù)學(xué)公式來(lái)表示：L=T+W其中L為連接數(shù)（linking number），是指環(huán)形DNA分子兩條鏈間交叉的次數(shù)。只要不發(fā)生鏈的斷裂，L是個(gè)常量。T為雙螺旋的盤繞數(shù)（twisting number），W為超螺旋數(shù)（writhing number），它們是變量。23DNA的復(fù)制2.3.1 DNA的半保留復(fù)制機(jī)理2.3.2 復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度2.3.3 復(fù)制

16、的幾種主要方式一、DNA的復(fù)制1、DNA的半保留復(fù)制 每個(gè)子代分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，所以這種復(fù)制方式被稱為DNA的半保留復(fù)制（semiconservative replication）。DNA的這種半保留復(fù)制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。2、復(fù)制的起點(diǎn)與方向 一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子（replicon）。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。多復(fù)制子：DNA復(fù)制時(shí)，原核生物一般只有一個(gè)起始位點(diǎn)，而真核生物則有多個(gè)起始位點(diǎn)，因而在復(fù)制時(shí)呈現(xiàn)多復(fù)制泡，也稱為多復(fù)制子。 DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速?gòu)?fù)制方式進(jìn)行的（圖2-18）。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序

17、為起點(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長(zhǎng)前進(jìn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶I：拓?fù)洚悩?gòu)酶I解開(kāi)負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開(kāi)雙鏈。參與解鏈的除一組解鏈酶外，還有Dna蛋白等。DNA解鏈酶（DNA helicase）：DNA解鏈酶能通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA。單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）：SSB蛋白的作用是保證被解鏈酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。所以，SSB蛋白只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。3、DNA的半不連續(xù)復(fù)制 與岡崎片段DNA復(fù)制時(shí)，短時(shí)間內(nèi)合成的約1000個(gè)核苷酸左右的小片段，稱之為岡崎片段(Okazaki frag

18、ment)DNA復(fù)制過(guò)程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再由連接酶連成大分子DNA?，F(xiàn)在已知一般原核生物的岡崎片段要長(zhǎng)些，真核生物中的要短些。進(jìn)一步研究還證明，這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。DNA鏈的延伸：DNA復(fù)制體(replisome)：在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶全酶分子、引發(fā)體和解鏈酶構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體。4、滯后鏈的引發(fā) DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3' 端開(kāi)始合成新的DNA鏈。滯后鏈的引發(fā)過(guò)程往往由引發(fā)

19、體（primosome）來(lái)完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)n、n'、n''、Dna B、C和I共同組成，只有當(dāng)引發(fā)前體（preprimosome）把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶（primase）進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。5、鏈的終止 當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。6、復(fù)制的幾種方式(1)環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA的復(fù)制可分為型、滾環(huán)型和D-環(huán)型幾種類型。(a) 型 復(fù)制的起始點(diǎn)涉及到DNA雙鏈的解旋

20、和松開(kāi)，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉 。前導(dǎo)鏈DNA開(kāi)始復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短RNA鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。(b) 滾環(huán)型（rolling circle） 這是單向復(fù)制的特殊方式。如X174的雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF）就是以這種方式復(fù)制的。DNA的合成由對(duì)正鏈原點(diǎn)的專一性切割開(kāi)始，所形成的自由5 端被從雙鏈環(huán)中置換出來(lái)并為單鏈DNA結(jié)合蛋白所覆蓋，使其3OH端在DNA聚合酶的作用下不斷延伸。在這個(gè)過(guò)程中，單鏈尾巴的延伸與雙鏈DNA的繞軸旋轉(zhuǎn)同步 。（c） D-環(huán)型（D-loop） 這也是一種單向復(fù)制的特殊方式。這種方式首先在動(dòng)物線粒體DNA的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開(kāi)

21、進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。（2）線性DNA雙鏈的復(fù)制 線性DNA復(fù)制中RNA引物被切除后，留下5'端部分單鏈DNA，不能為DNA聚合酶所作用，使子鏈短于母鏈。T4和T7噬菌體DNA通過(guò)其末端的簡(jiǎn)并性使不同鏈的3'端因互補(bǔ)而結(jié)合，其缺口被聚合酶作用填滿，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體。這個(gè)過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行直到生成原長(zhǎng)20多倍的多聯(lián)體，并由噬菌體DNA編碼的核酸酶特異切割形成單位長(zhǎng)度的DNA分子。二、原核和真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)1、原核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較原

