急性毒性實驗終結(jié)版LC50

1、急性毒性試驗急性毒性試驗LD50 與LC50 的測定急性毒性試驗急性毒性試驗l 實驗?zāi)康募耙饬x：實驗?zāi)康募耙饬x：確定受試物的半數(shù)致死劑量確定受試物的半數(shù)致死劑量LD50/LC50、觀、觀察受試物所致的急性中毒癥狀及其毒性作用特點，察受試物所致的急性中毒癥狀及其毒性作用特點，為進(jìn)一步的毒性試驗提供重要的參考依據(jù)。為進(jìn)一步的毒性試驗提供重要的參考依據(jù)。急性毒性試驗的染毒方式可有多種，包括急性毒性試驗的染毒方式可有多種，包括經(jīng)經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射染毒方式口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射染毒方式等。等。經(jīng)口急性毒性試驗（經(jīng)口急性毒性試驗（LD50） l 試驗?zāi)康脑囼災(zāi)康?學(xué)習(xí)急性毒性試驗的學(xué)習(xí)急性毒性試

2、驗的實驗設(shè)計實驗設(shè)計原則原則 熟練掌握熟練掌握經(jīng)口灌胃經(jīng)口灌胃染毒操作技術(shù)染毒操作技術(shù) 掌握掌握LD50計算方法計算方法和和急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)l 試驗內(nèi)容試驗內(nèi)容 動物選擇和性別鑒定動物選擇和性別鑒定 稱重、編號和隨機(jī)分組稱重、編號和隨機(jī)分組 小鼠經(jīng)口灌胃操作技術(shù)小鼠經(jīng)口灌胃操作技術(shù) 毒性癥狀觀察、毒性癥狀觀察、LD50計算和毒性分級計算和毒性分級l 操作步驟操作步驟 動物選擇及性別辨認(rèn)動物選擇及性別辨認(rèn) 急性毒性實驗一般首選哺乳動物，其中又以大小鼠最急性毒性實驗一般首選哺乳動物，其中又以大小鼠最為常用。大、小鼠主要依據(jù)肛門與生殖器之間的距離來區(qū)為常用。大、小鼠主要依據(jù)肛門與生殖

3、器之間的距離來區(qū)分。遠(yuǎn)分。遠(yuǎn)、近、近。成年鼠：雄性臥位可見睪丸，。成年鼠：雄性臥位可見睪丸，雌性可見腹部有雌性可見腹部有12個乳頭。個乳頭。 動物稱重、編號和隨機(jī)分組動物稱重、編號和隨機(jī)分組應(yīng)依據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則進(jìn)行隨機(jī)分組。應(yīng)依據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則進(jìn)行隨機(jī)分組。1 2 3 4 5 612.組數(shù)組數(shù)只數(shù)只數(shù)體重體重123456789受試物劑量選擇受試物劑量選擇 對于一種新的化學(xué)物質(zhì)，劑量選擇可參照同系物對于一種新的化學(xué)物質(zhì)，劑量選擇可參照同系物的毒性或文獻(xiàn)資料加以估計，先用少量動物以組距的毒性或文獻(xiàn)資料加以估計，先用少量動物以組距較大的一系列劑量進(jìn)行預(yù)實驗，找出粗略的致死劑較大的一系列劑量進(jìn)行預(yù)實驗，找出粗

4、略的致死劑量范圍，然后再設(shè)計出正式實驗劑量組量范圍，然后再設(shè)計出正式實驗劑量組受試物配制受試物配制本次試驗所用的受試物是本次試驗所用的受試物是80的敵敵畏的敵敵畏(DDVP)原液。原液。按照事先設(shè)計的劑量分別稀釋配制為幾種不同濃度的按照事先設(shè)計的劑量分別稀釋配制為幾種不同濃度的受試物溶液，而各個劑量組的動物均給予相同單位體受試物溶液，而各個劑量組的動物均給予相同單位體重體積的受試化學(xué)物。重體積的受試化學(xué)物。劑量劑量mg/kg 原液量原液量(g) 原液量原液量(ml) 定容量定容量(ml) 原液量原液量 (ml) 36.44 0.1139 0.0813 50 0.0948 51.02 0.159

5、4 0.1139 50 0.1327 71.43 0.2232 0.1594 50 0.1858 100 0.3125 0.2232 50 0.2603 140 0.4375 0.3125 50 0.3642 196 0.6125 0.4375 50 0.5099敵敵畏（敵敵畏（DDVP）配制：（組距）配制：（組距1.4，給藥量，給藥量0.2ml/10g）（4）（25 ）灌胃操作灌胃操作將動物固定成垂直體位，腹部面向操作者，使動物的上消將動物固定成垂直體位，腹部面向操作者，使動物的上消化道固定成一直線化道固定成一直線毒性作用毒性作用/中毒癥狀和動物死亡情況觀察中毒癥狀和動物死亡情況觀察高劑量組

6、動物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)即刻密切觀高劑量組動物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應(yīng)即刻密切觀 察。觀察和記錄中毒癥狀及出現(xiàn)的時間，死亡數(shù)量和時間及察。觀察和記錄中毒癥狀及出現(xiàn)的時間，死亡數(shù)量和時間及死亡前的特征。按照實驗結(jié)果，填寫急性毒性實驗記錄表。死亡前的特征。按照實驗結(jié)果，填寫急性毒性實驗記錄表。中毒的癥狀觀察：中毒的癥狀觀察：興奮、流涎、肌震顫、抽搐、管狀尾、興奮、流涎、肌震顫、抽搐、管狀尾、呼吸減慢、呼吸困難、四肢無力、站立不穩(wěn)、大小便失禁、呼吸減慢、呼吸困難、四肢無力、站立不穩(wěn)、大小便失禁、大劑量側(cè)臥以致死亡大劑量側(cè)臥以致死亡。改進(jìn)寇氏法是利用劑量對數(shù)與死亡率呈改進(jìn)寇氏法是利用劑量對數(shù)與

