_甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)微生物菌群及pH值的影響

1、宋智娟,北京市東方富英廣告有限責(zé)任公司,100085,北京市海淀區(qū)清河永泰園新地標(biāo)15號(hào)樓2001室。張艷銘,北京天農(nóng)飼料有限公司。廖智慧,衡水職業(yè)技術(shù)學(xué)院。收稿日期:2007-10-12-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)微生物菌群及pH 值的影響宋智娟張艷銘廖智慧摘要試驗(yàn)以AA 肉仔雞為試驗(yàn)動(dòng)物,研究在日糧中添加不同水平的-甘露聚糖酶對(duì)腸道菌群及pH 值的影響。試驗(yàn)選擇健康、體重相近1日齡AA 肉仔雞384只(公母各半,公母分開飼養(yǎng),各設(shè)4個(gè)處理,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),每重復(fù)12只雞。處理為對(duì)照組,飼喂基礎(chǔ)日糧,處理、組為-甘露聚糖酶添加組,在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.03%、0.06%、0.1%的-甘

2、露聚糖酶。試驗(yàn)期為6周,測(cè)定其腸道菌群及pH 值,結(jié)果表明,日糧中添加-甘露聚糖酶可以提高肉雞腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量,降低大腸桿菌的數(shù)量及pH 值,保護(hù)腸道內(nèi)健康的環(huán)境。與對(duì)照組相比,、組的大腸桿菌數(shù)量分別減少了2.82%(P<0.01、5.27%(P<0.01和6.62%(P<0.01;乳酸桿菌數(shù)量分別增加了0.96%(P>0.05、1.09%(P>0.05和1.81%(P<0.05,但添加組之間差異不顯著(P>0.05;雙歧桿菌數(shù)量分別增加了1.39%(P<0.01、2.32%(P<0.01和3.14%(P<0.01;pH

3、 值分別降低了0.59%(P<0.05、1.04%(P<0.01和1.34%(P<0.01。關(guān)鍵詞-甘露聚糖酶;肉雞;腸道微生物菌群;pH 值中圖分類號(hào)S831.5甘露聚糖類物質(zhì)作為半纖維素的第二大組分,廣泛分布于自然界中,是抗?fàn)I養(yǎng)因子非淀粉多糖的主要組成成分,它能結(jié)合大量水分,增加機(jī)體消化道內(nèi)容物的粘稠度。養(yǎng)分的消化吸收不良可導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)蓄積,富含養(yǎng)分的食糜是細(xì)菌,特別是致病菌的良好培養(yǎng)基,并且食糜通過(guò)消化道的速率降低,會(huì)大大減少菌群的移動(dòng),使細(xì)菌得以在腸道上大量定居下來(lái),從而改變了腸道內(nèi)的微生物區(qū)系(Fuller,1991,并且大量有害細(xì)菌的增殖會(huì)消耗許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

4、,從而降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率。此外,腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)量增多會(huì)刺激腸壁,并使之增厚,同時(shí)損傷腸壁(Ikegami 等,1990;Viveros 等,1994,進(jìn)一步降低腸道對(duì)養(yǎng)分的吸收。某些細(xì)菌還可能產(chǎn)生毒素,影響宿主健康。-甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶,以內(nèi)切方式降解-1,4糖苷鍵,不但能消除日糧中甘露聚糖類物質(zhì)的抗?fàn)I養(yǎng)作用,而且使日糧中的甘露聚糖類物質(zhì)降解成甘露寡糖。甘露寡糖與病原菌在腸壁上的受體具有相似的結(jié)構(gòu),它與病原菌表面的類丁質(zhì)也有很強(qiáng)的結(jié)合力,可競(jìng)爭(zhēng)性地與病原菌結(jié)合,使其無(wú)法附植在腸壁上,結(jié)合后的甘露寡糖不能提供病原菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)素,致使病原菌死亡而失去致病能力。甘露寡糖也是動(dòng)物腸道內(nèi)有