22、核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶：有35外切酶活性和53外切酶活性。保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。DNA聚合酶 ：活性低，其35核酸外切酶活性可起校正作用。主要起修復(fù)DNA的作用。DNA聚合酶：7種亞單位9個(gè)亞基。只具35外切酶活性，主導(dǎo)聚合酶。Klenow fragment：用枯草桿菌蛋白酶處理大腸桿菌DNA聚合酶，獲得兩個(gè)片段，大片段分子量76000U，稱為Klenow 片段。它保留著聚合酶和35外切酶的活性，廣泛使用于DNA序列分析中。三、真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)真核生物DNA復(fù)制的起始需要起始原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物（ORC）參與。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp秒，還不到大腸桿菌的12

23、0。真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開(kāi)始。真核生物DNA聚合酶的特性比較2.4.3 DNA復(fù)制的調(diào)控原核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控：復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制頻率的高低。真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控： 1.細(xì)胞生活周期水平調(diào)控 2.染色體水平調(diào)控 3.復(fù)制子水平調(diào)控真核和原核生物DNA復(fù)制的比較相同： 1.半保留復(fù)制 2.都有引發(fā)、延長(zhǎng)、終止三個(gè)階段 3.都必須有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)和DNA聚合酶參與區(qū)別：1. 真：多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)；原：一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)2.真：所有復(fù)制受一種調(diào)控；原：一個(gè)復(fù)制子上有多個(gè)復(fù)制叉2.5 DNA的修復(fù)DNA修復(fù)系統(tǒng) 功能錯(cuò)配修復(fù) 恢復(fù)錯(cuò)配堿基切除修復(fù) 切

24、除突變的堿基核苷酸切除修復(fù) 修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù) 修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNA2.6 DNA的轉(zhuǎn)座2.6.1 轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征2.6.2 轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制2.6.3 轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)2.6.4 真核生物中的轉(zhuǎn)座子移動(dòng)基因(Movable gene)：又稱為轉(zhuǎn)位因子(Transposable elements)，是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位。由于它可以從染色體基因組上的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一位置，甚至在不同染色體之間躍遷，因此有時(shí)也稱為跳躍基因(Jumping gene)。原核生物的轉(zhuǎn)座因子可分為：插入序列(insertion sequence，IS)：最簡(jiǎn)單的

25、不含有任何宿主基因的轉(zhuǎn)位因子。片段長(zhǎng)度7002500bp。復(fù)合轉(zhuǎn)座子(transposon，Tn)：是一類攜帶某些與轉(zhuǎn)座無(wú)關(guān)的抗性基因(或其它宿主基因)的轉(zhuǎn)座子。分子量2000bp。轉(zhuǎn)座噬菌體(Mu，D108)：具有轉(zhuǎn)座功能的一類可引起突變的溶源性噬菌體。 插入序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.在IS兩端含有長(zhǎng)度為1040bp反向重疊序列2.含有一個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶的長(zhǎng)編碼區(qū)。3.插入時(shí)在DNA位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)短的(39bp)正向重復(fù)序列。復(fù)合轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 1.兩翼為兩個(gè)相同或相似的IS序列。 2.中部為某種抗性基因。 3.IS序列一般不能單獨(dú)移動(dòng)。Conclusiona) 轉(zhuǎn)座過(guò)程是由Donor 提供Tn c

26、opy到 target site， 涉及酶切、復(fù)制、重組的遺傳學(xué)過(guò)程。b) 轉(zhuǎn)座完成后，在Tn的兩端出現(xiàn)target site序列的正向重復(fù)，其長(zhǎng)度取決于staggered cutting的長(zhǎng)度。c) 轉(zhuǎn)座因子的 IR 序列是轉(zhuǎn)座酶的重要識(shí)別位點(diǎn)，與轉(zhuǎn)座，切除有關(guān)d) Cointegrater 是轉(zhuǎn)座過(guò)程的中間體 (具有兩個(gè) Tn 和兩個(gè) replicon), 其穩(wěn)定性依 Tn不同而異，或 resolution 完成轉(zhuǎn)座過(guò)程.e) Cointegrater 可能導(dǎo)致 Tn 和抗性的積累。 轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)1. 誘變效應(yīng) （提高重組頻率、形成易變基因）2. 切除效應(yīng) (倒位、缺失、重復(fù)、fo

