基于納米材料和環(huán)糊精的新型DNA電化學生物傳感器的研究_圖文

1、華東師范大學博士學位論文基于納米材料和環(huán)糊精的新型DNA電化學生物傳感器的研究 姓名:常竹申請學位級別:博士專業(yè):分析化學指導教師:何品剛;方禹之20080501學位論文獨創(chuàng)性聲明本人所呈交的學位論文是我在導師的指導下進行的研究工作及取得的研究成 果.據(jù)我所知,除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外,本論文不包含其他個人已經(jīng)發(fā)表或撰 寫過的研究成果.對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體,均已在文中作了明確說 明并表示謝意.作者簽名:!量笪 日期:學位論文授權(quán)使用聲明.嘏.蔓.本人完全了解華東師范大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定,學 校有權(quán)保留學位論文并向國家主管部門或其指定機構(gòu)送交論文的電 子版和紙質(zhì)版。

2、有權(quán)將學位論文用于非贏利目的的少量復制并允許論 文進入學校圖書館被查閱。有權(quán)將學位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進 行檢索。有權(quán)將學位論文的標題和摘要匯編出版.保密的學位論文在 解密后適用本規(guī)定。學位論文作者簽名:l第竹 導師簽名:日期:遜:塑坼哆摘要基于納米材料和環(huán)糊精的新型DNA電化學生物傳感器的研究摘要隨著基因的結(jié)構(gòu)與功能的研究不斷深入,特別是人類基因組計劃(HGP的發(fā) 展,基因的分離及分析檢測在衛(wèi)生防疫、醫(yī)學診斷、藥物研究、環(huán)境科學及生物 工程等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。許多新的生物技術(shù)的開發(fā),為發(fā)展高靈敏 度、高特異性的生物分析檢測方法注入了活力,其中利用DNA分子間的特異性 互補配對規(guī)

3、律發(fā)展起來的各種DNA生物傳感技術(shù),引起了國內(nèi)外生物分析工作 者的廣泛關(guān)注。電化學DNA檢測方法以其靈敏度高、輕巧便宜、攜帶方便、耗 能少、能與現(xiàn)代微電子技術(shù)聯(lián)用,易于實現(xiàn)微型化等優(yōu)點,受到了研究者們的廣 泛關(guān)注,儼然成為當今生物學、醫(yī)學領(lǐng)域的前沿性課題。納米技術(shù)的出現(xiàn)為納米材料在分析化學領(lǐng)域的發(fā)展和應用開辟了新的思路。 納米顆粒的比表面積大、表面反應活性高、催化效率高、吸附能力強等優(yōu)異性質(zhì), 在催化、光吸收、生物醫(yī)藥、磁介質(zhì)及新材料等方面得到了廣泛的應用,為生物 醫(yī)學研究提供了新的研究途徑,同時也推動了化學和生物傳感器的迅速發(fā)展。納 米粒子的獨特性質(zhì)與生物分子雜交反應和電化學檢測方法相結(jié)合,

4、使其應用范圍 更加廣闊(例如:納米生物電子。納米粒子生物分子連接可能用于DNA疾病的診 斷,并且對生物分析化學產(chǎn)生巨大的影響。超分子化學是基于分子間的非共價鍵相互作用而形成的分子聚集體化學,在 與材料科學、生命科學、信息科學、納米科學與技術(shù)學科的交叉融合中,超分子 化學已發(fā)展成為超分子科學。并成為創(chuàng)造新物質(zhì)、實現(xiàn)新功能的一種新的重要途 徑,被認為是2l世紀新概念和高技術(shù)的重要源頭之一。環(huán)糊精作為超分子化學 的重要主體化合物以其獨特的性質(zhì)而倍受關(guān)注。對它的研究也逐漸從主客體識別 形成包合物的機理轉(zhuǎn)移到對其在分析化學、醫(yī)藥、環(huán)境保護和傳感器等領(lǐng)域的應 用研究中。本論文的主要創(chuàng)新之處就是將納米技術(shù)、

5、層層組裝技術(shù)、超分子包合作用 等與電化學分析技術(shù)相結(jié)合用于核酸分子雜交或凝血酶蛋白的分析檢測,研制具摘要有高靈敏度高選擇性的新型電化學生物傳感器,成功地應用于對特定序列DNA 片斷的選擇性測定和對DNA鏈中的堿基尤其是單個堿基突變的快速、靈敏和準 確的識別,為基因的快速分析測定提供了一種簡便、快捷、廉價的檢測裝置。第一章緒論首先系統(tǒng)介紹了DNA生物傳感器及其研究進展。介紹了DNA生物傳感器 的原理(包括DNA探針及其分子識別原理和DNA在固體基質(zhì)表面的固定化和 分類(包括電化學DNA生物傳感器,壓電DNA生物傳感器及光學DNA生物傳 感器,其中著重介紹了電化學DNA生物傳感器的原理和研究進展,

