醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)5

1、2糜蛋白酶催化作用的綜合機(jī)制另一個(gè)典型的酶催化機(jī)制的綜合效應(yīng)的例子是糜蛋白酶（chymotrypsin）。它的作用特點(diǎn)包括： (1) 糜蛋白酶在剛分泌出來(lái)時(shí)，呈酶原狀態(tài)（含245個(gè)氨基酸的一條肽鏈），受長(zhǎng)中胰蛋白酶的致活作用，在肽鏈Leu13-Ser14間及Arg15-Ile16間切下二肽（Arg15- Ser14）同時(shí)在Tyr146-Thy147及Asn148-Ala149間又切下一二肽（Thr147-Asn148）,使肽鏈折斷成三條鏈，但仍由二硫鍵維系成一體，并折疊盤曲成有活性的酶。糜蛋白酶的內(nèi)部構(gòu)成一容納作用物的疏水口袋，深度為10-12 Å，截面為3.5-4和5.5-6.5

2、Å，正好容納作用物的芳香族環(huán)（6×3.5 Å）或亮氨酸等疏水性氨基酸的側(cè)鏈（4 Å）。在口袋的底部有 Ser189可與疏水性氨基酸相互作用。另有一氧口袋可容納受攻擊的肽鏈的羰基，并為Ser195及Gly193的正性NH-所吸引，使羰基C呈正電性。這樣使Ser195中的負(fù)電性氧可對(duì)所作用的肽鍵的羰基C，進(jìn)行親核攻擊。(2) 酶分子還與作用物分子有廣泛的結(jié)合，使釋出大量的H，以推動(dòng)反應(yīng)進(jìn)行。如與酶分子的Ser214等形成氫鍵，還可形成鹽鍵等。以作用物中受攻擊的疏水性氨基酸側(cè)連而言，其疏水性程度越大，則其Kcat/Km越大，表明越易與疏水口袋相結(jié)合，越易起反應(yīng)

3、。(3) 由于酶分子肽鏈的折疊盤繞，將Ser195，His57及Asp102三個(gè)參與催化的基團(tuán)相互靠近構(gòu)成一電子傳遞的電荷中繼系統(tǒng)（charge-relay system），見圖14-6。圖14-6 糜蛋白酶中電子傳遞中繼系統(tǒng)的形成 使Ser195的H+被His57，進(jìn)而被Asp102所吸引，使Ser195的O趨于活潑的負(fù)電性，有利于它對(duì)肽鍵羰基C的親核攻擊。（4）Ser195的O向肽鍵的羰基C作親核攻擊時(shí)，先形成一不穩(wěn)定的四面體過(guò)渡態(tài)。隨之，受攻擊的肽鍵的NH-接受His57的H，而使N側(cè)肽鏈脫落下來(lái)。溶劑中的水分子H+及OH-乃分別與His57及羰基C結(jié)合，而使另一部分肽鏈脫落下來(lái)。完成了

4、水解過(guò)程。 綜上所述，在糜蛋白酶的催化機(jī)制中，也包含了前述四種機(jī)制的綜合效應(yīng)，另外可能還有一些至今尚未發(fā)現(xiàn)的機(jī)制在起作用，使酶具有高效催化的特殊功能。第二節(jié) 金屬在酶催化中的作用一、 金屬酶和金屬激活酶許多中金屬離子可作為輔酶參與全酶的構(gòu)成，如鋅、鐵、銅、錳、鎂和硒等，這一類酶稱為金屬酶（metalloenzyme）。這些酶分子中含有緊密結(jié)合的金屬，成為酶結(jié)構(gòu)中一個(gè)不可缺少的組成成分，一般在酶純化過(guò)程中不會(huì)使金屬丟失。還有一些酶是不含金屬的單純蛋白質(zhì)，但需要金屬才能發(fā)揮最大活性，故金屬實(shí)際上是酶的激活劑，這類酶就稱為金屬激活酶。表2-1列舉出一些金屬酶和金屬激活酶的例子。有些酶是既含有機(jī)輔基，

5、又含金屬的酶。金屬大多并不是有機(jī)輔基的一個(gè)組成部分，但兩者可成絡(luò)合物狀態(tài)，如FAD中的異咯嗪是一個(gè)很好的金屬絡(luò)合劑。也有些酶的有機(jī)輔基本身就含有金屬，如細(xì)胞色素類的血紅素（heme）中含有Fe;需要鈷胺輔酶（維生素B12的衍生物）的酶其輔酶鈷胺素中含有Co，因?yàn)镕e和Co分別是血紅素和維生素B12中的一個(gè)固有成分。它們也和仆啉環(huán)或仆啉環(huán)形成絡(luò)合物。含有鈷胺輔酶的酶有甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶、甘油脫水酶、甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶等，后一酶的輔基是甲基鈷胺素。表14-4 一些金屬酶類和金屬激活酶類金屬酶所含金屬金屬激活酶所需金屬羧肽酶A碳酸酐酶醇脫氫酶堿性磷酸酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶亮氨酸氨

6、肽酶鐵氧還蛋白（鐵硫中心）脯氨酸羥化酶順烏頭酸酶賴氨酰（單胺）氧化酶酪氨酸酶脲酶錳超氧化物歧化酶銅鋅超氧化物歧化酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶淀粉酶ZnZnZnZnZnZnFeFeFeCuCuNiMnCu.ZnSeCa半乳糖苷酶檸檬酸合成酶丙酮酸激酶蛋白激酶一般激酶磷酸激酶精氨酸酶丙酮酸脫羧酶烯醇化酶丙酮酸羧化酶N-已酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 、磷脂酶A2磷脂酶CNaKK,MgMg,MnMg,MnMgMnMnMnMn,ZnMnCaCa在所有金屬酶中，含Zn金屬酶最多，至今從不同種屬生物中發(fā)現(xiàn)的含Zn金屬酶在二百種以上。含F(xiàn)e的金屬酶也較多，由Fe組成的需Fe細(xì)胞色素和酶類，參與體內(nèi)復(fù)雜的氧化還原過(guò)程。例如，在

7、肌肉細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞色素負(fù)擔(dān)電子的傳遞，最后由細(xì)胞色素氧化酶（細(xì)胞色素a3）的催化作用，使三羧酸循環(huán)脫下的氫與由血紅蛋白從肺運(yùn)來(lái)的氧結(jié)合成水，以保證代謝過(guò)程。并在此過(guò)程中釋放能量，形成高能磷酸鍵（ATP）供肌肉收縮和機(jī)體其他代謝過(guò)程的需要。在氧化過(guò)程中，可能產(chǎn)生過(guò)氧化氫等有害產(chǎn)物，后者可被過(guò)氧化氫酶等鐵卟啉復(fù)合物破壞而解毒。三羧酸循環(huán)中一半以上的酶含有Fe或需要Fe的存在才能發(fā)揮作用。部分含F(xiàn)e金屬酶在體內(nèi)存在形式及功能見表14-5。含Cu金屬酶不是很多，部分含Cu金屬酶及其作用見表14-6。有的金屬酶則較少，如含Se酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是目前發(fā)現(xiàn)唯一的含Se酶。表14-5人和動(dòng)物體內(nèi)的含F(xiàn)e酶

