生物技術(shù)制藥重點(diǎn)(共6頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上生物技術(shù)制藥（Biotechnological Pharmaceutics）是不斷引進(jìn)現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)和制劑學(xué)及現(xiàn)代基因工程等多學(xué)科先進(jìn)技術(shù)而形成與發(fā)展起來的實(shí)用制藥技術(shù)?；蚬こ趟幬锏纳a(chǎn)分為上游和下游兩個(gè)階段： 上游階段：主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。 選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。、下游階段：從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)

2、模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等?；蚬こ趟幬镏扑幍闹饕绦颍耗康幕虻目寺?gòu)建DNA重組體DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌工程菌發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)等反轉(zhuǎn)錄法就是分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA克隆表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：RT-PCR是將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，該法是mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，在以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始

3、協(xié)助下，PCR擴(kuò)增，特異性的合成目的cDNA鏈（目的基因）?；瘜W(xué)合成法：較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學(xué)合成法獲得。合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因?；虮磉_(dá)：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程進(jìn)行基因表達(dá)研究的主要問題是目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。因此，建立最佳的基因表達(dá)體系，是基因表達(dá)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。表達(dá)載體必須具備的條件（1）載體能夠獨(dú)立的復(fù)制；（2）具有靈活的克隆位點(diǎn)

4、和方便的篩選標(biāo)記。并且克隆位點(diǎn)應(yīng)在啟動子序列后， 以使克隆的外源基因得以表達(dá)；（3）具有很強(qiáng)的Promoter，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別；（4）具有Repressor，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄； （5）具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因， 而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)的基因。（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列， 以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素：（1）外源基因的拷貝數(shù)（2）外源基因的表達(dá)效率（3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性（4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷（5）工程菌的培養(yǎng)條件 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式：（1）以

5、融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，蛋白質(zhì)在菌體內(nèi)比較穩(wěn)定；易高效表達(dá)；但只能做抗原。一般不做人體注射用藥。（2）以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因-天然完整蛋白：非融合蛋白是指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG為起始在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列 缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反應(yīng)。（3）分泌型表達(dá)蛋白藥物基因- 產(chǎn)物可跨膜分泌至胞周間隙 外源基因融合到原核蛋白信號肽序列的下游 優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。乙酸產(chǎn)生的原因及防治方法：碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會產(chǎn)生乙

6、酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源，連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生?！皣?yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為魔點(diǎn)ppGpp的結(jié)果。 ppGpp是一個(gè)重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延伸過程減少轉(zhuǎn)錄。它的濃度增加會導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時(shí)RNA聚合酶在模板上的移動產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動子rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過干

7、擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應(yīng)。基因工程菌在傳代過程中常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象。 質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為：分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一 定 比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法：先使菌體生長至一定密度再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)基因工程菌的培養(yǎng)方式：1. 分批培養(yǎng)2. 補(bǔ)料分批培養(yǎng)3. 連續(xù)培養(yǎng)4. 透析培養(yǎng)5. 固定化培養(yǎng)對發(fā)酵影響較大的幾個(gè)因素有：1. 培養(yǎng)基的影響2. 接種量的影響3. 溫度的影響4. 溶氧量的影響5. 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響6. 誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響7. pH的影響目的產(chǎn)物的分

8、離純化： 目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化。蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定。離子交換層析（ ion exchange chromatography IEC）：離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動，利用

9、這種移動差別可使大分子與小分子分開。DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法： DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒包含體蛋白復(fù)性方法：1 稀釋復(fù)性和透析復(fù)性2 含二硫鍵的蛋白

10、的復(fù)性3封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性4凝膠過濾層析復(fù)性5 小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性6分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性7人工分子伴侶的復(fù)性貼壁細(xì)胞：生長須有貼附的支持物表面， 自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。兩種形態(tài)：成纖維細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型懸浮細(xì)胞：生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細(xì)胞。兼性貼壁細(xì)胞：生長不嚴(yán)格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。接觸抑制或密度依賴現(xiàn)象：當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，即每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖。此時(shí)若能保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活相當(dāng)一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加，這種現(xiàn)象稱為生產(chǎn)用動物

11、細(xì)胞的要求： 原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系生產(chǎn)用動物細(xì)胞獲得的類型：原代細(xì)胞：是直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。需要大量動物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆， 從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：通過某個(gè)轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的，和人工的，從腫瘤組織中。融合細(xì)胞系：（1）仙臺病毒融合法（2）聚乙二醇融合法（3）電融合法重組工程細(xì)胞系基因工程手段真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用的載

12、體有兩類：病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒。牛痘病毒：用構(gòu)建多價(jià)疫苗。腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒： 用于基因治療。桿狀病毒： 用于外源基因表達(dá)。動物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成：分3類:天然培養(yǎng)基： 血清、羊水、腹水等,成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定合成培養(yǎng)基：DME、 MEM、 DMEM、 HAM F12、 RPMI1640、氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)鹽、其它成分。無血清培養(yǎng)基：提高重復(fù)性減少微生物污染供應(yīng)充足穩(wěn)定產(chǎn)品易純化避免血清因素對細(xì)胞的毒性減少血清中蛋白對生物測定的干擾。無血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長因子和激素結(jié)合蛋白貼附因子和伸展因子有利細(xì)胞生長的因子和元素添加小牛血清的作用：提供生長因子

