實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌抹片的制備及染色

1、實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌抹片的制備及染色一、 提前十分鐘進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，抄寫板述。上課，點(diǎn)名入座。板述內(nèi)容：一）、目的要求1、掌握細(xì)菌抹片的制備方法2、掌握細(xì)菌的革蘭氏染色法二）、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1、每人做一張葡萄球菌的固體抹片，用美蘭染色。 2、每人做一張大腸桿菌與葡萄球菌的混合抹片，并用革蘭氏法染色。 3、油鏡觀察自制的玻片及真菌標(biāo)本片，（煙曲霉、黃曲霉、酵母菌） 4、組織抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作業(yè) 1、敘述細(xì)菌抹片的制備方法 2、敘述革蘭氏染色的方法 3、繪出細(xì)菌形態(tài)圖并注明染色方法二、 總結(jié)上次實(shí)驗(yàn)作業(yè)，有兩個突出問題。1、 多數(shù)同學(xué)畫的是書上的細(xì)菌圖，細(xì)胞臂、莢膜清晰可見，而鏡檢時只能看到細(xì)

2、菌的大致形態(tài)，如大腸桿菌是一個兩端鈍圓的桿狀輪廓，另外，鏡檢時菌毛和鞭毛是不能觀察到的，除非用特殊的染色方法。2、 有的同學(xué)沒有用圓規(guī)畫圖，圖片繪制得過大或過小。三、 實(shí)驗(yàn)第一部分：抹片的制備1、 實(shí)驗(yàn)的目的和意義細(xì)菌細(xì)胞微小，無色而半透明，原樣直接在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，只能大致見到其外貌，制成抹片和染色之后，則能較清楚地顯示其形態(tài)和特殊構(gòu)造，也可以根據(jù)不同的染色反應(yīng)，作為鑒別細(xì)菌的一種依據(jù)。2、 細(xì)菌抹片的制備進(jìn)行細(xì)菌染色之前，須先作好細(xì)菌抹片，其方法如下：（1）玻片準(zhǔn)備載玻片應(yīng)清晰透明、潔凈而無油漬，滴上水后，能均勻展開，附著性好。如有油漬，可按下列方法處理：A、滴上95%酒精2-3滴，

3、用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈火焰上輕輕拖過幾次。B、若上法仍未能去除油漬，可再滴上1-2滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕通過。（2）抹片所用材料情況不同，抹片方法亦有差異。A、液體材料（如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等）可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料，于玻片的中央均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層。B、非液體材料（如菌落、膿、糞便等）則應(yīng)先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸餾水，置于玻片中央，然后再用滅菌接種環(huán)取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。C、組織臟器材料，先用鑷子夾持局部，然后以滅菌或潔凈剪刀取一小塊，夾出后將其新鮮切面在玻片上壓積或涂抹成一薄片。如有多個樣品同時需要制成

4、抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一張玻片上有秩序地排好，作多點(diǎn)涂抹，或者先用蠟筆在玻片上劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品，需要保留標(biāo)本片，應(yīng)貼標(biāo)簽，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。（3）干燥：上述涂片，應(yīng)讓其自然干燥。（4）固定：有兩類固定方法。A、火焰固定：將干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈火焰上來回通過數(shù)次，略作加熱（但不能太熱，以不燙手背為度）進(jìn)行固定。B、化學(xué)固定：血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩染色，不用火焰固定，而應(yīng)用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2-3分鐘，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用23分鐘后，自然揮發(fā)干燥。抹片如作瑞特氏染色，則必先須

5、作特別固定，染料中含有甲醇，可以達(dá)到固定的目的。目的：將抹片固定的目的有如下幾種：除去抹片的水分，涂抹材料能很好地貼附玻片，以免水洗時易被沖掉使抹片易于著色或更好地著色，因?yàn)樗赖牡鞍踪|(zhì)比活的蛋白質(zhì)著色力較強(qiáng)?？赡軞⑺滥ㄆ械奈⑸?。必須注意：在抹片固定過程中，實(shí)際上并不能保證殺死全部細(xì)菌，也不能完全避免在染色水洗時不將部分抹片沖脫。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽孢的病原菌的染色抹片時，應(yīng)嚴(yán)格慎重處理染色用過殘液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即可進(jìn)行各種方法的染色。四、 實(shí)驗(yàn)第二部分：染色常應(yīng)用各種染料對細(xì)菌進(jìn)行染色，由于毛細(xì)管、滲透、吸附和吸收等物理作用，以及離子交換，酸堿

6、等化學(xué)作用，染料就能使細(xì)菌著色，且因細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同，而含有不同的染色反應(yīng)。常用的細(xì)菌染色方法，主要有兩種類型：1、簡單染色法只應(yīng)用一種染料進(jìn)行染色的方法，如美藍(lán)染色法。2、復(fù)染色法應(yīng)用兩種或兩種以上的染料或再加媒染劑進(jìn)行染色的方法。染色時，有些是將染料分別先后使用，有些則同時混合使用。染色后不同的細(xì)菌和物體，或者細(xì)菌構(gòu)造的不同部分可以呈現(xiàn)不同的顏色，有鑒別細(xì)菌的作用，又可稱為鑒別染色，如革蘭氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆薩染色法。1）美藍(lán)染色法在已干燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋涂抹點(diǎn)即可）美藍(lán)染色液，經(jīng)1-3分鐘，水洗，干燥（可用吸水紙吸干，或自然干燥，但