6、敘述了DNA 電化學傳感器在基因檢測等方面的應用,對今后的發(fā)展方向和趨勢進行了展望。接著介紹了納米材料在生物傳感器中的一系列應用。最后闡述了本論文的目的和 ,意義,指出論文的創(chuàng)新之處及主要研究內(nèi)容。第二章基于納米顆粒Si02包裹Ru(bpy2+標記的DNA電致化學發(fā)光生物傳感 器研究首次以Si02包裹Ru(bpy32+標記DNA分子,制備成高效的電致化學發(fā)光探 針,實現(xiàn)對目標DNA的高靈敏度特異性識別。我們合成了Si02包裹RuCoPY32+核殼式納米顆粒,以此作為新型的ECL標記物。利用一個納米顆粒中可包裹多 個RuCopy32+分子來達到放大ECL信號的目的,為分析檢測更高的靈敏度。根據(jù)

7、DNA的堿基互補配對原則、核酸適配體對蛋白質(zhì)的特異性識別能力,采用 Ru(bpy32+-Si02納米顆粒作為標記物設計ECL生物傳感器,希望能將ECL方法、 納米顆粒帶來的高靈敏度與生物識別的高特異性進行有機的結(jié)合,實現(xiàn)對DNA 序列以及蛋白質(zhì)進行高靈敏、高特異性的研究分析。第三章基于鈀納米粒子/碳納米管增強的DNA電化學生物傳感器研究首次將鈀納米顆粒與羧基化碳納米管結(jié)合用于DNA生物傳感器的研究,借 助鈀的良好催化活性和碳納米管的較大的比表面積、極強的導電性等實現(xiàn)超靈敏 的DNA檢測。合成了直徑為34衄的鈀d納米粒子,將其與末端羧基化的 多壁碳納米管(COOH.MWCNT結(jié)合,制得靈敏度增強

8、的電化學DNA生物傳感2摘要器。首先將一定量的Nation、COOHm研CNT及Pd納米粒子的混合液涂在玻碳 電極(GCE表面,制得MWCNT/Pd修飾電極,對該電極進行了電化學特性的研 究。然后通過5端氨基修飾的寡聚核苷酸(5-NH2-DNA與碳納米管末端的羧基 (一COOH之間形成酰胺鍵而將ssDNA固定在MWCNT/Pd修飾電極上。與目標 DNA雜交后;以亞甲基藍m為電化學雜交指示劑,實現(xiàn)對互補序列、非互補 序列的識別和電化學測定。在亞甲基藍的電化學反應中,由于碳納米管具有很好 的電子傳遞能力同時Pd納米粒子具有很好的催化活性,可以使電化學DNA生 物傳感器的靈敏度大大提高。對目標DNA

9、的檢測下限可以達到1.2x10-13M。第四章基于層層組裝技術(shù)實現(xiàn)DNA放大檢測的電化學生物傳感器研究將層層組裝技術(shù)用于金納米顆粒標記的DNA生物傳感器的研究中,通過電 極表面的多次電荷翻轉(zhuǎn)達到富集大量的目標DNA分子的目的,以此獲得放大的 DNA雜交信息。本文介紹了聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA分子與DNA經(jīng) 過層層組裝(1ayer-by-layer,LBL的方法,以DNA探針分子上標記的金納米顆粒 為電化學檢測手段,實現(xiàn)對目標DNA雜交信號的放大。運用交流阻抗技術(shù)(EIS 和紫外吸收光譜法0w塒對LBL的過程進行研究,實驗結(jié)果表明多層膜能夠均 勻規(guī)則地組裝在聚吡咯口P奶修飾的電極表面,

10、并通過層層組裝將雜交信號放大。 在優(yōu)化條件條件下,組裝層為6層時,其檢測限達到3.20×10。14M,該方法具有 高靈敏度和特異性。通過采用干擾序列消除非特異性吸附,這種傳感器表現(xiàn)出良 好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。第五章基于盧環(huán)糊精主客體識別作用的DNA電化學生物傳感器研究首次將主客體識別作用應用于DNA生物傳感器的研究中,以伊環(huán)糊精對客 體分子間甲基苯甲酸(mTA的高效識別性成功地實現(xiàn)了對DNA分子的檢測。將 .環(huán)糊精采用電化學方法聚合在氮乙?；桨沸揎椀牟Ｌ茧姌O表面,以raTA作 為客體分子標記于5端氨基修飾寡聚核苷酸片段上,通過電化學交流阻抗對. 環(huán)糊精修飾電極捕獲raTA標記的DNA