27、otprinting)3. 雙轉(zhuǎn)座效應(yīng)（外顯子改組 exon shuffling ）4. 位置效應(yīng)（啟動(dòng)表達(dá)、增強(qiáng)表達(dá)）5. 轉(zhuǎn)座爆炸（激活表達(dá)、基因內(nèi)重排突變基因形成）轉(zhuǎn)位作用的機(jī)制：靶序列的復(fù)制。轉(zhuǎn)位作用的遺傳學(xué)效應(yīng)：引起插入突變；產(chǎn)生新基因；產(chǎn)生染色體畸變；引起生物進(jìn)化。轉(zhuǎn)座因子的應(yīng)用：利用轉(zhuǎn)座子分離、克隆基因；利用Tn進(jìn)行基因定位；作為基因轉(zhuǎn)移載體。真核生物中的轉(zhuǎn)座子1、玉米中的控制因子自主性因子：具有自主剪接和轉(zhuǎn)座的功能；非自主性因子：?jiǎn)为?dú)存在時(shí)是穩(wěn)定的，不能轉(zhuǎn)座，當(dāng)基因組中存在與非自主性因子同家族的自主性因子時(shí)，它才具備轉(zhuǎn)座功能，成為與自主性因子相同的轉(zhuǎn)座子。AcDs體系、Spm,

28、 En轉(zhuǎn)座子。2、果蠅中的轉(zhuǎn)座子 Copia類、P轉(zhuǎn)座子等。本章重點(diǎn) 染色體及DNA結(jié)構(gòu) DNA復(fù)制習(xí)題1.DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制,若一完全被標(biāo)記的DNA分子,置于無(wú)放射標(biāo)記的溶液中復(fù)制兩代,所產(chǎn)生的4個(gè)DNA分子中放射性狀況如何A.兩個(gè)分子有放射性,兩個(gè)分子無(wú)放射性 B.均有放射性C.兩條鏈中的半條具有放射性 D.兩條鏈中的一條具有放射性 E.均無(wú)放射性2.DNA復(fù)制時(shí)哪種酶不需要A.DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 B.DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶 C.連接酶 D.RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶 E.拓?fù)洚悩?gòu)酶3.原核生物的DNA聚合酶A.DNA聚合酶有7種、9個(gè)亞單位 B.DNA聚合酶有最強(qiáng)的外切核酸

29、酶的活性 C.DNA聚合酶是真正的起復(fù)制作用的酶D.催化過(guò)程產(chǎn)生的焦磷酸是主要底物 E.用4種脫氧核苷作底物 生物信息的傳遞(上)從DNA到RNA基因表達(dá)：是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個(gè)過(guò)程。轉(zhuǎn)錄(transcription)：以DNA為模板，按照堿基互補(bǔ)原則合成一條單鏈RNA，從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA中去的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。編碼鏈(coding strand)=有意義鏈模板鏈(template strand)=反義鏈不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetric transcription)：轉(zhuǎn)錄僅發(fā)生在DNA的一條鏈上。啟動(dòng)子(promoter)：是DNA轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)的一段序

30、列，它能指導(dǎo)全酶與模板正確的結(jié)合，并活化酶使之具有起始特異性轉(zhuǎn)錄形式。終止子(terminator)：轉(zhuǎn)錄終止的信號(hào)，其作用是在DNA模板特異位置處終止RNA的合成。轉(zhuǎn)錄單位：DNA鏈上從啟動(dòng)子直到終止子為止的長(zhǎng)度稱為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。3.1 RNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程都包括：模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過(guò)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。1、模板識(shí)別階段主要指RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動(dòng)子附近的DNA雙鏈分開(kāi)形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對(duì)。2、轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。3、轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)啟動(dòng)子階段，通

31、過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率越高。4、RNA聚合酶離開(kāi)啟動(dòng)子，沿DNA鏈移動(dòng)并使新生RNA鏈不斷伸長(zhǎng)的過(guò)程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。5、當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。3.1.1 轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程RNA合成的基本特點(diǎn)：1.底物是：ATP、GTP、CTP、UTP2.在聚合酶作用下形成磷酸酯鍵3.RNA的堿基順序由DNA的順序決定4.僅以一條DNA鏈作為模板5.合成方向?yàn)?36.合成中不需要引物3.1.2 轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分亞基基因 相對(duì)分子量亞基數(shù)組分功能rpoA3.65×10 42核心酶 核心酶組裝，啟動(dòng)