5、益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌等的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可促進(jìn)其大量繁殖。本試驗(yàn)可為-甘露聚糖酶作為一種飼用酶制劑在玉米豆粕型日糧中的應(yīng)用提供依據(jù)。1材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物1日齡出生重相近的健康A(chǔ)A 肉仔雞384只。1.2試驗(yàn)材料試驗(yàn)所用的重組畢赤酵母表達(dá)的-甘露聚糖酶,由中國(guó)農(nóng)科院飼料研究所研制,最適pH 值為5.5。酶活為30000U/g 。1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)方案。第組為基礎(chǔ)對(duì)照組,飼喂基礎(chǔ)日糧;第、組為-甘露聚糖酶添加組,在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.03%、0.06%、0.1%的-甘露聚糖酶。選用1日齡出生重相近的健康A(chǔ)A 肉仔雞384只,公母分開飼養(yǎng),公母各設(shè)4個(gè)處理,每個(gè)處理4

6、個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)12只雞。試驗(yàn)期共42d ,分兩個(gè)階段進(jìn)行,即03周齡和46周齡。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)組別-甘露聚糖酶添加量(%0.030.10.061.4試驗(yàn)飼糧試驗(yàn)飼糧為玉米豆粕型日糧,參照肉雞營(yíng)養(yǎng)需要NRC (1994及家禽營(yíng)養(yǎng)與飼料設(shè)計(jì)配制。03周飼料工業(yè)2007年第28卷第22期酶制劑齡用號(hào)料,46周齡用號(hào)料,其日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。表2日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平項(xiàng)目飼糧成分(%玉米豆粕植物油食鹽石粉磷酸氫鈣預(yù)混料營(yíng)養(yǎng)成分代謝能(MJ/kg粗蛋白(%鈣(%總磷(%賴氨酸(%蛋氨酸(%半胱氨酸(%03周齡(號(hào)料56372.70.312112.4020.390.950.511.250

7、.580.3446周齡(號(hào)料5860.931.88112.8519.130.890.481.010.440.32注:每千克預(yù)混料中含DL-蛋氨酸129g、鐵5000mg、銅800mg、錳6000mg、鋅6000mg、硒35mg、碘60mg、煙酸560mg、葉酸8.0mg、VA1000000IU、VD3216000IU、VE1490IU、VK3 100mg、VB140mg、VB21230mg、VB120.5mg、泛酸鈣500mg、氯化膽堿50g。1.5檢測(cè)指標(biāo)與方法1.5.1盲腸腸道微生物菌落數(shù)的測(cè)定剖腹并結(jié)扎所取盲腸段的兩頭,用酒精棉球消毒各結(jié)扎口后,放入已滅菌塑料袋中,

8、備用。將樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后,在超凈工作臺(tái)上立即稱取1.0g左右腸內(nèi)容物于無(wú)菌試管中,加入先配好并已滅菌的稀釋液9ml,加入玻璃球振蕩30s,此濃度為10-1倍,靜置一段時(shí)間,吸取上清液1ml于盛有9ml稀釋液的試管中進(jìn)行10-2稀釋,振搖34s,并依次進(jìn)行10-310-7倍稀釋。培養(yǎng)大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌并做生化鑒定。將培養(yǎng)后的平皿選擇合適的濃度梯度(以長(zhǎng)10100個(gè)菌落為宜,根據(jù)菌落可數(shù)性原則,即1個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生1個(gè)菌落,對(duì)3種微生物進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),求其平均值,每克腸道內(nèi)容物所含的細(xì)菌數(shù),以每克盲腸內(nèi)容物含細(xì)菌數(shù)的lg cfu表示,計(jì)算公式如下:每克盲腸內(nèi)容物菌落數(shù)=log10(菌落數(shù)&#

9、215;稀釋倍數(shù)×每次稀釋取樣毫升數(shù)/(接種用樣品毫升數(shù)×樣品克數(shù)。1.5.2盲腸腸道內(nèi)容物pH值取1g左右盲腸腸道內(nèi)容物,用蒸餾水稀釋10倍,用pHBJ-260型便攜式pH計(jì)測(cè)定pH值。1.6數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel XP及SPSS11.0數(shù)據(jù)處理軟件中方差分析過(guò)程進(jìn)行雙因素?cái)?shù)理統(tǒng)計(jì),并對(duì)均數(shù)作LSD多重比較,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2試驗(yàn)結(jié)果日糧中添加-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)微生物菌群及pH值的影響見表3,其方差分析結(jié)果見表4。表3-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)微生物菌群及pH值的影響項(xiàng)目大腸桿菌(lg cfu/g公雞母雞平均值乳酸桿菌(lg cfu/g公雞母