11、進行了表征。其結(jié)果顯示出該電極對mTA 標記的DNA探針分子具有很強的包絡作用,能夠通過主客體的識別將ssDNA和 dsDNA捕獲到電極表面。分別采用金納米顆粒標記探針和以亞甲基蘭為雜交指摘要示劑對目標DNA檢測,均能通過主客體識別的方法獲得良好的檢測限。研究表 明,戶環(huán)糊精修飾電極具有優(yōu)良的再生性,可重復多次用于DNA的雜交檢測。第六章基于金納米顆粒聚集體富集亞甲基蘭的DNA與蛋白質(zhì)的電化學生物傳 感器的研究首次采用金納米顆粒標記特定序列的寡聚核苷酸片段,設計了即可用于 DNA檢測又能實現(xiàn)對特殊蛋白質(zhì)放大檢測的研究方法。采用特殊設計的兩段寡 聚核苷酸片段,其一端均以金納米顆粒標記,另外一端均

12、為含有一段可以與凝血 酶蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合的核酸適配體(適體片段。當與目標分子(DNA或凝血酶 蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合作用時,該探針能與目標分子形成含有多個金納米顆粒聚 集體,將金納米顆粒聚集體自組裝在硫代三聚氫酸修飾的金電極表面,通過探針 上的鳥嘌呤富集MB分子,實現(xiàn)對目標物的檢測。探針上識別凝血酶的寡聚核苷 酸片段含有多個鳥嘌呤堿基,它能與MB有很強的結(jié)合作用,因此富含鳥嘌呤的 探針能夠富集大量的MB分子在納米顆粒聚集體上,同時,由于金納米顆粒聚集 體能加速MB氧化還原反應過程的電子傳遞,使得MB的氧化還原反應更容易進 行,因此,對目標物的檢測具有非常高的靈敏度。關(guān)鍵詞:納米材料,p.環(huán)糊精,

13、層層組裝,DNA雜交,凝血酶,電化學檢測 4Study on the novel DNA electrochemical biosensors based on nanomateirals and cyclodextrinAbstractWith improvedunderstanding of structure and function of human gene,and the development of the Human Genome Project,DNA separation and analysis has taken a more and more important ro

14、le in the areas of clinical diagnosis,medicine,epidemic prevention,env'tronmental protection and bioengineering.Wride-scale genetic testing requiresthe development easy-to-use,fast,inexpensive,miniaturized devices.Many new biological technologies emerged and found their applications in this fiel

15、d.Among them,DNA biosensors are rapidly developed and have received considerable attentions.Electrochemical DNA detection is a novel and developing technique that combining biochemical,electrochemical,medical and electronic techniques with the advantages of being simple,reliable,cheap,sensitive and

16、selective for genetic detection,and has been a hot topic in the field of biochemistry and medicine.The emergence of nanotechnology is opening new horizons for the application of nanoparticles in analytical chemistry.In particular,nanoparticles are of considerable interest in the world of nanoscience

17、 owing to their unique physical and chemical properties.With these unique properties,they are widely used in the fields of catalysis, optical absorption,medicine,magnetic medium,new materials synthesis.Such properties offer excellent prospects forchemical and biological sensing.The power and scope o

18、f such nanoparticles call be greatly enhanced by coupling them with biological recognition reactionsand electrical processes(i.e.nanobioelectronics. Nanoparticle-biopolymer conjugates offer great potential for DNA diagnostics.Supramolecular chemistry has been defined as thechemistry of molecular ass

19、emblies and of the intermolecular bond”.Combing with the material science, biological science,information technology and nanometer technology,it has been the supramolecular science and has been employed as a vital method to design,and prepare new materials and obtain novel properties.Therefore,supra

20、molecular chemistry is believed to be the base of new concept and technology in the 21st century. 5AbstractCyclodextrin(CD,as the most important h0甌have received considerable attention because of its particular characterization,and the studies on the host-guest interaction based on CD had been trans

21、ferred from the processes and mechanism of inclusion complex between a pair of host and guest to the application in the fields such嬲 analysis,medicine,environment protection and sensors.The goal of the present study is to design and optimize new DNA hybridization techniques with hi曲sensitivity and s