8、及Fe在酶活性中的作用含F(xiàn)e酶分子量酶分子所含F(xiàn)e原子數(shù)分布功能血紅素類過(guò)氧化氫酶乳過(guò)氧化物酶色氨酸吡咯酶240 00093 0004個(gè)血紅素1個(gè)血紅素需要血紅素尿氨酸紅細(xì)胞乳汁肝細(xì)胞分解過(guò)氧化物分解過(guò)氧化物L(fēng)-色氨酸轉(zhuǎn)變成狗非血紅素類山梨醇酶Adrenadoxin苯丙氨酸羥化酶琥珀酸脫氫酶-鐵硫蛋白-黃素蛋白NADH脫氫酶黃嘌呤氧化酶66 00012 500100 00027 00070 000275 0002Fe3S2Fe2S2Fe成酪氨酸2Fe2S4Fe4S1FAD23-28Fe+S+FMN8Fe8S2FAD2Mo尿酸豬心腎上腺鼠肝線粒體線粒體線粒體乳汁，組織檸檬酸循環(huán)固醇羥化苯丙氨酸轉(zhuǎn)

9、變轉(zhuǎn)運(yùn)電子轉(zhuǎn)運(yùn)電子轉(zhuǎn)運(yùn)電子黃嘌呤轉(zhuǎn)變成表14-6 哺乳動(dòng)物組織內(nèi)的含Cu金屬酶及其作用含Cu酶分子量含Cu量作用及作用產(chǎn)物丁酰輔酶A脫氫酶酪氨酸氧化酶尿酸酶120 000110 000220 0000.350.250.06在脂肪的氧化中參與脫氫酪氨酸二羥苯丙氨酸尿酸含Zn金屬酶研究的較多，由Zn缺乏所造成的臨床疾病也最多。Zn在元素周期表上位于IIB族第四周期，有一個(gè)d電子亞層和兩個(gè)外層電子。在化學(xué)上，Zn可以失去2個(gè)電子呈正2價(jià)氧化態(tài)，但在生物反應(yīng)中，Zn即不被氧化也不被還原。Zn常為四面體，也可為八面體或五面體。金屬酶中的Zn與鹵化Zn，氰化Zn和氨基酸Zn復(fù)合物的特點(diǎn)不同，配體的大小，靜

10、電力和共價(jià)結(jié)合力的大小決定了它們的立體化學(xué)特點(diǎn)，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與配體的多相性構(gòu)成了非典型性的協(xié)同性質(zhì)。酶的Zn結(jié)合位點(diǎn)與Zn結(jié)合表現(xiàn)出特殊的鍵長(zhǎng)和扭變幾何學(xué)，這使酶的能量在熱力學(xué)上大于游離狀態(tài)的酶，因此Zn在酶的催化功能上起著特殊的作用。Zn的電子結(jié)構(gòu)決定了它可以與特殊功能蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，但這種復(fù)合物既不象一些含F(xiàn)e蛋白質(zhì)呈紅色，也不象一些含Cu蛋白質(zhì)呈蘭色，直觀不易看出，所以被認(rèn)識(shí)較晚。碳酸酐酶是在1940年第一個(gè)被分離純化的含Zn酶，直到1954年才發(fā)現(xiàn)第二個(gè)含Zn酶，牛胰羧肽酶。但隨之以后，大量的含Zn酶和含Zn蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，而且發(fā)現(xiàn)含Zn酶廣泛地參與了機(jī)體的代謝過(guò)程?，F(xiàn)在對(duì)Z

11、n在含Zn酶中起的作用，以及含Zn酶的催化機(jī)制也了解的越來(lái)越多了。現(xiàn)在所知道的含Zn酶是來(lái)源于多種植物，細(xì)菌、病毒和動(dòng)物。從1940年第一個(gè)含Zn酶被發(fā)現(xiàn)到1960年這20年期間，已知的含Zn酶數(shù)量?jī)H僅為6個(gè)。在以后的15年內(nèi)，分離出的含Zn酶增至24個(gè)。在1982年，根據(jù)不同來(lái)源所確定的含Zn酶已經(jīng)有了100多個(gè)，目前已知含Zn酶的數(shù)量己經(jīng)上升為200多個(gè)。按照國(guó)際生化聯(lián)合會(huì) (International Union of Biochemistry，IUB)對(duì)酶的分類方法，可將酶分為六類，包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和連接酶。其中每一類酶中，至少都有一個(gè)含Zn酶(表14-7

12、)?？梢灶A(yù)料，在今后若干年內(nèi)，還會(huì)有更多的含Zn酶被發(fā)現(xiàn)。表14-7 含Zn金屬酶的種類、來(lái)源與Zn的作用舉例名 稱來(lái) 源作用第一類氧化還原酶醇脫氫酶乳酸脫氫酶超氧歧化酶脊椎動(dòng)物，植物藤壺，細(xì)菌脊椎動(dòng)物，植物，真菌，細(xì)菌A，D？D第二類轉(zhuǎn)移酶天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶RNA聚合酶DNA聚合酶大腸桿菌麥胚，細(xì)菌，病毒海膽，大腸桿菌，T噬菌體BAA第三類水解酶堿性磷酸酶氨肽酶羧肽酶A原 哺乳動(dòng)物，細(xì)菌哺乳動(dòng)物，真菌，細(xì)菌胰腺A，DA，CA第四類裂解酶1.6-二磷酸果糖醛縮酶碳酸酐酶乙二醛酶I酵母，細(xì)菌哺乳動(dòng)物，植物哺乳動(dòng)物，酵母AAA第五類異構(gòu)酶磷酸甘露糖異構(gòu)酶酵母？第六類連接酶tRNA合成酶丙酮酸羧

13、化酶大腸桿菌，噬熱桿菌酵母，細(xì)菌A？A：催化作用；B：結(jié)構(gòu)作用；C：調(diào)節(jié)作用；D：非催化作用；？作用尚未確定二、金屬在金屬酶中的作用金屬在酶中的作用可以參與酶的催化反應(yīng)，也可起穩(wěn)定酶蛋白結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的作用。例如在含Zn酶中，Zn的作用可以分為催化、結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和非催化作用四類（表14-7）。只要Zn對(duì)酶的催化作用是必需的或直接參與酶的催化功能，就可以說(shuō)Zn在這個(gè)酶中是起催化作用的，這類酶包括碳酸酐酶、羧肽酶、嗜熱菌蛋白酶和醛縮酶等。當(dāng)去除這些酶中的Zn時(shí)，酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)可保持不變，但酶的功能喪失，不再具有催化活性。起結(jié)構(gòu)作用的Zn維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。結(jié)構(gòu)Zn能穩(wěn)定寡聚酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)，如Zn原子可連接

14、B枯草桿菌淀粉酶形成二聚體，但不影響酶的活性。Zn也穩(wěn)定天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)。從這類酶中去除Zn可影響酶分子亞基的聚合，或酶之間的交聯(lián)。起調(diào)節(jié)作用的Zn不影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，對(duì)酶的活性也不是必需的，Zn只是對(duì)酶起激活或抑制作用。如Zn對(duì)牛晶體亮氨酸氨肽酶是激活劑，而對(duì)豬腎亮氨酸氨肽酶和1.6一果糖二磷酸酶則是抑制劑。非催化作用的Zn是指Zn在酶中的作用至今尚不清楚，如馬和人的醇脫氫酶和大腸桿菌的堿性磷酸酶。Zn是全酶的一部分，但Zn既不起催化作用，也不起維持酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用。對(duì)于同一個(gè)含Zn酶，可以同時(shí)有多種作用類型的Zn。如馬醇脫氫酶的每個(gè)亞基各含有一個(gè)催化作用的Zn原子