32、子識(shí)別rpoB 1.51×10 51核心酶 和共同形成RNA合成的活性中心rpoC 1.55×1051 核心酶 ？11×1041核心酶未知rpoD7.0×10 41因子 存在多種因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子原核生物RNA聚合酶： 1、RNA聚合酶:大多數(shù)原核生物RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌RNA聚合酶由2個(gè)亞基、一個(gè)亞基、一個(gè)亞基和一個(gè)亞基組成，稱為核74心酶。加上一個(gè)亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對(duì)分子質(zhì)量為4.65×105。研究發(fā)現(xiàn)，由和亞基組成了聚合酶的催化中心，它們?cè)谛蛄猩吓c真核生物RNA聚合酶的兩個(gè)大亞基有同

33、源性。亞基能與模板DNA、新生RNA鏈及核苷酸底物相結(jié)合。因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，加入因子以后，RNA聚合酶全酶識(shí)別啟動(dòng)子序列的特異性總共提高了107倍。因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，轉(zhuǎn)錄的起始從化學(xué)過(guò)程來(lái)看是單個(gè)核苷酸與開(kāi)鏈啟動(dòng)子-酶復(fù)合物相結(jié)合構(gòu)成新生RNA的5端，再以磷酸二酯鍵的形式與第二個(gè)核苷酸相結(jié)合，起始的終止反映在因子的釋放。過(guò)去認(rèn)為二核苷酸的形成就是轉(zhuǎn)錄起始的終止，實(shí)際上，只有當(dāng)新生RNA鏈達(dá)到6-9個(gè)核苷酸時(shí)才能形成穩(wěn)定的酶-DNA-RNA三元復(fù)合物，才釋放因子，轉(zhuǎn)錄進(jìn)入延伸期。真核生物RNA聚合酶 真核生物中共有3類RNA聚合酶

34、。真核生物RNA聚合酶一般有8-14個(gè)亞基所組成，相對(duì)分子質(zhì)量超過(guò)5×105。除了細(xì)胞核中的RNA聚合酶之外，真核生物線粒體和葉綠體中還存在著不同的RNA聚合酶。線粒體RNA聚合酶只有一條多肽鏈，相對(duì)分子質(zhì)量小于7×104，是已知最小的RNA聚合酶之一，與T7噬菌體RNA聚合酶有同源性。葉綠體RNA聚合酶比較大，結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌中的聚合酶相似，由多個(gè)亞基組成，部分亞基由葉綠體基因組編碼。線粒體和葉綠體RNA聚合酶活性不受-鵝膏覃堿所抑制。 常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑及其作用：抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細(xì)菌的全酶與亞基結(jié)合，阻止起始鏈霉溶菌素細(xì)菌的核心酶 與亞基結(jié)合，阻止延長(zhǎng)放線菌素D真核

35、RNA聚合酶與DNA結(jié)合，并阻止延長(zhǎng)-鵝膏蕈堿真核RNA聚合酶與RNA聚合酶結(jié)合，起始復(fù)合物的形成轉(zhuǎn)錄可被分為4個(gè)階段，即啟動(dòng)子的選擇、轉(zhuǎn)錄起始、RNA鏈的延伸和終止。原核生物中：?jiǎn)?dòng)子選擇階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closed complex）。真核生物RNA聚合酶所形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物：除了RNA聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中至少還需要7種輔助因子參與。一般情況下，該復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑，一是合成并釋放2-9個(gè)核苷酸的短RNA轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；二是盡快釋放亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過(guò)上游啟動(dòng)子區(qū)并生成由核心酶、DN

36、A和新生RNA所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。RNA聚合酶的核心酶雖可合成RNA，但不能找到模板DNA上的起始位點(diǎn)。只有帶因子的全酶才能專一地與DNA的啟動(dòng)子結(jié)合，選擇其中一條鏈作為模板，合成均一的產(chǎn)物。因子的作用只在起始，一旦轉(zhuǎn)錄開(kāi)始，它就脫離了起始復(fù)合物，而由核心酶負(fù)責(zé)RNA鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動(dòng)子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。真核生物RNA Pol II的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物真核生物轉(zhuǎn)錄起始除RNA聚合酶外，至少還需要7種輔助因子參與，如TBP，TFIIA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH。3.2 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始2、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始 啟動(dòng)子是