22、electivity.This dissertation focuses on fabricating novel electrochemical DNA biosensors based on eletrochemical analysis technique,combining nanomaterials,layer-bylayer technology and supramolecular inclusion interaction,thus developing a sensitive,sequencespecific and quantifiable gene detection m

23、ethod,and establishing the bases,especially one base mutation,then for application of electrochemical DNA biosensor to clinic diagnose.Chapter 1:PrefaceFirstly,we introduce the progress of DNA biosensor,including its principle(probe identification principle and immobilization method of ssDNA on soli

24、d supportand its classification(electrochemical DNA biosensor, optical DNA biosensor and piezoelectric DNA biosensor.Among these,we emphatically review the principle, progress,the application and development trends of electrochemical DNA biosensors. Second,the application of nano-materials on biosen

25、sors Was introduced.At last,we pointed out the purpose and significance ofthe dissertation.Chapter 2:The preparation of Ru(bpy32+一doped nanoparticle and its application in dectrogenerated chemiluminescence detection DNA hybridization analysis A sensitive electrogenerated chemiluminescence(ECLdetecti

26、on of DNA hybridization,based on tris(2,2-bipyridylruthenium(ID-doped silica nanoparticles (Ru(bpy3z+-doped SNPs勰DNA tags,is described.In this protocol, Ru(bpy32+-doped SNPs was used for DNA labeling with trimethoxysilyIpropy diethylenetriamineETAand glutaraldehyde as linking agents.The6Ru(bpy32+-do

27、ped SNPs labeled DNA probe was hybridized with target DNA immobilized on the surface of PPy modified Pt electrode.The hybridization events were evaluated by ECL measurements and only the complementary sequence could form a double-stranded DNA(dsDNAwith DNA probe and give strong ECL signals. A three-

28、base mismatch sequence and a noncomplementary sequence had almost negligible responses.Due to the large number of Ru(bpy32+molecules inside SNPs, the assay allows detection at levels as low as 1.0x l 0-13tool r1of the targetDNA.The intensity of ECL was linearly related to the concentration of the co

29、mplementary sequence in the range of 2.0x l 0132.Ox l 0-9tool r1.Chapter 3:Electrochemical DNA biosensors based on palladium nanoparticles combined with carbon nanotubesPalladium nanoparticles,in combination with multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs,were used to fabricate a sensitivityenhanced elect

30、rochemical DNA biosensor.MWCNTs and palladium nanoparticles were dispersed in Nation,which were used to modify a glassy carbon electrode(GCE.Oligonucleotides with amino groups at the5end were covalently linked onto carboxylic groups of MWCNTs on the electrode.The hybridization events were monitored

31、by differential pulse voltammetry(DPVmeasurement using methylene bluem嬲an indicator.Due to the ability of carbon nanotubes to promote electron-transfer and the hi班catalytic activities of palladium nanoparticles for electrochemical reaction of methylene blue, the sensitivity of presented electrochemi

32、cal DNA biosensors Was remarkably improved.The detection limit of the method for target DNA Was 1.2x l 0一13M.Chapter 4:Multilayer membranes via layer-by-Layer deposition of PDDA and DNA with Au nanoparticles as tags for DNA biosensingA novel Au nanoparticles(Au-NPs-based protocol for DNA hybridizati

33、on detection based on assembly of alternating DNA and poly(dimethyldiallylammonium chloride(PDDAmultilayer flh=ns by layerby-layer(LBLelectrostatic adsorption has been studied.Electrochemical impedance spectroscopy(EISand UVvis 7absorl:arlce measurements were used to study the fill assembly.All the

34、results indicate that the uniform multilayer cail be obtained Oll the polypyrrole(PPycoated electrode surface and the hybridization reaction carl be amplified by the layer-by-layer progress.The hybridizationWas detected the reducfive signal of Au-NPs by direct electrochemical method and nonspecific

35、adsorption Was greatly eliminated by all irrelated DNA sequence to the target DNA.Under optimum conditions,a significant sensitivityenhancement had been obtained,and the detection limit Was down to 3.20 X 1014M when 6layers assembled.The DNA biosensor has good stability and reproducibility.Chapter 5

36、:Electrochemical detection of DNA sequence with hostguest recognition on p-cyclodextrin modified electrodeThe electrochemical sensing of DNA is accomplished farstly by the host-guest recognition system according to the very strong inclusion between3-Cyclodextrin (pCD and m-toluic acid(mTA. 13-CD, as