10、雞平均值雙歧桿菌(lg cfu/g公雞母雞平均值pH值公雞母雞平均值8.19±0.06A8.12±0.08A a8.16±0.07A8.30±0.05a8.23±0.06a8.27±0.06a8.60±0.12A a8.62±0.07A8.61±0.09A6.72±0.07A a6.75±0.02A a6.74±0.06A a7.92±0.03B7.94±0.06A b7.93±0.04B8.40±0.12a8.31±0.10

11、ab8.35±0.11ab8.69±0.05B a8.77±0.05B a8.73±0.06B a6.69±0.07b6.71±0.03b6.70±0.05b7.67±0.13C a7.79±0.15B bc7.73±0.14C a8.33±0.04a8.39±0.09ab8.36±0.07ab8.82±0.02B b8.81±0.03B ab8.81±0.02B b6.65±0.04B c6.68±0.04B c6

12、.67±0.04B c7.58±0.15C a7.66±0.12B c7.62±0.13C b8.42±0.26a8.41±0.08b8.42±0.08b8.89±0.10C b8.86±0.02B b8.88±0.07C b6.63±0.03B c6.66±0.03B c6.65±0.03B c平均值7.84±0.267.88±0.208.36±0.148.334±0.108.75±0.148.77±0.

13、106.67±0.066.70±0.05注:表中同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01,標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05,標(biāo)有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05。表4腸道內(nèi)微生物菌群及pH值方差分析結(jié)果方差分析組別水平間P值性別水平間P值組別與性別互作P值大腸桿菌0.0000.3530.325乳酸桿菌0.0410.5010.634pH值0.0030.1380.670雙歧桿菌0.0000.4200.3972.1-甘露聚糖酶對(duì)大腸桿菌數(shù)的影響不同-甘露聚糖酶添加水平對(duì)肉雞腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)有極顯著影響,而性別因素對(duì)其無(wú)影響。、組公

14、雞大腸桿菌數(shù)分別比對(duì)照組減少了3.3%(P<0.01、6.35%(P<0.01和7.45%(P<0.01,、組與組相比差異極顯著(P<0.01,而、組之間差異不顯著(P>0.05。、組母雞大腸桿菌數(shù)分別比對(duì)照組減少了2.22%(P<0.05、4.06%(P<0.01和5.67%(P<0.01。在不考慮性別因素時(shí),、組大腸桿菌數(shù)分別比對(duì)照組減少了2.82%(P<0.01、5.27%(P<0.01和6.62%(P<0.01,、組與組、組相比差異極顯著(P<0.01?？傮w來(lái)看,日糧中添加-甘露聚糖酶可以顯著降低肉雞腸道中大腸桿菌

15、的數(shù)量,而且在本試驗(yàn)所設(shè)的添加劑量范圍內(nèi),隨著添加量的增加效果越明顯。2.2-甘露聚糖酶對(duì)乳酸桿菌數(shù)的影響不同-甘露聚糖酶添加水平對(duì)肉雞腸道中乳酸桿菌數(shù)有影響,而性別因素對(duì)其無(wú)影響。、組公雞乳酸桿菌數(shù)分別比對(duì)照組增加了1.2%(P>0.05、0.36%(P>0.05和1.45%(P>0.05。、組母雞乳酸桿菌數(shù)分別比對(duì)照組增加了0.97% (P>0.05、1.94%(P>0.05和2.19%(P<0.05。在不考慮性別因素時(shí),、組乳酸桿菌數(shù)分別比對(duì)照組增加了0.96%(P>0.05、1.09%(P>0.05和1.81%(P<0.05?？傮w來(lái)

16、看,日糧中添加-甘露聚糖酶可以顯著增加肉雞腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量,而且在本試驗(yàn)所設(shè)的添加劑量范圍內(nèi),添加量越大效果越明顯。2.3-甘露聚糖酶對(duì)雙歧桿菌數(shù)的影響不同-甘露聚糖酶添加水平對(duì)肉雞腸道中雙歧桿菌數(shù)有極顯著影響,而性別因素對(duì)其無(wú)影響。、組公雞雙歧桿菌數(shù)分別比對(duì)照組增加了1.05%(P<0.01、2.56%(P<0.01和3.37%(P<0.01,組與、組相比差異極顯著(P<0.01,組與組相比差異顯著(P<0.05。、組母雞雙歧桿菌數(shù)分別比對(duì)照組增加了1.74%(P<0.01、2.20%(P<0.01和2.78%(P<0.01。在不考慮性別因