37、一段位于結(jié)構(gòu)基因5端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與范本DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。 轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問(wèn)題是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。3.2.1 啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄單元(transcription unit)：是一段從啟動(dòng)子開(kāi)始至終止子結(jié)束的DNA序列，RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開(kāi)始沿著模板前進(jìn)，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是指與新生RNA鏈第一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基，研究證實(shí)通常為一個(gè)嘌呤。常把起點(diǎn)前面，即5末端的序列稱為上游(upstream)，而把其后面即3末端的序列稱為下游(downstream)

38、。在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)有一個(gè)由5個(gè)核苷酸組成的共同序列，是RNA聚合酶的緊密結(jié)合點(diǎn)，現(xiàn)稱為Pribnow區(qū)(Pribnow box)，該區(qū)的中央約位于起點(diǎn)上游10bp處，故又稱-10區(qū)。絕大部分啟動(dòng)子都存在位于-10bp處的TATA區(qū)和-35bp處的TTGACA區(qū)。這兩段共同序列是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。Pribnow區(qū)（Pribnow box）這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱為10區(qū)。TTGACA。這個(gè)區(qū)的中央大約位于起點(diǎn)上游35bp處，所以又稱為35區(qū)。10位的TATA區(qū)和35位的TTGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與因子相

39、互識(shí)別而具有很高的親和力。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hogness box），這是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2530 bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)（圖3-7）。另外，在起始位點(diǎn)上游7078 bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中35 bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)（CAAT box）。在7080區(qū)含有CCAAT序列（CAAT box），在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。3.2.2 啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別氫鍵互補(bǔ)學(xué)說(shuō)：RNA聚合酶并不直接識(shí)別堿基對(duì)本身，而是通過(guò)氫鍵互補(bǔ)

40、的方式加以識(shí)別。這種氫鍵互補(bǔ)學(xué)說(shuō)較為圓滿地解釋了啟動(dòng)子功能既受DNA序列影響，又受其構(gòu)象影響這一事實(shí)。3.2.3 酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合在RNA聚合酶與啟動(dòng)子相互作用的過(guò)程中，聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過(guò)解鏈得到二元開(kāi)鏈復(fù)合物。DNA開(kāi)鏈?zhǔn)前凑誅NA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。3.2.4 -10區(qū)和-35區(qū)的最佳間距在原核生物中，-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離大約是1619bp，小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子的活性。在細(xì)菌中常見(jiàn)兩種啟動(dòng)子突變，一種叫下降突變(down mutat

41、ion)，如果把Pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT就會(huì)大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平；另一類突變叫上升突變(up mutation)，即增加Pribnow區(qū)共同序列的同一性。3.2.5 增強(qiáng)子及其功能能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子(enhancer)。增強(qiáng)子很可能通過(guò)影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，從而使得RNA聚合酶更容易與范本DNA相結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的區(qū)別：1.增強(qiáng)子對(duì)于啟動(dòng)子的位置不固定，而能有很大的變動(dòng)；2.它能在兩個(gè)方向產(chǎn)生作用。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一啟動(dòng)子。3.2.6

42、真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響習(xí)慣上，將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件(upstream promoter element，UPE)或稱上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)。在真核生物基因中，Hogness等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似Pribnow區(qū)的Hogness區(qū)（Hogness box），這是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2530 bp處的共同序列TATAAA，也稱為TATA區(qū)。另外，在起始位點(diǎn)上游7078 bp處還有另一段共同序列CCAAT，這是與原核生物中35 bp區(qū)相對(duì)應(yīng)的序列，稱為CAAT區(qū)（CAAT box）。在7080區(qū)含有CCAAT序

43、列（CAAT box），在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始；CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動(dòng)子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄的終止 RNA聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄后，它就會(huì)沿著范本53方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到碰上終止信號(hào)時(shí)才與模板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。終止發(fā)生時(shí)，所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都必須被破壞，范本DNA鏈才能與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。3.4 終止和抗終止不依賴于因子的終止 終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)

44、富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段由4-8個(gè)A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長(zhǎng)短有關(guān)，隨著發(fā)卡式結(jié)構(gòu)（至少6bp）和寡聚U序列（至少4個(gè)U）長(zhǎng)度的增加，終止效率逐步提高。依賴于因子的終止 因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2.0×105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷酸三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶，它通過(guò)催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。3.4.3 抗終止抗轉(zhuǎn)錄終止主要有兩種方式：1.破壞終止位點(diǎn)RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)2.依賴