37、 the host molecular,Was electropolymorized on the poly(Nacetylanilinemodified glassy carbon electrode by potential sweeping,and raTA,as the guest,Was labled on the oligonucleotides with amino groups at the 5end.The inclusion between 13-CD modified electrode and mTA labeled DNA Was investigated by CV

38、 and EIS,which tamed out a strong incision interaction between them.Based on the hostguest recognition,introducing Au nanopaticles as tagsand MB as indicator to detect DNA hybridization,respectively, has excellent detection limit and reproducibility.Chapter 6:Bifunctional biosensor based on aggregat

39、ion methyleneblue by crosslinked Au nanoparticles and the functionalized aptamer segmentsWe report here on the construction of a biosensor call detect thrombin or DNA molecules by two functional aptamer segments,which will form Au-NPs/analyte aggregation by adding the analytes,and the redox indicato

40、r,MB,that is used to interact specifically with the guanine bases on the aptamer segments.Hybridization for DNA or incubation for thrombin not only result in the binding multi-Au-NPs 8labeled probe to the analyte for formation of an extended polymericnetwork,but alsoin aggregation abundant MB molecu

41、les Oil the aptamer segments whichcall governthe signals for theanalytes.The novel bifunctional apatmer-based biosensing capability is coupled to the enormous amplification feature of the activation for MB through the Au-NPs conductive matrix to yield remarkably low(fmoledetection limitsKey words:na

42、nomaterials,D-cyclodextrin,layer-by.1ayer,DNA hybridization, thrombin,electrochemical detection9第一章緒論1引言第一章緒論人們回顧過去20世紀一百年中所取得的輝煌成就時,最激動人心的偉大創(chuàng) 舉之一就是和“曼哈頓的原子彈計劃"、“阿波羅人類登月計劃”一起被譽為本世 紀科學史上三個里程碑的“人類基因組計劃(Human Genome Project,HGP這 項人類生命科學史上最偉大工程。2000年6月26日是人類科技史上一個令人難 忘的日子,參加人類基因組計劃研究者,美國、英國、法國、德國、日

43、本和中國 科學家同時向世界宣布人類基因組工作草圖已基本完成,已給制出人體97%的基 因組,基中85%的基因組序列得到了精確測定,包含了人體約30億個堿基對的 正確排序。這一重大成就立刻受到全世界的矚目,各國均給予了高度評價,它對 人類認識自身,提高健康水平,推動生命科學、醫(yī)學、生物技術(shù)、制藥業(yè)、農(nóng)業(yè) 等的發(fā)展具有極其重要的意義,人類基因組工作草圖的完成是該計劃實施的一個 里程碑,標志著人類在研究自身的過程中邁出其關(guān)鍵的一步。有人將此成就與伽 利略的天文發(fā)現(xiàn)相媲美,有人認為它的意義遠遠大于抗生素的發(fā)明。那么究竟什么是使人們?nèi)绱酥匾暤腍GP呢?我們知道所有生物的遺傳物質(zhì)是DNA,它的總和就是基因組

44、,就人類基因 組而言,指合成有功能的人體各類細胞中蛋白質(zhì)及或多肽鏈和RNA所必須的全 部DNA順序和結(jié)構(gòu),人體遺傳物質(zhì)總和就是人類基因組,由大約30億堿基對 組成,分布在細胞核的23對染色體中。人類基因組計劃是測定人類基因組的全 部DNA序列,從而解讀所有遺傳密碼,揭示生命的所有奧秘。2002年2月12日,歷時10載耗資20億美元的人類基因組計劃最終完成, 并報道了99%的人類基因組序列。世紀初基本完成的這項工作堪與阿姆斯特朗 和奧爾德林乘坐阿波羅11號宇宙飛船登月相媲美。從這時起,生物學被重新劃 分為前基因組和后基因組兩部分,我們正生活在后基因組時代。它以揭示基因組 的功能及調(diào)控機制為目標,

45、其核心科學問題主要包括:基因組的多樣性,基因組 的表達調(diào)控與蛋白產(chǎn)物的功能,以及模式生物基因組研究等。它的研究將為人們 深入理解人類基因組遺傳語言的邏輯構(gòu)架,基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,個體發(fā)育、 生長、衰老和死亡機理,神經(jīng)活動和腦功能表現(xiàn)機理,細胞增殖,分化和凋亡機 10第一章緒論理,信息傳遞和作用機理,疾病發(fā)生、發(fā)展的基因及基因后(如病機理、病理過 程機理以及各種生命科學問題提供共同的科學基礎(chǔ)。功能基因組研究成果不僅 具有巨大的科學意義,而且有著十分光明、廣泛的應用前景。在醫(yī)療衛(wèi)生方面, 研究成果可用于醫(yī)藥的發(fā)現(xiàn)和開發(fā);致病基因或疾病易感基因的鑒定和克隆,可 用于全新原理的診斷、治療和預防方法的