17、素時(shí),、組雙歧桿菌數(shù)分別比對(duì)照組增加了1.39%(P<0.01、2.32%(P<0.01和3.14%(P<0.01?？傮w來(lái)看,日糧中添加-甘露聚糖酶可以顯著增加肉雞腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量,而且在本試驗(yàn)所設(shè)的添加劑量范圍內(nèi),添加量越大效果越明顯。2.4-甘露聚糖酶對(duì)腸道內(nèi)容物pH值的影響不同-甘露聚糖酶添加水平對(duì)腸道內(nèi)容物pH 值有顯著影響,而性別因素對(duì)其無(wú)影響。、組公雞腸道內(nèi)容物pH值分別比對(duì)照組降低了0.45%(P<0.05、1.04%(P<0.01和1.34%(P<0.01。、組母雞腸道內(nèi)容物pH值分別比對(duì)照組降低了0.59%(P<0.05、1.04

18、%(P<0.01和1.33%(P<0.01。在不考慮性別因素時(shí),、組腸道內(nèi)容物pH值分別比對(duì)照組降低了0.59%(P<0.05、1.04%(P<0.01和1.34%(P<0.01?？傮w來(lái)看,日糧中添加-甘露聚糖酶可以顯著降低肉雞腸道內(nèi)容物的pH值,而且在本試驗(yàn)所設(shè)的添加劑量范圍內(nèi),添加量越大效果越明顯。3討論3.1-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)的影響-甘露聚糖酶可降解豆粕中甘露聚糖,產(chǎn)生甘露寡糖,甘露寡糖能為革蘭氏陰性菌提供配基結(jié)合位點(diǎn),從而阻止病原菌與腸細(xì)胞接觸引起繼發(fā)性的腸道感染,甘露寡糖是一種端基含甘露糖的寡糖,這些甘露糖單位類似腸細(xì)胞的受體,能與具有I

19、型纖毛的革蘭氏陰性病原菌結(jié)合。腸道病原菌在引起疾病之初必須與腸粘膜粘接才能在胃腸道定植和繁殖而致病。這種細(xì)菌與腸粘膜的粘接是通過(guò)細(xì)胞表面外源凝集素與腸粘膜上皮細(xì)胞特異性的糖分子結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。若能阻斷細(xì)菌同腸粘膜上皮細(xì)胞特異性糖分子受體粘接,就有可能阻斷或減輕細(xì)菌性腸道疾病的發(fā)生。岳文斌等(2002研究報(bào)道,與對(duì)照組相比甘露寡糖可以顯著降低仔豬盲腸、結(jié)腸大腸桿菌濃度(P<0.05。王冉等(2002研究證明,添加甘露寡糖組試驗(yàn)雞空腸和盲腸內(nèi)大腸桿菌數(shù)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.05。但是,另有一些報(bào)道表明,甘露寡糖并沒有減少盲腸中大腸桿菌的數(shù)量。Stanley等報(bào)道,在肉雞飼糧中添加甘露

20、寡糖,盲腸中大腸桿菌數(shù)并沒有減少。周映華等(2003研究表明,與對(duì)照組相比,添加不同水平的甘露寡糖不同程度地提高了盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量,但對(duì)盲腸中大腸桿菌數(shù)量沒有明顯降低趨勢(shì)。本試驗(yàn)研究證實(shí),添加-甘露聚糖酶可以顯著降低腸道中大腸桿菌的數(shù)量,0.06%和0.1%添加組的大腸桿菌數(shù)比對(duì)照組分別減少了5.27%(P<0.01和6.62%(P<0.01。這與于桂陽(yáng)等(2004的甘露寡糖的試驗(yàn)結(jié)果相吻合。3.2-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)的影響-甘露聚糖酶降解-甘露聚糖產(chǎn)生的甘露寡糖在動(dòng)物消化道被微生物發(fā)酵,產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,調(diào)節(jié)腸道pH值,促進(jìn)腸道內(nèi)乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖。通過(guò)降低腸道