15、和一個(gè)非催化作用的Zn原子。當(dāng)用其他金屬取代酶本身的金屬原子時(shí)可能影響到酶的活性，如用其他金屬取代催化Zn原子和調(diào)節(jié)Zn原子時(shí)，可以顯著影響酶的活性。但如取代結(jié)構(gòu)Zn原子和非催化Zn原子時(shí)，則對(duì)酶活性影響不大。另一方面，起催化作用的Zn原子在與酶配位的幾何學(xué)上也與結(jié)構(gòu)Zn原子和非催化Zn原子不同。調(diào)節(jié)Zn原子在這方面的情況倘不清楚，用X一線分析也表明催化作用的Zn原子可以和3個(gè)蛋白質(zhì)分子上的配體和1分子水結(jié)合，而結(jié)構(gòu)Zn原子和非催化Zn原子則與4個(gè)蛋白質(zhì)分子上的配體結(jié)合，水分子與Zn的結(jié)合對(duì)于Zn的催化作用是十分必需的。催化作用Zn原子的配位幾何學(xué)具有張力，而非催化作用的Zn原子的配位幾何學(xué)是

16、規(guī)則的和非張力性的。這種張力是含Zn金屬酶催化的關(guān)鍵，因?yàn)樗梢越档娃D(zhuǎn)化能障和加速作用物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。三、金屬酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系金屬在酶中的作用只有少數(shù)是穩(wěn)定酶蛋白構(gòu)象，大多數(shù)金屬都參與酶的催化作用，而且還作為酶活性中心的一個(gè)必需部分，參與作用物的結(jié)合或催化作用物的改變。金屬可與酶及作用物相結(jié)合，形成酶-金屬-作用物三元絡(luò)合物，在絡(luò)合物中，作用物可以介于酶和金屬之間，形成作用物橋。如大多數(shù)以ATP為作用物又受Mg2+激活的激酶，可形成E-ATP-Mg2+三元絡(luò)合物。金屬也可介于酶和作用物之間，此時(shí)金屬除有穩(wěn)定酶構(gòu)象的作用外，尚有激活作用物的作用。如丙酮酸激酶和一些以磷酸烯醇式丙酮酸為作用物的酶

17、。以含Zn金屬酶為例我們可了解到金屬在酶催化中的作用。對(duì)于Zn在含Zn酶中的作用機(jī)制，已經(jīng)做了大量的研究工作，其中Zn在一些酶中的作用已基本清楚，但至今還沒(méi)有一個(gè)對(duì)任何含Zn酶都適用的作用模型。根據(jù)現(xiàn)有的研究，大致可將Zn的催化機(jī)制分為三種，第一種是Zn一羰作用(Zinc一Carbonyl)。這種機(jī)制提出，在酶的催化過(guò)程中，作用物取代與Zn結(jié)合的水分子而直接與Zn結(jié)合，Zn繼而起Lewis酸的作用，使結(jié)合的作用物分子極化，易于進(jìn)行親核攻擊。按照這種機(jī)制，Zn的作用是使親電物質(zhì)極化。這類含Zn酶的例子有醛縮酶和肽酶。第二種機(jī)制稱為Zn一羥作用(Zinc一Hydroxide)。這種機(jī)制認(rèn)為作用物并

18、不直接與Zn結(jié)合，而是通過(guò)結(jié)合在Zn原子上的水分子起作用。Zn結(jié)合水分子的pKa從14降低到7，結(jié)果與Zn結(jié)合的氫氧根離子能夠?qū)ψ饔梦镞M(jìn)行攻擊。按照這種機(jī)制，Zn的作用是活化親核物質(zhì)，碳酸酐酶是這種酶的例子。第三種機(jī)制是以上兩種的結(jié)合，根據(jù)這種機(jī)制，作用物分子可直接與Zn結(jié)合，但并不取代結(jié)合在Zn上的水分子。Zn既極化作用物分子，又使水分子活化為親核離子。Zn通過(guò)它的柔韌的配位幾何特性，把作用物分子和親核物質(zhì)連接到一起。這種機(jī)制也用來(lái)解釋碳酸酐酶的催化機(jī)制?，F(xiàn)在結(jié)晶學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，CO2和H2O是同時(shí)結(jié)合到這個(gè)酶的Zn原子上的。對(duì)這種機(jī)制還需要有足夠多的證據(jù)對(duì)此加以證實(shí)?，F(xiàn)以羧肽酶A為例，看一下

19、金屬酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)就知道羧肽酶的催化活性。1937年羧肽酶被分離純化出來(lái)，但直到1954年，羧肽酶才作為第二個(gè)含Zn金屬酶被認(rèn)識(shí)。哺乳動(dòng)物和魚胰腺分泌兩種含Zn羧肽酶，催化蛋白質(zhì)和肽類C末端芳香族氨基酸殘基水解的羧肽酶命名為羧肽酶A；催化末端鹼性氨基酸殘基水解的命名為羧肽酶B。兩種羧肽酶都先以酶原的形式被合成，經(jīng)胰蛋白酶限制性水解后被活化。非脊椎動(dòng)物和灰色鏈霉素（Streptomyces griseus）中也已經(jīng)分離出類似的酶。牛胰羧肽酶A的性質(zhì)了解的最清楚。酶的前身物是一個(gè)三聚體蛋白質(zhì)，由胰腺的腺泡細(xì)胞合成，分子量為89 000。其中一個(gè)亞基的分子量為41 000，這是羧

20、肽酶A的直接前身物，另外兩個(gè)亞基相同，經(jīng)胰蛋白酶處理后，可產(chǎn)生一個(gè)類似糜蛋白酶活性的內(nèi)肽酶，最初是用乙酰酪氨酸乙酯作為作用物來(lái)測(cè)定，所以也稱為乙酰酪氨酸乙酯酶。胰蛋白酶的蛋白水解作用和乙酰酪氨酸乙酯酶的活化作用共同產(chǎn)生出羧肽酶A.羧肽酶A分子量為34 600，由307個(gè)氨基酸殘基組成。Bradshaw等于1969年測(cè)出了羧肽酶的全部氨基酸順序，其N末端為丙氨酸，C末端是天冬氨酸。經(jīng)過(guò)X線衍射已經(jīng)測(cè)出了羧肽酶的空間結(jié)構(gòu)。羧肽酶整個(gè)分子呈橢圓形，大小約為50 x 42 x 38Å。在307個(gè)氨基酸殘基中，約147個(gè)形成隨機(jī)構(gòu)象，115個(gè)形成9個(gè)不同程度的螺旋區(qū)，45個(gè)形成一個(gè)大的折疊，扭

21、轉(zhuǎn)120，占據(jù)整個(gè)分子的中心。折疊包括4個(gè)平行和3個(gè)反平行的肽鏈對(duì)，9個(gè)螺旋區(qū)中位于折疊區(qū)的一側(cè)，通過(guò)疏水側(cè)鏈分開。Zn原子位于折疊的另一側(cè)，連接著一個(gè)“槽”和一個(gè)結(jié)合作用物的“袋”。在酶的活性中心，Arg145是酶與作用物-羧基相互作用的位點(diǎn)，Glu270是主要的催化部分，兩個(gè)酪氨酸殘基Tyr198和Tyr248也位于活性中心。Zn與Glu72、His69、His196和一分子水形成四面體?；钚灾行南铝硪恍┦杷畟?cè)鏈將折疊區(qū)與一些隨機(jī)線圈分開。在Cys138和Cys61之間有一個(gè)二硫鍵。離Zn不遠(yuǎn)有一個(gè)“袋”，允許作用物C末端的側(cè)鏈深入。酶分子的Tyr248、Arg145、Glu270和Zn將