46、設計;醫(yī)生將能夠根據(jù)患者的個人遺傳 構(gòu)成,進行更加個人化的藥物療法;科學家們在人體器官和組織“重造以及修 復方面將取得巨大進步;以基因組成果為基礎(chǔ)的基因組工業(yè),將帶動一批高新技 術(shù)產(chǎn)業(yè)向新的領(lǐng)域開拓。在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)方面,可用新的方式對動植物疾病進行 診斷和處治,改善它們的品質(zhì),提高產(chǎn)量,在紡織業(yè),廢物控制和環(huán)境治理整頓, 都將發(fā)揮重要作用?；蚪M(genome是德國遺傳學家H.Wmkler在1920年將基因(gene和染色體 (chromosome兩個詞縮合而創(chuàng)造的一個新詞,意思是指染色體上的全部基因。幾 十年來,隨著分子生物學的發(fā)展,其含義擴展為在個體水平代表一個個體所有遺 傳性狀的總和,在

47、細胞水平代表一個細胞所有不同染色體(單倍體的總和,在分 子水平代表一個物種所有DNA分子的總和。DNA作為遺傳信息的載體,具有儲存和傳遞信息的功能,絕大多數(shù)生物體 的遺傳信息儲存在DNA分子中,DNA的復制構(gòu)成了遺傳分子基礎(chǔ)。DNA分子 是由兩條脫氧核糖核酸鏈組成具有復雜三維結(jié)構(gòu)的大分子化合物。構(gòu)成DNA的 基本單元是脫氧核糖、核苷酸和磷酸。核苷酸的堿基有四種:腺嘌呤A(adenine、 鳥嘌呤G(guanine、胸腺嘧啶T(thymine、胞嘧啶C(cytosine。核苷酸通過3,5一 磷酸二酯鍵連接而形成沒有支鏈的直線形或環(huán)狀結(jié)構(gòu),DNA分子中核苷酸的排 列順序成為DNA的一級結(jié)構(gòu)。DNA

48、的二級結(jié)構(gòu)一般指DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu), 即Waston-Criek模型,是1953年3月由Waston和Crick提出的【1】。DNA分子 是由兩條脫氧核糖核酸鏈組成,鏈的內(nèi)側(cè)是堿基,兩條鏈以平行方向盤繞同一條 軸形成右旋的雙螺旋結(jié)構(gòu),兩條鏈上的堿基是匹配的(Hp G與C,A與T互補配 對,稱為堿基互補(Figure 1。腺嘌呤和胸腺嘧啶以兩個氫鍵連接,鳥嘌呤和胞 嘧啶以三個氫鍵連接,在DNA分子中互補堿基的含量相等。在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ) 上,DNA分子還可以扭曲或卷曲形成超螺旋三級結(jié)構(gòu)。隨著基因結(jié)構(gòu)與基因功能研究的不斷深入,特別是“人類基因組項目”的快速進展(至今,剝?nèi)祟惢蚪M30億堿基對的“

49、人類基因組”草圖已繪制完成. 已迅速推動人類疾病的DNA診斷及基因治療的研究,大大加快了醫(yī)學基因鑒定。 發(fā)現(xiàn)及鑒定了大量致病基園,由于基因DNA分子序列中微小改變.導致基因突 變及多志性.如一個或幾個核苷酸的取代、缺失或插入DNA序列.就會導致遺 傳性狀的改變或各種疾病的出現(xiàn)。因此,通過對人體的血液、組織、體液等樣品 uJ特定DNA序列的測定,可用來確定感染疾病的根源。通過檢測與疾病有關(guān)的 基崮變異,將對基因篩選、藥物的研制與開發(fā)、食品及環(huán)境污染的控制和在分子 水平上對遺傳疾病進行診斷和治療產(chǎn)生十分深遠的意義。DNA片段巾核苷酸堿基的特定序列決定了基因的遺傳特性,因此。DNA序 列分析是揭開遺