45、于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄抗終止3.3 原核生物與真核生物mRNA的特征比較原核生物mRNA的特征 mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右（tRNA占16%，而rRNA則占80%以上）。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過(guò)程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開(kāi)始轉(zhuǎn)錄時(shí)就被引發(fā)了。一個(gè)原核細(xì)胞的mRNA（包括病毒）有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽。3.3.1 原核生物mRNA的特征1.原核生物mRNA的半衰期短2.許多原核生物mRNA以多順?lè)醋拥男问酱嬖?.原核生物mRNA的5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3端沒(méi)有或只有較短的poly(A)結(jié)構(gòu)4.原核生物起始密碼子AUG上游7-

46、12個(gè)核苷酸處有一被稱為SD序列（Shine Dalgarno sequence）的保守區(qū)，因?yàn)樵撔蛄信c16S-rRNA 3端反向互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過(guò)程中起作用。只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順?lè)醋觤RNA（monocistronic mRNA），把編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順?lè)醋觤RNA（polycistronic mRNA）。多順?lè)醋觤RNA是一組相鄰或相互重迭基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這樣的一組基因可被稱為一個(gè)操縱子（operon），是生物體內(nèi)的重要遺傳單位。如大腸桿菌乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄成編碼3條多肽的多順?lè)醋觤RNA，經(jīng)過(guò)翻譯生成半乳糖苷酶、透過(guò)酶及乙?；D(zhuǎn)移酶。真核生物

47、mRNA的特征前體RNA 成熟mRNA “基因”的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列！3.3.2 真核生物mRNA的特征1. 真核生物mRNA的5端存在“帽子”結(jié)構(gòu)：pppApNpNp 。2. 絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。帽子結(jié)構(gòu)帽子被扣在了mRNA的5端，并可能在幾個(gè)位置發(fā)生甲基化。mRNA5端加“G”的反應(yīng)是由鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的 。帽子甲基化作用帽子0：出現(xiàn)在所有真核生物中。 尿苷酸一7一甲基轉(zhuǎn)移酶 在G的7N位甲基化帽子1：除單細(xì)胞生物以外所有其他真核生物中都有的最主要的帽子。2一甲基一轉(zhuǎn)移酶第2個(gè)堿基的2OH位置上（實(shí)際上在任何修飾反應(yīng)進(jìn)

48、行前，它是轉(zhuǎn)錄物中原來(lái)的第1個(gè)堿基）帽子2：甲基基團(tuán)可以添加到戴帽mRNA的第3堿基上。這個(gè)反應(yīng)的底物是已經(jīng)具有兩個(gè)甲基基團(tuán)的帽子mRNA。2一甲基一轉(zhuǎn)移酶催化2OH位置上甲基化這種帽子通常低于戴帽群體總量的1015。二、mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾-帽子 1、 帽子的種類帽子0（Cap-0） m7GpppXpYp-（共有）帽子1 （Cap-1） m7GpppXmpYp-第一個(gè)核苷酸的 2-O 位上產(chǎn)生甲基化（A N6 位甲基化）帽子2（Cap-2） m7GpppXmpYm 第二個(gè)核苷酸的 2-O 位上產(chǎn)生甲基化（A、G、C、U）其中: 單細(xì)胞真核生物只有 Cap0 Cap1 是其余真核生物的主要帽子

49、形式 Cap2 存在于某些真核生物中2、 帽子結(jié)構(gòu)的生成 甲基供體都為S腺苷甲硫氨酸（SAM） RNA鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶-戴帽酶（capping enzyme）3、 帽子結(jié)構(gòu)的功能 1） 對(duì)翻譯起識(shí)別作用-為核糖體識(shí)別RNA提供信號(hào) Cap0 的全部都是識(shí)別的重要信號(hào) Cap1,2 的甲基化能增進(jìn)識(shí)別 2）增加mRNA 穩(wěn)定性，使5端免遭外切核酸酶的攻擊3）與某些RNA病毒的正鏈合成有關(guān)（Cap1、Cap2 ） 除帽子結(jié)構(gòu)外的Euk.mRNA內(nèi)部甲基化m6A形式Poly A尾巴3、 poly(A) 的功能 1） 可能與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)2） 與mRNA的壽命有關(guān) 3） 與翻譯有關(guān) a、 缺失可抑制體外翻譯