21、pH值或通過(guò)乳酸桿菌對(duì)有害菌在空間、營(yíng)養(yǎng)上的屏蔽競(jìng)爭(zhēng)作用來(lái)抑制有害菌在腸道的定植和生長(zhǎng)。于桂陽(yáng)等(2004報(bào)道,在飼料中加入甘露寡糖,有助于肉雞盲腸中乳酸桿菌的增殖,試驗(yàn)各組與對(duì)照組之間相比差異顯著(P<0.05。本試驗(yàn)中,肉雞飼料中添加-甘露聚糖酶可以顯著增加肉雞腸道中乳酸桿菌的數(shù)量,而且隨著-甘露聚糖酶添加量的增加,腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)也增加。0.1%-甘露聚糖酶添加組使乳酸桿菌數(shù)比對(duì)照組增加1.81%,差異顯著(P<0.05。3.3-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道中雙歧桿菌數(shù)的影響-甘露聚糖酶降解-甘露聚糖產(chǎn)生的甘露寡糖可降低腸道pH值,從而促進(jìn)了腸道內(nèi)雙歧桿菌的生長(zhǎng)繁殖。有試驗(yàn)證實(shí),甘露

22、寡糖可以促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長(zhǎng)。李寶玉研究發(fā)現(xiàn),甘露寡糖等低聚糖可以更快速地被雙歧桿菌利用,促進(jìn)了雙歧桿菌的大量增殖。本試驗(yàn)中,盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量,試驗(yàn)組與對(duì)照組之間相比差異極顯著(P<0.01,0.1%-甘露聚糖酶添加組使雙歧桿菌數(shù)比對(duì)照組增加3.14%。這表明在飼料中加入-甘露聚糖酶,有助于雙歧桿菌的增殖。3.4-甘露聚糖酶對(duì)肉雞腸道內(nèi)容物pH值的影響動(dòng)物消化道微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)和功能與腸道生態(tài)環(huán)境相互影響。-甘露聚糖酶降解-甘露聚糖產(chǎn)生的甘露寡糖在動(dòng)物消化道被微生物發(fā)酵,產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,從而降低腸道pH值。pH值降低可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng),促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖。而雙歧

23、桿菌、乳酸桿菌等有益菌又可將腸道中的可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)變成醋酸和乳酸,因此又降低了腸道環(huán)境的pH 值。石寶明等(2000用0.1%寡聚糖飼喂哺乳仔豬,與對(duì)照組相比,腸道pH值由5.76下降至5.61。國(guó)外學(xué)者在培養(yǎng)基中加入1%低聚糖,可使pH值由6.52下降到5.10,并認(rèn)為pH值的降低是片球菌具有抑制效應(yīng)的主要原因(張偉,2000。周仲凱(1999和盧建軍(1999報(bào)道,在攝入寡聚糖期間動(dòng)物排出糞便的pH 值攝入前后一般要相差0.5,并且糞便中的醋酸、丙酸和丁酸等有機(jī)酸的含量大幅度提高,而糞便中氨和硫化氫的含量大幅度下降。邵良平等(1999研究表明,飼糧中添加不同劑量的甘露寡糖均能使試驗(yàn)雞盲腸和回

24、腸pH值極顯著低于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明,-甘露聚糖酶可以降低腸道中內(nèi)容物的pH值,在本試驗(yàn)所設(shè)的添加范圍內(nèi),pH值隨著-甘露聚糖酶添加量的增加而增加。0.03%、0.06%和0.1%添加組pH值分別比對(duì)照下降了0.04、0.07和0.09。4結(jié)論添加-甘露聚糖酶可顯著降低肉雞腸道內(nèi)容物pH值,并促進(jìn)盲腸內(nèi)乳酸桿菌、雙歧桿菌的增殖,抑制大腸桿菌的繁殖。改變腸道酸堿度,改善腸道菌群平衡,增進(jìn)動(dòng)物健康。參考文獻(xiàn)1Ch ristle SU,Bartram HP,pa ul A,et al.Bile acid metabolism by colonic bacteria in continous cu

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