22、作用物分子定位于活性中心中。羧肽酶A的作用機(jī)制有兩個(gè)特點(diǎn)，一是在作用物誘導(dǎo)下，酶分子活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大的改變，作用物的“靠近”及“定向”效應(yīng)十分顯著；二是酶分子的Glu270使作用物的敏感肽鍵發(fā)生電子張力，結(jié)果敏感肽鍵變得極易斷裂。以Gly-Tyr作為作用物與酶相互作用，已經(jīng)廣泛作為羧肽酶的Zn一羰作用機(jī)制模型（圖14-7）。整個(gè)酶促反應(yīng)可以分為以下幾步。1. 羧肽酶A側(cè)鏈中Arg145上的正電荷與作用物上的負(fù)電荷發(fā)生靜電吸引，Arg145的胍基和Glu270的羧基移位2 Å。如作用物無(wú)末端羧基，則不能形成鹽鍵，Tyr248也不能移位，酶也就無(wú)活性。2. 作用物分子中的酪氨酸殘基

23、進(jìn)入酶的非極性口袋中，并推走4分子水。3. 酶分子上的Tyr248的酚羥基從酶表面移到作用物肽鍵附近，移位12 Å并與作用物敏感肽鍵的-NH-基上的H形成氫鍵。4. 作用物敏感肽鍵上羰基中的氧將Zn上的水分子推開，自身結(jié)合到Zn上(圖14-7 a)。5. 由于Zn的作用，而使羰基碳原子的電子云密度降低，而呈正電性，同時(shí)Glu270上的負(fù)電荷也使作用物羰基的偶級(jí)矩加大(圖14-7 b)。6. 受Glu270激活的水分子釋放出OH-，OH-直接攻擊作用物敏感肽鍵上的羰基碳，同時(shí)Tyr248供出一個(gè)質(zhì)子，這樣作用物肽鍵就被水解(圖14-7 c)。7. Tyr248得到一個(gè)質(zhì)子，酶恢復(fù)原狀(

24、圖14-7 d)。圖14-7 胰羧肽酶作用的假設(shè)過(guò)程作用物羧基末端部分的結(jié)合見a。多酶作用物的所有6個(gè)殘基通過(guò)復(fù)雜的一系列的氫鍵，以及疏水性相互作用在酶分子的一個(gè)隙口中結(jié)合。酶的Zn原子和2個(gè)組氨酸、1個(gè)谷氨酸殘基進(jìn)行配位。Zn一羥作用機(jī)制可用碳酸酐酶作為例子。在酶促反應(yīng)中，整個(gè)過(guò)程是可逆的，其中質(zhì)子的轉(zhuǎn)移是限速過(guò)程。當(dāng)Zn與H2O結(jié)合時(shí)，酶處于酸性形式，pka接近7，反應(yīng)有利于HCO3-分解為H2O和CO2。當(dāng)與Zn結(jié)合的H2O離子化后，Zn與氫氧根離子結(jié)合，此時(shí)酶處于堿性形式，反應(yīng)有利于CO2水和。H2O離子化產(chǎn)生的H+先與His-64上的N原子結(jié)合，然后再轉(zhuǎn)移到溶液中的緩沖劑上（圖14-

25、8）。圖14-8 碳酸酐酶的催化機(jī)制A-:陰離子抑制劑第三節(jié)  別構(gòu)酶一、 別構(gòu)效應(yīng)與別構(gòu)酶調(diào)節(jié)作用是酶和一般催化劑不同的一個(gè)重要的性質(zhì)，在體外研究酶的作用和在體內(nèi)的情況有很大的不同。在體外，往往把一個(gè)酶分離出來(lái)，單獨(dú)地研究；在生物體內(nèi)，酶和酶之間，酶和其他蛋白質(zhì)之間，以及酶和其他生物高分子之間，還存在著相互作用，而影響酶的活性，其他的酶的反應(yīng)產(chǎn)物反過(guò)來(lái)對(duì)所研究的酶往往有正的或負(fù)的影響。生物體內(nèi)的酶活性需要非常精確地調(diào)控，以適應(yīng)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境條件的變化。別構(gòu)調(diào)節(jié)就是體內(nèi)快速調(diào)節(jié)酶活性的重要方式之一。所謂別構(gòu)調(diào)節(jié)就是指一些特定的小分子化合物（如代謝終產(chǎn)物）與酶分子上的調(diào)節(jié)亞基或部位結(jié)合時(shí)

26、，可誘導(dǎo)和影響催化亞基或部位空間結(jié)構(gòu)改變，使其催化活性增高或降低。這類可受調(diào)節(jié)的酶稱為別構(gòu)酶（allosteric enzyme）或變構(gòu)酶，這種調(diào)節(jié)作用稱為別構(gòu)調(diào)節(jié)。能與調(diào)節(jié)亞基或部位結(jié)合而進(jìn)行別構(gòu)調(diào)節(jié)的特定化合物稱為效應(yīng)物（effector）或調(diào)節(jié)物（modulator）。當(dāng)一分子配體（ligand） 即作用物或效應(yīng)物和酶結(jié)合后，促進(jìn)后繼配體與酶結(jié)合稱為正協(xié)同效應(yīng)（positive cooperative effect）或正協(xié)同性（positive cooperativity）。如果抑制后續(xù)分子與酶結(jié)合稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)（negative cooperative effect）或負(fù)協(xié)同性(neg

27、ative cooperativity)。不同的別構(gòu)酶，其效應(yīng)物性質(zhì)不同。有些別構(gòu)酶的效應(yīng)物就是作用物，由此而產(chǎn)生的別構(gòu)效應(yīng)稱為同促效應(yīng)（homotropic effect）。這種別構(gòu)酶分子有多個(gè)作用物結(jié)合部位，其調(diào)節(jié)作用取決于酶分子中多少個(gè)作用物結(jié)合部位已結(jié)合作用物，酶與作用物結(jié)合后影響的是其他作用物與酶的結(jié)合能力。有的別構(gòu)酶，其效應(yīng)物與作用物不同，由此而產(chǎn)生的別構(gòu)效應(yīng)稱異促效應(yīng)（heterotropic effect）。這種別構(gòu)酶除可與作用物作用外，還可與其他的效應(yīng)物結(jié)合。酶與效應(yīng)物的結(jié)合，影響的是另一結(jié)合部位上不同的效應(yīng)物的結(jié)合能力，這種效應(yīng)可以是正的，也可以是負(fù)的。二、 別構(gòu)酶的特征現(xiàn)

28、已知的別構(gòu)酶都是由多個(gè)亞基組成的寡聚酶，亞基數(shù)可以是兩個(gè)或兩個(gè)以上，亞基可以相同，也可以不同。別構(gòu)酶按其效應(yīng)物與作用物的異同，可以分為同促別構(gòu)酶、異促別構(gòu)酶和同促-異促別構(gòu)酶。（一） 異促別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特征1. 酶分子上存在有結(jié)合作用物并催化反應(yīng)進(jìn)行的催化中心，以及結(jié)合效應(yīng)物，從而調(diào)節(jié)催化中心的活性的調(diào)節(jié)中心。2. 催化中心和調(diào)節(jié)中心可以位于同一或不同的亞基上。含有催化中心的亞基稱為催化亞基；含有調(diào)節(jié)中心的亞基稱為調(diào)節(jié)亞基。效應(yīng)物與酶分子上調(diào)節(jié)中心結(jié)合后，如果促進(jìn)了酶對(duì)作用物的催化能力，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)激活（allosteric activation），相應(yīng)的效應(yīng)物稱為別構(gòu)激活劑。若效應(yīng)物與酶的