50、的起始 b、 胚胎發(fā)育中，poly(A) 對(duì)其mRNA的翻譯有影響（非poly(A) 化的為儲(chǔ)藏形式） c、對(duì)含 poly(A) 的mRNA 失去 poly(A) 可減弱其翻譯4） poly(A) 在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價(jià)值 a.也可將 oligo (dT) 與載體相連，從總體RNA中分離純化mRNA b.用寡聚dT（oligo (dT)）為引物，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 若 干 基 本 概 念 基因表達(dá)的第一步 以D. S. DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板，在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下，按A U，CG 配對(duì)的原則，合成RNA分子 模板單鏈 DNA的極性方向?yàn)?5, 而非模板單鏈DN

51、A的極性方向與RNA鏈相同，均為53。3.5 內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾一、概述 割裂基因（split gene）：指編碼某一RNA的基因中有些序列并不出現(xiàn)在成熟的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其他的序列隔開(kāi) 內(nèi)含子（intron）：原初轉(zhuǎn)錄物中經(jīng)RNA拼接反應(yīng)而被去除的RNA序列或基因中與這些RNA序列相應(yīng)的DNA序列外顯子（excon）： RNA拼接（RNA splicing）：一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，將內(nèi)含子去除而把外顯子連接起來(lái)形成成熟RNA分子的過(guò)程。 拼接點(diǎn)： 5 拼接點(diǎn)或左拼接點(diǎn)（內(nèi)含子上游） 3 拼接點(diǎn)或右拼接點(diǎn)（下游）3.5.1 RNA中

52、的內(nèi)含子真核生物mRNA前體的加工：1. 5端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)2. 在3端切斷并加上一個(gè)poly(A)的尾巴3. 通過(guò)剪接除去轉(zhuǎn)錄來(lái)的IVS(非翻譯區(qū))4. 鏈內(nèi)部核酸的甲基化內(nèi)含子的分類 中部核心結(jié)構(gòu)（central core structure）:在有些內(nèi)含子中，含有4個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為10 20bp，4個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在拼接中起重要作用。 由于并非所有的內(nèi)含子都有中部核心結(jié)構(gòu)，所以有了內(nèi)含子的分類類（group）:含有中部核心結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器基因 核基因類（group ）:不含有中部核心結(jié)構(gòu)細(xì)胞器線粒體基因內(nèi) 核基因 類（group ）:具有 GUAG 特征的邊界序列核基

53、因mRNA前體 RNA基因的內(nèi)元均位于 tRNA 的反密碼環(huán)上3、拼接方式 方式一：由拼接裝置完成（核mRNA內(nèi)含子）可供識(shí)別的特異序列拼接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成 方式二：自我拼接（兩類內(nèi)含子 、 ）形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA具有催化拼接的能力 方式三：需要蛋白質(zhì)酶參與的拼接（酵母tRNA）前兩種拼接都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)3.5.2 RNA的剪接RNA的剪接實(shí)質(zhì)：就是要把斷裂基因的內(nèi)含子除去，連接外顯子。剪切方式：mRNA前體的剪接；自我剪接；蛋白質(zhì)剪接(tRNA)。剪接體(spliceosome)：各種參與剪接的成分形成的一個(gè)體系。Ribozyme：有酶活性的RNA。拼接機(jī)制（Splicing

54、mehanism ) SnRNA (or ScRNA) 與拼接點(diǎn)序列間存在互補(bǔ)區(qū)域并參與剪接, 形成拼接體( spliceosome)。Spliceosome 逐級(jí)組裝，SnRNA（U1、U2、U5和U4U6）分步替代。U1通過(guò)5拼接點(diǎn)互補(bǔ)而結(jié)合，U2識(shí)別并結(jié)合分支點(diǎn)A, U1和U2作用使內(nèi)元的 5端和 3端帶到 一起（U1與 3拼接點(diǎn)配對(duì)），U1、U2、mRNA與U4U5U6復(fù)合物形成一個(gè)完整的拼接體。3.5.3 RNA的編輯和化學(xué)修飾RNA的編輯：是在mRNA水平上改變遺傳信息的過(guò)程。種類：?jiǎn)螇A基突變；尿苷酸的缺失和添加化學(xué)修飾：甲基化；硫代；二價(jià)鍵的飽和化；去氨基化；堿基的同分異構(gòu)化；核苷酸的替代。習(xí)題1.真核生物的TATA盒是:A.轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn) B.翻譯的起始點(diǎn) C.RNA聚合酶與DNA模板穩(wěn)