13、和激素提供貼附因子和伸展因子提供結(jié)合蛋白提供必需脂肪酸和微量元素動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法：依細(xì)胞種類: 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)。依培養(yǎng)基: 液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)。依培養(yǎng)器和方式: 靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、固定床或流化床培養(yǎng)。從生產(chǎn)實(shí)際分為: 懸浮培養(yǎng)：讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。 貼壁培養(yǎng)：讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。貼壁-懸浮培養(yǎng)：微載體培養(yǎng)包埋和微囊培養(yǎng)結(jié)團(tuán)培養(yǎng)。動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式：分批式操作，半連續(xù)式操作灌流式操作動物細(xì)胞制藥的前景與展望：一、提高產(chǎn)量降低成本和改進(jìn)質(zhì)量方面的研究二、利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本三、抑制細(xì)胞凋

14、亡，延長培養(yǎng)周期四、采用糖基化工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量五、轉(zhuǎn)基因動物的研究六、組織工程的研究單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。人鼠嵌合抗體： 抗原抗體結(jié)合功能抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H 和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H 和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H 和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)完整人-鼠嵌合抗體。噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法：獲取目的基因抗體庫技術(shù)的載體淘篩表達(dá)與鑒定。植物組織和器官培養(yǎng)：是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)

15、基）及環(huán)境條件（光照、溫度）下，研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。外植體：用于植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段），植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。突變體：細(xì)胞本身發(fā)生遺傳變異或應(yīng)用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細(xì)胞。植物細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基及其組成：培養(yǎng)基實(shí)際上是植物離體器官、組織或細(xì)胞等的“無菌土壤”，其特點(diǎn)是營養(yǎng)成分的可調(diào)控性。培養(yǎng)基的種類很多，但通常都含有無機(jī)鹽、碳源、有機(jī)氮源、植物生長素、維生素等化學(xué)成分。應(yīng)用最廣泛的是MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法：植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法有很多，但固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)相互配合仍是細(xì)胞培養(yǎng)的

16、常規(guī)操作。在植物組織培養(yǎng)過程中，影響植物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累計(jì)的因素有：（1）生物條件：如外植體、季節(jié)、休眠等（2) 物理?xiàng)l件：如溫度、光、通氣等（3）化學(xué)條件：如無機(jī)鹽、碳源、維生素等（4）工業(yè)培養(yǎng)條件：如培養(yǎng)罐類型、通氣等誘導(dǎo)子：指在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進(jìn)攻的某些次級代謝產(chǎn)物。植物抗毒素（phytoalexins）是指在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對抗微生物進(jìn)攻的某些次級代謝產(chǎn)物（根據(jù)其功能又稱為“后感染防御物質(zhì)”）。在有些情況下代謝產(chǎn)物可能會連續(xù)合成，但在另外一些情況下只有細(xì)胞被刺激時(shí)才能產(chǎn)生植物抗毒素，或僅在被誘導(dǎo)時(shí)其產(chǎn)量才能增加。生物轉(zhuǎn)化：指利用生物離體培養(yǎng)細(xì)胞或器官及細(xì)胞器等對外源化合物

17、進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價(jià)值的生理生化反應(yīng)。誘導(dǎo)子的分類有兩種 一種是根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外形成而將其分為內(nèi)源性誘導(dǎo)子和外源性誘導(dǎo)子;另一種是根據(jù)其來源分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。酶工程（Enzyme Engineering）是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合發(fā)展而形成一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。微生物具備如下優(yōu)勢： 微生物繁殖速度快：細(xì)菌在合適的條件下2030min就可以繁殖一代，其生長速度為農(nóng)作物的500倍，為家畜的l000倍。 微生物種類繁多，酶的品種全 微生物培養(yǎng)方法簡單 利用微生物可以生產(chǎn)一些極端酶 固定化酶：

18、指限制或固定于特定空間位置的酶。具體是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結(jié)合在菌體（死細(xì)胞）或細(xì)胞碎片上的酶或酶系。固定化酶的特點(diǎn)：（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應(yīng)后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化;（3）反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。酶和細(xì)胞固定化方法：1）載體結(jié)合法(依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。2)將酶結(jié)合于不溶性載體上的固定化方法。A、物理吸附法 B、離子結(jié)合法C、共價(jià)結(jié)合法 固定化細(xì)胞的特點(diǎn)：（1）無需進(jìn)行酶的分離純化；（2）細(xì)胞保持酶的原始狀態(tài)，固定化過程中酶的回收率高；（3）細(xì)胞內(nèi)酶比固定化酶的穩(wěn)定性高；（4）細(xì)胞內(nèi)