50、傳密碼的關(guān)鍵,是遺傳工程中首先要解決的問題之一2.31。人 類許多遺傳疾病的早期診斷是通過檢測已知堿基序列的DNA是否出現(xiàn)變異來實 現(xiàn)的,這些疾病中,DNA變異的復雜程度各不相同41。例如,p一珠蛋白基因的 點突變中,一個胸腺嘧啶被腺嘌呤替代,從而引起氨基酸替代.導致鐮刀狀紅血 球貧血癥f51。70%的囊性纖維變性病人和攜帶者與轉(zhuǎn)移膜控制蛋白質(zhì)基因編碼中 的一種三堿基殘缺有關(guān)6】。亨廷頓癥是因為正常的基因插入了重復的多堿基單 元而引起的7】。因此.對人體的血液、組織及體拔等樣品中所含的特定DNA序第一章緒論列的測定結(jié)果,可用于確證感染疾病的細菌和病毒根源。檢測與疾病有關(guān)的變異 對基因篩選、遺傳

51、疾病的早期診斷和治療具有十分深遠的意義。DNA測序一般采用直接測序和雜交檢測兩種方法。雜交法因其簡單、易行 而被廣泛采用。用一段已知序列的單鏈DNA(ssDNA探針(一般為2040個堿基 的天然核苷酸片段或人工合成的寡聚核苷酸片段與未知序列的ssDNA(目標 DNA進行雜交,只有與探針序列完全互補的ssDNA才能與其雜交形成穩(wěn)定的雙 鏈DNA(dsDNA結(jié)構(gòu)。通過一定的方法來指示雙鏈結(jié)構(gòu)的形成,就可以推斷目 標DNA的序列特征。在核酸分子雜交分析中,傳統(tǒng)的對DNA序列的測定一般采用凝膠電泳法。 該方法需要經(jīng)過放射性標記、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR

52、、 電泳等一系列操作過程,消耗時間長,勞動強度大。在這種情況下,以Watson Crick堿基互補配對原則(即A與T,G與C形成堿基對為基礎(chǔ)的DNA生物傳感 器應運而生,為分子生物學研究提供了全新的基因檢測技術(shù),并很快成為一個研 究熱點。目前大多數(shù)DNA生物傳感器都是建立在DNA分子雜交基礎(chǔ)上的。一 些非放射性的新的標記方法如熒光法【8.10】、化學發(fā)光法【11.13】、電化學法 14.20等取代了傳統(tǒng)的放射性同位素標記法,這些檢測方法與DNA分子雜交 技術(shù)相結(jié)合,組成各種類型的DNA生物傳感器。DNA生物傳感器既免去了放射 性標記的危險性,又節(jié)省了電泳操作花費的長時間,具有操作簡便、快速靈敏

53、、 選擇性好、無污染等特點,并具有分子識別、分離純化基因等功能。因此;近年 來受到了國內(nèi)外科技工作者的廣泛重視,已成為基因研究中最具有吸引力的前沿 課題之-2126。目前,許多研究組正在致力于研制高靈敏度、便攜式、快速的DNA檢測器, 以適應生命科學研究和臨床診斷領(lǐng)域的需要。美國加州理工學院的F.Kayyem對 當前DNA檢測器在診斷領(lǐng)域的現(xiàn)狀作了分析,認為:目前的工業(yè)技術(shù)能夠制造 高準確度的DNA檢測器,快速的DNA檢測器,簡便的DNA檢測器和價廉的 DNA檢測器,但是,卻未能研制集這些優(yōu)點于一身的快速、準確、簡便、價廉 的DNA檢測器。許多專家認為:最有希望實現(xiàn)這一目標的是DNA生物傳感器

54、。 DNA生物傳感器是分子生物學與微電子學、電化學、光學等相結(jié)合的產(chǎn)物,它 在生命科學與信息科學之間架起了一道橋梁,成為DNA信息分析檢測最重要的技術(shù)之一。DNA生物傳感器乃至基因芯片的出現(xiàn)使對目標DNA的測量時間大大 縮短,操作簡單、便捷,無污染,既可定性,又可定量,且靈敏度高、選擇性好, 顯示出十分誘人的發(fā)展前景。美國新墨西哥州立大學的J.Wang正將測定血液中 鉛含量的手提式傳感器改進成為檢測DNA的傳感器。法國國家科學研究中心的 F.Gamier、以色列國家重點實驗室的Willner、加拿大Waterloo大學的S.& Mikkelsen、日本Kyushu大學的S.Takena