29、結(jié)合降低了酶的催化活性，這種效應(yīng)稱為別構(gòu)抑制（allosteric inhibition）,相應(yīng)的效應(yīng)物稱為別構(gòu)抑制劑。（二） 同促別構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特征效應(yīng)物和作用物相同的別構(gòu)酶稱為同促別構(gòu)酶，它具有以下特征：1. 酶分子上有多個(gè)催化中心，催化中心之間相互作用；酶分子上沒(méi)有專門的調(diào)節(jié)中心，催化中心同時(shí)也是調(diào)節(jié)中心。2. 效應(yīng)物就是作用物，先與酶催化中心結(jié)合的作用物分子，對(duì)后繼作用物分子與酶分子中其他催化中心的結(jié)合產(chǎn)生影響（協(xié)同效應(yīng)），能提高酶分子對(duì)后繼作用物親和力的效應(yīng)物稱為正效應(yīng)物；降低酶對(duì)后繼作用物分子親和力的稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)物。有些別構(gòu)酶可同時(shí)具有同促效應(yīng)和異促效應(yīng)，稱為同促-異促效應(yīng)。在動(dòng)力

30、學(xué)方面，別構(gòu)酶往往不遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)。圖14-9是具有正協(xié)同效應(yīng)、負(fù)協(xié)同效應(yīng)和具有Michaelis-Menten行為的酶、速度對(duì)作用物濃度關(guān)系的曲線。在Michaelis-Menten雙曲線中，當(dāng)S=0.11時(shí)，V達(dá)到Vm的10%；當(dāng)S=9時(shí)，V達(dá)到Vm的90%。達(dá)到兩種反應(yīng)速度的S之比為81。Kashland等建議用此比例來(lái)區(qū)分三類酶，當(dāng)比值為81時(shí)是Michaelis-Menten酶；小于81時(shí)是正協(xié)同效應(yīng)的酶；大于81時(shí)是負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶。 圖14-9 正、負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶與非調(diào)節(jié)酶的動(dòng)力學(xué)曲線比較1.米氏酶；2.正協(xié)同別構(gòu)酶；3.負(fù)協(xié)同別構(gòu)酶三、 別構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)的

31、機(jī)制酶的調(diào)節(jié)包括酶結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和酶量的調(diào)節(jié)，別構(gòu)調(diào)節(jié)屬酶結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，是體內(nèi)一種快速調(diào)節(jié)方式，分秒之間即發(fā)生作用。別構(gòu)酶多是一個(gè)代謝反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，往往催化的是限速步驟。對(duì)于別構(gòu)酶如何能有效地對(duì)代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，已經(jīng)提出了多種模式，現(xiàn)在普遍被接受的模式是MWC和KNF模式。（一）MWC模式1965年Monod、Wyman和Changeux等三人提出的模式簡(jiǎn)稱MWC模式，又稱同構(gòu)模型（concerted model）。他們的模型有以下幾條規(guī)則，這些規(guī)則目前已被普遍接受（圖14-10）：1. 寡聚體 (oligomer)是一個(gè)聚合的蛋白質(zhì)，由一定數(shù)量但數(shù)目不是很大的相同亞基組成，這些亞基在酶分子中排列對(duì)稱。

32、2. 每一亞基對(duì)特定的配體都有一個(gè)結(jié)合部位，這些結(jié)合部位都是相等的。3. 亞基有兩種不同的構(gòu)像狀態(tài)，分別為R態(tài)（relaxed state）和T態(tài)（tensed state）。R態(tài)對(duì)作用物和別構(gòu)激活劑有較大的親和力，有較高活性；T態(tài)對(duì)別構(gòu)抑制劑有較大的親和力，具有很低的活性或不具有活性。4. 酶分子中所有的亞基都處于相同的構(gòu)像狀態(tài)，T態(tài)或R態(tài)。當(dāng)一個(gè)亞基從T態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)時(shí)，其它亞基也都同時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)镽態(tài)，即所有亞基的構(gòu)像轉(zhuǎn)變是同步的，因此該模式也稱齊變模式。5. 當(dāng)酶分子由一種構(gòu)像狀態(tài)轉(zhuǎn)變成另一種構(gòu)像狀態(tài)時(shí)，其分子對(duì)稱性保持不變。故此模式又稱對(duì)稱模式。6. T態(tài)或R態(tài)處于動(dòng)態(tài)平衡之中，別構(gòu)激活劑或

33、作用物的濃度與別構(gòu)抑制劑的比值決定別構(gòu)酶處于哪一種構(gòu)像狀態(tài)。當(dāng)有別構(gòu)抑制劑而無(wú)作用物或別構(gòu)激活劑時(shí)，平衡趨向于T態(tài)；當(dāng)有少量作用物或別構(gòu)激活劑時(shí)，平衡趨向于R態(tài)。酶分子構(gòu)像轉(zhuǎn)變成R態(tài)后，酶分子對(duì)作用物的親和力便提高了，從而給出S形動(dòng)力學(xué)曲線。此模式可以解釋別構(gòu)激活、別構(gòu)抑制和正協(xié)同效應(yīng)，但不能解釋負(fù)協(xié)同效應(yīng)。圖14-10 別構(gòu)酶作用的MWC模式A.別構(gòu)酶的兩種狀態(tài)，T態(tài)對(duì)作用物的親和力低；R態(tài)對(duì)作用物的親和力高B.MWC模型示意圖（三） KNF模式別構(gòu)作用還可用另一種模型來(lái)解釋，這就是Koshland、Nemethy和Filmer等三人在1966年提出的模式，又稱KNF模式（圖14-11）。該

34、模式有以下幾個(gè)要點(diǎn)：1. 別構(gòu)酶是由相同亞基構(gòu)成的寡聚體。2. 每一亞基都可以有兩種不同的構(gòu)象狀態(tài)，即T態(tài)和R態(tài)。R態(tài)對(duì)作用物和效應(yīng)物有較大的親和力；T態(tài)不利于與作用物或效應(yīng)物的結(jié)合。3. T態(tài)和R態(tài)可以共存于一個(gè)寡聚體中。4. 當(dāng)作用物或效應(yīng)劑與酶分子中一個(gè)亞基結(jié)合時(shí)，可引起此亞基的構(gòu)象變化。這種變化可以作用于相鄰的亞基，使其發(fā)生同樣的構(gòu)象變化，從而影響對(duì)第二個(gè)作用物分子的親和力。當(dāng)?shù)诙€(gè)亞基與作用物分子結(jié)合后，又引起相鄰的第三個(gè)亞基發(fā)生同樣的構(gòu)象變化，從而影響其對(duì)第三個(gè)作用物分子的親和力。如此順序遞變，直至酶分子中所有亞基都發(fā)生同樣的構(gòu)象變化。故此模式又叫序變模式。5. 一個(gè)亞基與作用物或

35、效應(yīng)物結(jié)合后，可以使相鄰亞基對(duì)后繼作用物分子的親和力提高或降低。圖14-11 別構(gòu)酶作用 的KNF模型示意圖R態(tài)對(duì)作用物親和力高，T態(tài)對(duì)作用物親和力低KNF模式與MWC模式的區(qū)別在于：（1）無(wú)作用物或效應(yīng)物時(shí)，酶分子中亞基只存在一種構(gòu)象狀態(tài)（T態(tài)）；（2）酶分子的全部亞基由T態(tài)轉(zhuǎn)變R態(tài)不是同時(shí)進(jìn)行的，而是逐個(gè)地轉(zhuǎn)變的。因此，可以存在T態(tài)亞基和R態(tài)亞基雜交形成的RT形式，MWC模型中則不存在RT形式；（3）作用物之間可以是正協(xié)同效應(yīng)，也可以是負(fù)協(xié)同效應(yīng)，取決于已結(jié)合作用物的亞基對(duì)相鄰亞基的影響。這種影響若是增大其他亞基對(duì)作用物的解離常數(shù)，則產(chǎn)生負(fù)協(xié)同效應(yīng)；減少其他亞基對(duì)作用物的解離常數(shù)時(shí)，產(chǎn)生正