7、不能烤干），鏡檢。2）革蘭氏染色法A、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1-2分鐘，水洗。B、加革蘭氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-2分鐘，水洗。C、加95%酒精于抹片上脫色，約0.5-1分鐘，水洗。D、加稀釋石炭酸復(fù)紅（或沙黃水溶液）復(fù)染10-30秒，水洗。E、吸干或自然干燥，鏡檢。革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。3）抗酸染色法首先在已干燥、固定好的抹片上，滴加較多量的石炭酸復(fù)紅染色液，在玻片下以酒精燈火焰微微加熱至發(fā)生蒸氣為度（不要煮沸），維持微微發(fā)生蒸氣，經(jīng)3-5分鐘，水洗。然后用3%鹽酸酒精脫色，至標(biāo)本紅色脫出為止，充分水洗。再用堿性美蘭染色液復(fù)染約1分鐘，水

8、洗。最后吸干，鏡檢?？顾嵝约?xì)菌呈紅色，非抗酸細(xì)菌呈藍(lán)色。4）瑞氏染色法方法一：抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染色液于其上，為了避免很快變干，染色液可稍多加些，或者看情況補(bǔ)充滴加，經(jīng)1-3分鐘，再加約與染液等量的中性蒸餾水或緩沖液，輕輕晃動玻片，使與染液混勻，經(jīng)5分鐘左右，直接用水沖洗（不可先將染液傾去），吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌染成藍(lán)色，組織、細(xì)胞等物呈其他顏色。方法二：抹片自然干燥后，按涂抹點(diǎn)大小，蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加染色液，至略浸過濾紙，并看情況補(bǔ)滴，維持不使變干；染色3-5分鐘鐘，直接以水沖洗，吸干或烘干，鏡檢。此法的染色液經(jīng)濾紙濾過，可大大避免沉渣粘附抹片上而影響鏡檢觀察

9、。5）姬姆薩氏染色法A、于5毫升新煮過的中性蒸餾水中滴加5-10滴姬姆薩染色液原液，即稀釋成常用的姬姆薩染色液。B、抹片經(jīng)甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或?qū)⒛ㄆ胧⒂腥旧旱娜旧字?，染?0分鐘，或者染色數(shù)小時至24小時，取出水洗，吸干或烘干，鏡檢。細(xì)菌呈藍(lán)青色，組織、細(xì)胞等呈其他顏色，視野常呈紅色。五、作業(yè) 1、敘述細(xì)菌抹片的制備方法 2、敘述革蘭氏染色的方法 3、繪出細(xì)菌形態(tài)圖并注明染色方法六、實(shí)驗(yàn)總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)的最主要內(nèi)容是革蘭氏染色法，這種方法在以后的實(shí)踐中十分常用，因此要熟練掌握。值日同學(xué)在離開前把實(shí)驗(yàn)臺及地面打掃干凈，注意關(guān)好水電門窗。七、附：實(shí)驗(yàn)二：細(xì)菌抹片的制備及染色

10、實(shí)驗(yàn)所需物品一、試驗(yàn)材料名稱 組別 數(shù)量 合計 備注 1、平皿 5 2 10 放擦鏡紙、酒精棉球2、擦鏡紙3、酒精棉球4、雙壁瓶 5 1 5 盛香柏油、二甲苯5、香柏油 1瓶6、二甲苯 1瓶7、標(biāo)本盒 5 1 5 放標(biāo)本片8、載玻片：分5 組，每組 12張（6人每人制2張片），60張片20張片（供老師示教和學(xué)生選擇）9、染色液（美藍(lán)1瓶、革藍(lán)氏染液1套4瓶）5套（注；提前一周檢查和配制染色液）10、吸水紙 5本11、下口瓶 5個 提前加入水半瓶12、廢液缸 5個 用后廢液注意處理13、菌 種：大腸桿菌菌液5管、葡萄球菌平板5套（注：提前一周制普通肉湯和普通瓊脂并接種）二、儀器設(shè)備名稱顯微鏡 5

11、組 3臺 共 15臺 表1、試驗(yàn)儀器設(shè)備統(tǒng)計表學(xué)院牧醫(yī)工程 實(shí)驗(yàn)室名稱畜牧微生物 實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌抹片的制備及染色儀器設(shè)備名稱數(shù)量（臺、套）設(shè)備現(xiàn)狀備注藥品柜恒溫培養(yǎng)箱烘烤箱普通水箱低溫水箱（冰柜）高壓滅菌器流通蒸汽滅菌器水平式電動離心機(jī)抽水機(jī)（真空泵）賽式細(xì)菌濾器G1-6波動濾器顯微鏡超凈臺無菌室試驗(yàn)臺試驗(yàn)臺燈2個1臺1臺1臺1臺1臺1臺1臺1臺1套1套32臺1臺1個7個7套有1個有已壞無無已壞無無無無無有無無有已壞4套表2、試驗(yàn)試劑消耗情況統(tǒng)計表學(xué)院牧醫(yī)工程 實(shí)驗(yàn)室名稱畜牧微生物 實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌抹片的制備及染色分類內(nèi)容試劑名稱實(shí)驗(yàn)人數(shù)組 數(shù)試劑量組均消耗蒸餾水單價試劑（元）人均消耗情況再利用香柏油二甲苯牛肉膏氯化鈉蛋白胨瓊脂粉堿性美蘭KOH草酸銨結(jié)晶紫碘片碘化鉀堿性復(fù)紅3232培養(yǎng)細(xì)菌染色制備各種標(biāo)本片661瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶1瓶5000ml5000ml合計表3.實(shí)驗(yàn)用低值易耗品及實(shí)驗(yàn)動物統(tǒng)計表系別： 牧醫(yī) 實(shí)驗(yàn)室名稱： 畜牧微生物 實(shí)驗(yàn)名稱：實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌抹片的制備及染色實(shí)驗(yàn)人數(shù)玻璃儀器器械（材）消耗材料實(shí)驗(yàn)動物其它單價（元）人均費(fèi)用再利用情況