實(shí)驗(yàn)五 人類(lèi)染色體標(biāo)本制備

1、實(shí)驗(yàn)五人類(lèi)染色體標(biāo)本制備【目的要求】1熟悉人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的原理。2初步掌握人類(lèi)外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備方法。3了解正常人非顯帶染色體核型特征及核型分析方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】人類(lèi)間期細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)染色質(zhì)，在細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí)，經(jīng)逐級(jí)螺旋形成染色體。在分裂期的中期，染色體達(dá)到最大程度的凝集，表現(xiàn)為短而粗的典型結(jié)構(gòu)。人外周血的有形成分中，只有白細(xì)胞有核，而白細(xì)胞中只有淋巴細(xì)胞(主要是小淋巴細(xì)胞)具有潛在的細(xì)胞分裂能力。培養(yǎng)液中加入有絲分裂刺激劑植物血凝素(PHA)可使處于G0期、具有潛在分裂能力的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有分裂能力的淋巴母細(xì)胞，并進(jìn)入旺盛的有絲分裂周期；加入紡錘體抑制劑秋水仙素可使

2、處于分裂過(guò)程的淋巴細(xì)胞停滯在分裂中期，在收獲細(xì)胞時(shí)，用低滲劑0.075 mol/L KCl對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低滲處理，可使胞膜脹破，染色體均勻分散；經(jīng)離心、固定、制片等過(guò)程，最終可獲得便于觀察分析的染色體標(biāo)本。制備的染色體標(biāo)本片，不經(jīng)特殊處理，直接染色，在顯微鏡下觀察識(shí)別，并進(jìn)行核型分析的過(guò)程稱(chēng)為染色體非顯帶核型分析?！緦?shí)驗(yàn)用品】(一) 材料：人外周靜脈血。(二) 器材：吸管、刻度離心管、量筒、5ml注射器、6號(hào)針頭、臺(tái)式離心機(jī)、試管架、冷藏載玻片（一端磨砂）、鉛筆、酒精燈、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴箱、載玻片、止血帶、酒精棉球、顯微鏡、廢液缸。(三)試劑1. RPMI1640培養(yǎng)液 (1) RPMI164

3、0：RPMI1640固體培養(yǎng)基10.4 g,溶于1000 ml雙蒸水中，抽濾除菌。(2) RPMI1640培養(yǎng)液：每100 ml RPMI1640培養(yǎng)液中含RPMI 1640 80 ml、滅活的小牛血清20 ml、PHA 50 mg、青霉素(終濃度100 U/ml)、鏈霉素10000 g (終濃度100 g /ml)，15磅、20min高壓滅菌的NaHCO3調(diào)pH至7.27.4，分裝20小瓶，每瓶5 ml。(3) 配制方法 配制過(guò)程所需的玻璃器具先用淺水洗刷干凈，烘干，放入清潔液中浸泡2 d，取出后用自來(lái)水沖洗15次，蒸餾水沖洗3次，雙蒸水沖洗1次，烤干后包裝，15磅20 min高壓滅菌。新瓶

4、塞等橡膠類(lèi)制品用水洗刷后，用0.5mol/L NaOH煮沸20min，自來(lái)水沖洗；用0.5mol/L HCl煮沸20 min，自來(lái)水沖洗，蒸餾水沖洗，在雙蒸水中浸泡24h；浸泡后取出晾干，包裝后高壓滅菌。使用過(guò)的橡膠制品用肥皂液洗后，再用自來(lái)水，蒸餾水、雙蒸水沖洗，晾干包裝后高壓滅菌。無(wú)菌室用紫外燈消毒2 h。進(jìn)入無(wú)菌室前用肥皂徹底洗手，雙手在新潔而滅溶液中浸泡20 min，然后穿隔離衣，戴口罩、帽子，進(jìn)入無(wú)菌室操作時(shí)，再用75酒精擦手。在無(wú)菌室內(nèi)，將RPMI l640粉劑10.4 g，溶于1000 ml雙蒸水中，(RPMI1640粉劑較難溶，可用酒精燈微火稍加熱，或通入CO2使pH降至6.0

5、左右可溶解)。液體呈透明狀說(shuō)明已完全溶解，倒入細(xì)菌濾器中過(guò)濾除菌。在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)內(nèi)，取適量已抽濾的RPMI1640加入成比例的滅活小牛血清、PHA、青霉素和鏈霉素，混勻，用經(jīng)過(guò)15磅20 min高壓滅菌的5 NaHCO3調(diào)至pH7.2，分裝成每瓶5 ml，冰凍保存。已除菌過(guò)濾、未分裝的RPMI1640也需冷凍保存。2無(wú)菌肝素（500 U/ml）：肝素注射液1支2 ml（含12500 U），加23 ml無(wú)菌生理鹽水混勻（或肝素粉劑，用時(shí)配成0.2%肝素液），經(jīng)8磅15 min高壓滅菌，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?其他試劑：0.01%秋水仙素、0.075 mol/L KCl低滲液、Carnoy固定液

6、、10% Giemsa染液?！緦?shí)驗(yàn)操作】(一) 染色體標(biāo)本制備1.取材培養(yǎng)(1) 采血：用無(wú)菌注射器吸取約0.2 ml肝素液，來(lái)回抽動(dòng)針筒，使肝素濕潤(rùn)針筒，戴上針頭套；徹底消毒采血處皮膚，抽取靜脈血約2 ml，戴上針頭套，轉(zhuǎn)動(dòng)針筒，使肝素與血液混勻，防止血液凝固（采血過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作）。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，去掉針頭套，用無(wú)菌棉球擦除針頭上的血跡；用酒精棉球消毒盛有5 ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶瓶塞，并將瓶塞在酒精燈火焰上過(guò)一下；在酒精燈火焰旁，將采血的注射器針頭經(jīng)培養(yǎng)瓶皮塞插入培養(yǎng)瓶中，每瓶接種血液約0.3 ml，輕輕搖勻。(2) 培養(yǎng)：培養(yǎng)瓶置37恒溫箱中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至68 h，取出培養(yǎng)瓶，在超凈

7、工作臺(tái)內(nèi)，用注射器(5號(hào)針頭)向培養(yǎng)瓶中加入0.01%秋水仙素1滴，輕輕搖勻，放回37恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。2氣干法制片 (1) 收集細(xì)胞：將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)物用吸管移入刻度離心管內(nèi)，離心810 min（1000 r/min），棄上清液，為防沉淀物中細(xì)胞丟失，可適當(dāng)留點(diǎn)上清液。(2) 低滲：向離心管中加6m1預(yù)溫37的0.075 mol/L KCl低滲液，用吸管向離心管底部充氣，輕輕將細(xì)胞沉淀沖散打勻，離心管放入37水浴箱中低滲處理15 min。(3) 預(yù)固定：低滲處理后，加Carnoy固定液約0.51 ml，用吸管輕輕沖打混勻，預(yù)固定；然后離心810 min(1000 r/min)，棄上清液。預(yù)固定可防止細(xì)胞在固定時(shí)集聚成塊。(4) 固定：在沉淀物中加Carnoy固定液5 m1，用吸管將沉淀物輕輕沖打均勻，室溫下靜置固定20 min，離心810 min(1000r/min)，棄上清液。固定有利于染色體在載玻片上展開(kāi)，保持染色體結(jié)構(gòu)完整；如固定不充分，則染色體形象模糊