36、協(xié)同效應(yīng)。與MWC模式相比，KNF模式前進(jìn)了一步，因其可以同時(shí)解釋別構(gòu)抑制、別構(gòu)激活、正協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。一般認(rèn)為，KNF模式在描述異促效應(yīng)時(shí)比MWC模式更好一些。 四、 別構(gòu)酶對(duì)代謝的調(diào)節(jié)作用天門冬氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶是具有正協(xié)同作用的一個(gè)代表，它是大腸桿菌中合成嘧啶的前幾步中的一個(gè)酶，催化以下反應(yīng)：L-天門冬氨酸 + 氨甲酰磷酸 ® 氨甲?；?L-天門冬氨酸+無(wú)機(jī)磷酸在高氨甲?；姿釢舛认?，L-天門冬氨酸對(duì)它有S形曲線，ATP是它的激活劑，CTP是它的抑制劑，ATP使它的S形曲線趨向于雙曲線，而CTP使它的S形曲線更為顯著。用汞的化合物處理，可以使此酶脫敏，協(xié)同效應(yīng)喪

37、失，同時(shí)也不受ATP和CTP的影響。此酶具有兩類亞基，一類為催化亞基，一類為調(diào)節(jié)亞基，調(diào)節(jié)亞基不具有催化活性，但能和CTP或ATP結(jié)合。每個(gè)分子由六個(gè)調(diào)節(jié)亞基和六個(gè)催化亞基組成，催化亞基有三個(gè)亞基組成一個(gè)單位，調(diào)節(jié)亞基由兩個(gè)亞基組成一個(gè)單位。調(diào)節(jié)亞基需要Zn2+穩(wěn)定它的二體形式。酶分子存在兩種構(gòu)象，當(dāng)L-天門冬氨酸結(jié)合上去以后，酶的催化亞基發(fā)生轉(zhuǎn)動(dòng)，使得上、下的催化亞基不是正好相對(duì)，酶處于松弛狀態(tài)。同樣L-天門冬氨酸的類似物琥珀酸、氨甲?；姿岷兔附Y(jié)合也有構(gòu)象的變化，顯然構(gòu)象的變化對(duì)于天門冬氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)控制起著重要作用。3-磷酸甘油醛脫氫酶是具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的一個(gè)代表，它催化下列反應(yīng)

38、：3-磷酸甘油醛+NAD+ +無(wú)機(jī)磷酸 ®1，3-二磷酸甘油酸 + NADH+H+3-磷酸甘油醛脫氫酶具有四個(gè)亞基，可以和四個(gè)NAD+結(jié)合，但結(jié)合常數(shù)不同，其結(jié)合NAD+的解離常數(shù)為： 蝦肌兔肌解離常數(shù)平衡透析測(cè)定超離心測(cè)定平衡透析測(cè)定K1K2K3K4<5 x 10-9 mol<5 x 10-9 mol6 x 10-7 mol13 x 10-6 mol <5 x 10-8 mol <5 x 10-8 mol4 x 10-6 mol35 x 10-6 mol<10-10 mol <10-9 mol 3 x 10-7 mol26 x 10-6 mol

39、熒光測(cè)定的結(jié)果也可以看出，第一個(gè)NAD+結(jié)合時(shí)，熒光變化最大，隨后逐漸減小，說(shuō)明了NAD+的結(jié)合引起了酶的構(gòu)象變化。由于K1和K2相接近，K3和K4相接近，二者相差將近兩個(gè)數(shù)量級(jí)，一般情況下，只能結(jié)合兩個(gè)NAD+，表現(xiàn)為半活性部位（half of the site）性質(zhì)。當(dāng)酶結(jié)合了兩個(gè)NAD+后，再結(jié)合第三、第四個(gè)NAD+就比較困難了，除非NAD+濃度高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。正協(xié)同效應(yīng)提供了一個(gè)配基濃度變化對(duì)反應(yīng)速度影響極為敏感的區(qū)間，在此區(qū)間以外，配基濃度的變化對(duì)于反應(yīng)速度影響都比較小。負(fù)協(xié)同效應(yīng)可以提供一個(gè)外環(huán)境配基濃度變化對(duì)酶活力影響很小的區(qū)間。這兩類的調(diào)節(jié)作用對(duì)于生物體內(nèi)不同功能的調(diào)節(jié)都是很有

40、用的。對(duì)于一個(gè)作用物在各個(gè)途徑的分配可以通過(guò)正協(xié)同效應(yīng)的酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，反饋抑制劑的作用是使該酶對(duì)作用物敏感區(qū)間向作用物濃度增大的方向移動(dòng)，也就是在更高的作用物濃度時(shí)，才可以使這個(gè)酶有效地起作用。例如氨基甲酰磷酸是合成CTP的原料，也是合成精氨酸的原料，L-天門冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的正協(xié)同效應(yīng)，就起到了使兩條途徑利用氨基甲酰磷酸能夠合理的分配。對(duì)于許多酶都需要的作用物，但是其中有一條途徑特別重要，一定要在各種條件都能保證它穩(wěn)定地進(jìn)行的情況下，負(fù)協(xié)同效應(yīng)可以起到這種作用。如NAD+是許多反應(yīng)都需要的，3-磷酸甘油醛脫氫酶為了使酵解作用能夠順利地進(jìn)行，NAD+的結(jié)合為負(fù)協(xié)同效應(yīng)，NAD+和此酶結(jié)合的解離

41、常數(shù)很小，因此盡管作用物NAD+的濃度很低，也能夠和酶順利地結(jié)合，但是當(dāng)NAD+濃度升高時(shí)，酶結(jié)合了兩個(gè)NAD+以后，第三個(gè)、第四個(gè)NAD+結(jié)合就非常困難，只有當(dāng)NAD+濃度高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)反應(yīng)才可繼續(xù)進(jìn)行，這樣就保證了3-磷酸甘油醛脫氫酶的反應(yīng)速度一定程度上不受其他反應(yīng)的影響。應(yīng)該指出，無(wú)論是MWC模型還是KNF模型都只是考慮了最簡(jiǎn)單的情況，亦即圖14-12中虛線和實(shí)線框出的情況，忽略了虛線以外其他情況，因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋可能還都有一定的局限性。 圖14-12 別構(gòu)酶可能存在的狀態(tài)虛線包括的部分為MWC模型中存在的狀態(tài)；實(shí)線包括部分為KNF模型中存在的狀態(tài)第四節(jié)  具有“酶”催化

42、活性的其他生物分子一、核酶 核酶是具有催化活性的RNA，又稱催化性RNA（catalytic RNA），關(guān)于ribozyme的中文譯名，曾有“RNA催化劑”、“核糖酶”、“核酶”、“類酶RNA”,“酶性RNA”、“酶RNA”等，目前廣泛采用的譯名為核酶。核酶的發(fā)現(xiàn)在理論上和實(shí)際應(yīng)用上都有著重大的意義。在生命起源理論上，能較好地解釋自然界中先有核酸，還是先有蛋白質(zhì)的問(wèn)題，對(duì)于生命起源和生命進(jìn)化的研究有著重要的啟示；在實(shí)踐上，由于核酶有內(nèi)切酶的活性，切割位點(diǎn)高度特異，因此，可以用來(lái)切割特定的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。只要設(shè)計(jì)時(shí)使核酶的配對(duì)區(qū)堿基與要被其降解的mRNA有合適的配對(duì)，就能進(jìn)行特異切割，從而破壞了m