55、ka及德國Ulm大學的P.Bauerle等都在 致力發(fā)展具有創(chuàng)新意義的DNA傳感器。目前,采用生物傳感器測定DNA序列 的研究已形成熱點,吸引一批各國專家和學者投入這一領(lǐng)域27】。緒論部分將系統(tǒng)介紹DNA生物傳感器的基本原理及其分類,簡單介紹DNA 壓電和DNA光學生物傳感器的工作原理和特點,著重介紹DNA電化學生物傳 感器的研究進展。敘述DNA的各種電化學分析方法,以及DNA.電化學傳感器 的設計(包括DNA片段的固定方法以及雜交信號的電化學轉(zhuǎn)化、在基因檢測方 面的應用、優(yōu)缺點和今后的發(fā)展趨勢。隨后介紹納米材料在DNA生物傳感器中 的應用。由于DNA生物傳感器和基因芯片的使用還處在一個早期階

56、段,這種方 式(裝置預計將對今后的DNA(基因診斷產(chǎn)生巨大的影響。2DNA生物傳感器的基本原理及分類DNA生物傳感器是一種能將目的DNA的存在轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測的電、光、聲等 信號的傳感裝置。DNA生物傳感器和其它的生物傳感器一樣,其基本組成包含 有兩部分28.30】,即分子識別元件(DNA和換能器。識別器件主要用來感知樣 品中是否含有(或含有多少待測物質(zhì),轉(zhuǎn)換器件則將識別器件感知的信號轉(zhuǎn)化為 可以觀察記錄的信號(如電流大小、頻率變化、熒光強度和吸收光強度等。在待 測物、識別器件以及轉(zhuǎn)化器件之間由一些生物、化學、生化作用或物理作用過程 彼此聯(lián)系。其設計原理是在敏感元件上固定一條含有十幾到上千個核苷酸

57、的單鏈 DNA(ssDNA,在一定的條件下(包括適當?shù)臏囟?一定的pH值和離子強度等, 通過DNA分子雜交,對另一條含有互補堿基序列的DNA進行識別,結(jié)合成雙 鏈DNA(dsDNA。雜交反應在敏感元件上直接完成,換能器能將雜交后所產(chǎn)生 的變化轉(zhuǎn)變成電信號。根據(jù)雜交前后電信號的變化量,推斷出被檢測的DNA量。142.1DNA探針分子識別原理一段長度為17個堿基的寡聚核苷酸(DNA探針,芭人類全基因30億堿基對中 只存在一個與之完全互補的序列,這樣的特異性可以說是最高的生物選擇性。各 種生物的核酸,序列相同的幾率很小,所以用DNA分子雜交的技術(shù)作為DNA 生物傳感器的識別原理,在理論上講是有很大發(fā)

58、展前景的。DNA生物傳感器中 的識別分子大部分是采用化學合成而得到的單鏈DNA(ssDNA探針,其通過直接 吸附或5端經(jīng)過巰基、氨基或生物素等偶聯(lián)基團與傳感器探頭表面進行特定的結(jié) 合。雜交時,固定的探針與其互補序列(目標DNA之間通過Waston-Cfick氫鍵形 成雙螺旋結(jié)構(gòu),由于這種雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成具有很強的選擇性,因此DNA探針 能在含有多種非互補序列的混合物中識別出靶序列,從而實現(xiàn)傳感器的特異性識 別功能。生物傳感器中的生物元素不僅要具有特異性地識別生物分子的功能,同時還 必須能產(chǎn)生可供換能器靈敏地檢測到的物理、化學變化的信號。DNA探針與目 標DNA雜交后,形成雙鏈DNA(dsDNA,其信號可通過壓電晶體的頻率或SPR 折射率的改變而直接檢測。但在大多數(shù)情況下,形成雙鏈DNA本身表現(xiàn)的物理 信號(如光、電等信號的改變是比較弱的,因此還必須在DNA分子中加入一定 的雜交指示劑進行信號轉(zhuǎn)換與放大,把雜交后的DNA含量通過換能器表達出來。 雜交指示劑是一類能與單鏈DNA和雙鏈DNA以不同方式相互結(jié)合的物 質(zhì)。雜交指示劑與DNA分子的結(jié)合部位有三種模式:I.雜交指示劑與DNA分 子雙螺旋的堿基對之間的大溝槽相互作用而結(jié)合,產(chǎn)生嵌入作用;2.雜交指示 劑與DNA分子雙螺旋的堿基對之間的小溝槽相互作用而結(jié)合,產(chǎn)生粘合作用; 3.雜交指示劑與DNA分子的帶負電荷的磷酸骨架之間的靜電