43、RNA，抑制了基因表達(dá)。這為基因功能研究、病毒感染和腫瘤的治療提供了一個(gè)可行的途徑和非常有希望的前景。（一） 核酶的發(fā)現(xiàn) 1977年以來(lái)，發(fā)現(xiàn)許多真核細(xì)胞mRNA前體的拷貝區(qū)不是連續(xù)的，而是由一至數(shù)段間插序列（intervening Sequence,IVS）分開的，這些IVS在mRNA成熟過(guò)程中被除去。后來(lái)又有研究發(fā)現(xiàn)，一些真核細(xì)胞的rRNA前體、線粒體mRNA前體和rRNA前體在成熟過(guò)程中存在著自我剪接(self-splicing)反應(yīng)。這些rRNA、mRNA的前體能自我催化，除去自身的IVS。反應(yīng)過(guò)程不需要蛋白質(zhì)參加。1981年，Cech T.R發(fā)現(xiàn)，原生動(dòng)物四膜蟲的26S rRNA前體

44、，在成熟過(guò)程中，其IVS通過(guò)剪接反應(yīng)而被除去。此剪接反應(yīng)不需要蛋白質(zhì)酶的催化，亦不需要ATP或GTP。但必須有3為羥基的鳥苷酸存在。這個(gè)反應(yīng)不僅是磷酸二酯鍵的斷開和連接反應(yīng)，而且是轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)，是一種RNA的自我剪接作用。1983年，Altman證明，在較高濃度的Mg2+存在下，單獨(dú)的M1RNA可以催化tRNA前提的成熟，而單獨(dú)的蛋白質(zhì)酶則無(wú)催化活力。對(duì)于RNA酶P來(lái)說(shuō)，其中的蛋白質(zhì)是輔基，RNA是真正的催化劑。1986年，Zaug 等提出四膜蟲 rRNA前體的間插序列核糖核酸(L-19 IVS RNA，簡(jiǎn)稱 L19 RNA)是一種酶。 L19 RNA是一種少了前19個(gè)核苷酸的 IVS RNA

45、，它具有多種催化功能，催化作用符合米曼氏動(dòng)力學(xué)，kcat/Km為103（mol/L）-1.s-1，將這種具有催化作用的核酸稱之為ribozyme。之所以將L19 RNA稱為一種酶是因?yàn)長(zhǎng)19 RNA在一定條件下，能高度專一地催化下列反應(yīng)，并具有相應(yīng)的酶的特性。它的作用及特點(diǎn)是：1. 具有催化活性（1） 核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC + CpCpCpC五聚胞苷酸 六聚胞苷酸 四聚胞苷酸（2） 磷酸二酯酶活性CpCpCpCpCCpCpCpC + pC四聚胞苷酸 胞苷酸（3）磷酸轉(zhuǎn)移酶活性CpCpCpCpCpCp + UpCpUCpCpCpCpCpC + UpCpUp（

46、4）RNA限制性內(nèi)切酶活性-CUCU CUCUOH2. 反應(yīng)具有專一性L19 RNA對(duì)作用物具有反應(yīng)專一性。對(duì)多聚核糖核苷酸顯示特異性反應(yīng)，而對(duì)五聚脫氧胞苷酸(dpC5)或五聚脫氧腺苷酸(dpA5)無(wú)催化反應(yīng)。3. 對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑敏感L19 RNA對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑敏感，五聚脫氧胞苷酸 dpC5是 L19 IVS RNA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑， Ki = 260 mmol/L.（二）核酶的分類1. 按其作用方式分類核酶的作用可分成剪切反應(yīng)和剪接反應(yīng)，故核酶也可分類為相應(yīng)的剪切型和剪接型。（1）剪切型 剪切型有可分為兩類，一類的剪切反應(yīng)發(fā)生在RNA前體的成熟過(guò)程中，如大腸桿菌RNA酶P對(duì)tRNA前體的剪切反

47、應(yīng)，該酶含有的377個(gè)核苷酸是真正的催化劑，而蛋白質(zhì)則是輔基。另一類剪切反應(yīng)發(fā)生在某些動(dòng)植物的小環(huán)狀病原體RNA的復(fù)制過(guò)程中，如植物類病毒（viroid）,環(huán)狀單鏈衛(wèi)星RNA(也稱擬病毒virusoid)，線性衛(wèi)星RNA等。（2）剪接型 剪接反應(yīng)包括剪切反應(yīng)和連接反應(yīng)（連接酶活性）。剪切反應(yīng)又包括催化轉(zhuǎn)磷酸脂鍵反應(yīng)和水解反應(yīng)（RNA限制性內(nèi)切酶活性）。許多真核生物基因含有非編碼的插入序列，即內(nèi)含子，它們能被轉(zhuǎn)錄，但不能翻譯，因此，RNA前體都有一個(gè)加工成熟過(guò)程，即內(nèi)含子的切除和外顯子的連接。2. 按作用物分類按作用物，核酶可分為兩類：(1) 自體催化: 絕大多數(shù)核酶以自身RNA為作用物，即RN

48、A作用于RNA，進(jìn)行自我催化，可以是自我剪切，也可以是自我剪接,許多RNA前體的加工成熟屬于自體催化。(2) 異體催化: 異體催化是以其他化合物為作用物，可以RNA，也可以是多糖、DNA以及氨基酸酯等。如細(xì)菌（大腸桿菌、枯草桿菌等）RNA 酶P中的RNA能以前體tRNA為作用物，加工催化tRNA前體5端成熟。兔肌直鏈淀粉異構(gòu)酶中的RNA能以淀粉為作用物。催化分支反應(yīng)。人工合成的具有催化能力的19寡核苷酸能以人工合成的相應(yīng)的24寡核糖核苷酸為作用物，進(jìn)行催化切割。四膜蟲核酶的衍生物也可以催化DNA的定點(diǎn)切割。3. 按結(jié)構(gòu)和來(lái)源分類根據(jù)結(jié)構(gòu)和來(lái)源分類，可將小的自我剪切的核酶分為錘頭型(hammer

49、head)、發(fā)夾型(hairpin)、人丁型肝炎病毒(hepatitis delta， HDV )和脈孢菌(Neurospora)VS核酶四類。圖14-13顯示這四種核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖14-13 幾種類型的核酶A. 錘頭型核酶；B.發(fā)夾型核酶，a.分子間發(fā)夾型核酶，b.分子內(nèi)發(fā)夾型核酶；C.HDV核酶的基因鏈；D.脈抱菌(Neurospora)VS核酶。圖中的箭頭表示催化斷裂部位。 （三）核酶的結(jié)構(gòu)與功能1. 核酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)核酶一級(jí)結(jié)構(gòu)分子大小可以不同，如錘頭型核酶L19IVS是從6400個(gè)核苷酸的四膜蟲大核rRNA逐步剪接而來(lái)，由395個(gè)核苷酸組成，而用于分解猴免疫缺陷病毒所人工合成的核酶總

50、長(zhǎng)度僅為76個(gè)核苷酸。煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA負(fù)鏈（-）sTRSV）屬發(fā)夾型核酶，由351個(gè)核苷酸組成。人丁型肝炎病毒(HDV)是目前已知唯一自然感染人體細(xì)胞且具有核酶活性的動(dòng)物病毒，HDV RNA長(zhǎng)約1.7 kb，是動(dòng)物病毒中最小的核酸分子。在HDV RNA中存在基因鏈和反基因鏈RNA，兩者互補(bǔ)，但反基因鏈RNA僅占5%20%。HDV核酶切割活性的最短序列為84個(gè)核苷酸（或67個(gè)核苷酸）。2. 核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)錘頭型核酶、發(fā)夾型核酶、人丁型肝炎病毒核酶和包裝(Neurospora)VS核酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)均已經(jīng)清楚（圖14-13），現(xiàn)有一些書中都已經(jīng)主要介紹了錘頭型核酶的結(jié)構(gòu)，本章主要介紹小的發(fā)夾型核

51、酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。發(fā)夾型核酶首先在煙草環(huán)斑病毒衛(wèi)星RNA負(fù)鏈（-）sTRSV）上發(fā)現(xiàn)， 該核酶含有四個(gè)堿基配對(duì)螺旋區(qū)（H1H4），兩個(gè)未配對(duì)的環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）（圖14-14），圖中（a）代表核酶部分核苷酸順序和二級(jí)結(jié)構(gòu)，箭頭指處為發(fā)生反應(yīng)的二酯鍵，核酶結(jié)構(gòu)中不參加反應(yīng)的部位由連線表示。圖14-14 核酶的二極結(jié)構(gòu) a.（-）sTRSV發(fā)夾型核酶最小功能區(qū)的序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)模型；b. 圖中顯示的核苷酸對(duì)催化活性都是必需的，N表示的核苷酸對(duì)催化活性不是必需的在兩個(gè)未配對(duì)的環(huán)中，大多數(shù)核苷酸的突變或修飾可影響核酶的催化活性。圖14-14（b）顯示的是（-）sTRSV的部分結(jié)構(gòu)，其中一些核苷酸改變后，只要堿

52、基對(duì)仍能維持，就不影響核酶活性，這部分核苷酸用N表示。未配對(duì)的N50和N-6對(duì)于核酶活性并不需要，但可防止H2和H3的直線排列(coaxial stacking),并能促進(jìn)功能折疊區(qū)的聚攏。各種修飾的核酶只要H1具有2個(gè)到至少27個(gè)堿基對(duì)，以及H4具有25個(gè)堿基對(duì)時(shí)，核酶即可維持完全的活力。相反，當(dāng)H2的堿基對(duì)延長(zhǎng)到5個(gè)時(shí)即可抑制核酶的活性。若將H2的U-5置換為A，由于AA不能配對(duì)，使H2縮短為3個(gè)堿基對(duì)，此時(shí)對(duì)核酶活性有一定的影響，但可增進(jìn)A14的二甲基硫酸修飾，說(shuō)明H2中U-5-A14配對(duì)不是必需的。不論切斷還是延伸H2或H3都可改變?cè)谌?jí)結(jié)構(gòu)中A和B兩個(gè)環(huán)的相對(duì)直線排列，從而使A和B兩

53、個(gè)環(huán)無(wú)法相互作用。核酶的組裝可有多種形式，由單一植物衛(wèi)星RNA序列中組裝的核酶，可以通過(guò)分子間堿基配對(duì)形成功能性復(fù)合體。圖14-13B顯示的是分子內(nèi)和分子間核酶構(gòu)像。如圖14-14所示，作用物RNA與核酶RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合，作用物斷裂后產(chǎn)生的5產(chǎn)物與核酶相連形成H2，而3產(chǎn)物與核酶相連形成H1。核酶可通過(guò)改變H1和H2序列就可識(shí)別和切斷各種mRNA和病毒靶RNA，該方法可用于抗基因的反義技術(shù)。若用寡核苷酸取代H2和H3之間的非必需序列，使作用物的5末端與核酶3末端共價(jià)相連，所形成的核酶變體活性最小。3. 三級(jí)結(jié)構(gòu)（1） A環(huán)和B環(huán)的空間位置A環(huán)和B環(huán)的空間位置對(duì)于核酶活性十分重要，核酶活性

54、有賴于H2和H3之間形成螺旋-環(huán)-螺旋的對(duì)接（helix-loop-helix domains dock）, 形成非直線指向，使A環(huán)和B環(huán)接近。若將H2和H3直接連接起來(lái)以迫使A環(huán)和B環(huán)直線排列，即可導(dǎo)致核酶活性喪失。H2和H3之間若有5個(gè)以上的核苷酸時(shí)，酶活性最大。說(shuō)明H2和H3之間的銳角對(duì)于核酶活性是必要的。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)證明，在低鹽緩沖液中，當(dāng)缺少合適作用物和產(chǎn)物，或者核酶和RNA作用物是非活性突變體時(shí)，核酶構(gòu)像呈伸展（undock）狀態(tài)。降低溫度，提高鹽濃度有利于形成對(duì)接構(gòu)象。如在12 mmol/L MgCl2的緩沖液，17.8 時(shí)，大約65%發(fā)夾型核酶呈對(duì)接態(tài)。

55、A環(huán)和B環(huán)的對(duì)接可以以兩種方式進(jìn)行，即雙向（two-way）和四向(four-way)方式（圖14-15 a和b），對(duì)接促進(jìn)H4上的“給位”（D）和H1上的“受位”（A）之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。對(duì)于一個(gè)32個(gè)堿基對(duì)的RNA螺旋，在完全伸展的狀態(tài)時(shí)，兩端之間的距離為77 Å。在適宜的條件下，H1和H4對(duì)接，兩端之間的距離可縮短到34Å。圖14-15 發(fā)夾型核酶A環(huán)和B環(huán)通過(guò)雙向(a)和四向方式(b)合攏A環(huán)和B環(huán)連接的性質(zhì)對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)影響很大，在天然（-）sTRSV，H2和H3螺旋之間插入了兩個(gè)附加螺旋，形成四向螺旋連接。在缺少金屬陽(yáng)離子情況下，四向螺旋呈伸展?fàn)顟B(tài)，其

56、中H1，A環(huán)，H2和H6在一個(gè)軸上，H3，B環(huán)，H4和H5在一個(gè)軸上，兩個(gè)軸垂直成直角，整個(gè)分子呈伸展?fàn)睢．?dāng)條件適宜時(shí)，H1和H4折疊靠攏。在四向螺旋連接的方式中，對(duì)接的核酶構(gòu)象比伸展的構(gòu)象更為穩(wěn)定。（2）A環(huán)的空間結(jié)構(gòu) 核磁共振技術(shù)（NMR）顯示A環(huán)堿基與堿基之間，堿基與核糖之間形成氫鍵（圖14-16），而且堿基之間呈非Watson-Crick配對(duì)。如G+1的N3和A9的第六位氨基之間、G+1的第二位氨基和A9的N7之間形成氫鍵。這些配對(duì)的堿基對(duì)于核酶活性是必需的，如果將G+1置換為A、C、U或I，或者去掉第二位的氨基，都可使核酶活性降低。 若將A9置換為G、C或U，或者用C-H取代A9的N7，核酶活性也受到影響。另外在G8的羰基O6和G+1的2 羥基之間、G8的N1或2-氨基和N+2的核糖之間，以及N+3的堿基及核糖和A9的核糖之間均有氫鍵。圖 14-16 A環(huán)的結(jié)構(gòu)模型 a: A環(huán)堿基與堿基之間的氫鍵(實(shí)線)和核糖與核糖間的氫鍵(虛線) b: A9和G1間的氫鍵A環(huán)上有些基團(tuán)對(duì)催化活性是重要的，但對(duì)分離的A環(huán)NMR研究并未顯示，可能這些功能基團(tuán)參與A環(huán)和B環(huán)在三級(jí)結(jié)構(gòu)上的相互作用，也可能參與了由于對(duì)接引起結(jié)構(gòu)重排所造成的A環(huán)內(nèi)相互作用。某些基團(tuán)的修飾可以降低核酶活性，如G+1O6羰基的甲基化，以及以C-H取代N7，均可影響核酶活性。若將G8置換為A、C、U或