7、死亡率呈S型曲線而設(shè)計型曲線而設(shè)計的方法，又稱的方法，又稱Karber法或平均致死量法。本法要求每個染法或平均致死量法。本法要求每個染毒劑量組動物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級數(shù)，死亡毒劑量組動物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率呈率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率呈80%。LD50計算（改良寇氏法）計算（改良寇氏法）根據(jù)實驗動物中毒癥狀、死亡時間、特征根據(jù)實驗動物中毒癥狀、死亡時間、特征和和LD50，按受試物種類，分別參照相應(yīng)的經(jīng)口，按受試物種類，分別參照相應(yīng)的經(jīng)口急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，判斷該受試物的毒急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，判斷該受試物的毒性大小及毒性特

8、征。性大小及毒性特征。毒性分級及結(jié)果評定毒性分級及結(jié)果評定 健康成年小鼠若干只（按每組健康成年小鼠若干只（按每組56人，每組人，每組10只動物，只動物，各半）、各半）、50 ml容量瓶容量瓶(每組每組1個個)、加樣器（、加樣器（200l、1000l）、加樣槍頭、）、加樣槍頭、DDVP原液、原液、1 ml玻璃注射器、灌玻璃注射器、灌胃針頭（每組胃針頭（每組2套）、棉簽、染液、套）、棉簽、染液、LD50記錄紙、小鼠籠記錄紙、小鼠籠（每組（每組2個）、電子天平（個）、電子天平（2臺）、搪瓷托盤（每組一個）、臺）、搪瓷托盤（每組一個）、受試物、苦味酸酒精飽和液、受試物、苦味酸酒精飽和液、0.5%品紅溶

9、液或其它染色品紅溶液或其它染色劑。劑。 實驗課所需準(zhǔn)備的試劑和材料：實驗課所需準(zhǔn)備的試劑和材料：經(jīng)呼吸道急性毒性試驗（經(jīng)呼吸道急性毒性試驗（LC50）l 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康膶W(xué)習(xí)靜式呼吸道染毒操作方法學(xué)習(xí)靜式呼吸道染毒操作方法 學(xué)習(xí)測定和計算學(xué)習(xí)測定和計算LC50的試驗步驟和方法。的試驗步驟和方法。l 實驗原理（染毒方式）實驗原理（染毒方式） 呼吸道吸入染毒可分為兩種方式，一種是動式呼吸道吸入染毒可分為兩種方式，一種是動式吸入，一種是靜式吸入。吸入，一種是靜式吸入。靜式呼吸道吸入染毒：靜式呼吸道吸入染毒： 優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、消耗受試物少、適用于小動物優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、消耗受試物少、

10、適用于小動物 接觸易揮發(fā)液接觸易揮發(fā)液 態(tài)化合物的急性毒性研究。態(tài)化合物的急性毒性研究。 缺點：受試物濃度難維持恒定，而且實驗動物有經(jīng)皮吸收的缺點：受試物濃度難維持恒定，而且實驗動物有經(jīng)皮吸收的 可能?？赡堋邮轿耄簞邮轿耄?優(yōu)點：能即時補(bǔ)入新鮮空氣和排出污濁空氣，氧分壓，二氧優(yōu)點：能即時補(bǔ)入新鮮空氣和排出污濁空氣，氧分壓，二氧 化碳分壓，溫度、濕度，受試物濃度保持恒定?；挤謮?，溫度、濕度，受試物濃度保持恒定。 缺點：設(shè)備復(fù)雜，消耗受試物多、易污染環(huán)境缺點：設(shè)備復(fù)雜，消耗受試物多、易污染環(huán)境染毒柜內(nèi)受試物濃度的計算染毒柜內(nèi)受試物濃度的計算注意單位！注意單位！l 試劑和材料試劑和材料 實驗

11、動物及器材實驗動物及器材 健康成年小鼠若干只，（每組健康成年小鼠若干只，（每組10只，只，各各半），小鼠籠（每組半），小鼠籠（每組2個）。靜式吸入染毒柜個）。靜式吸入染毒柜6個、個、吸管、動物秤、記錄紙。吸管、動物秤、記錄紙。 試劑試劑 受試物（易揮發(fā)液體，苯（原液）、苦味酸受試物（易揮發(fā)液體，苯（原液）、苦味酸酒精飽和液、酒精飽和液、0.5%品紅溶液或其他染色劑。品紅溶液或其他染色劑。l 操作步驟操作步驟 選擇健康實驗動物，稱重（精確到選擇健康實驗動物，稱重（精確到0.1g），編號，），編號，隨機(jī)分組。隨機(jī)分組。劑量分組劑量分組呼吸道吸入染毒：呼吸道吸入染毒： 依設(shè)計劑量濃度及染毒柜體積，計

12、算需要加入的受試物依設(shè)計劑量濃度及染毒柜體積，計算需要加入的受試物量。將量。將5、5共共10只小鼠只小鼠放入靜式染毒柜內(nèi)放入靜式染毒柜內(nèi)加蓋加蓋（注：每只小鼠每小時所需要的氣積為（注：每只小鼠每小時所需要的氣積為3L）。將液態(tài)受試）。將液態(tài)受試物經(jīng)加藥孔加到接物蒸發(fā)器（紗布、濾紙、蒸發(fā)皿或小型物經(jīng)加藥孔加到接物蒸發(fā)器（紗布、濾紙、蒸發(fā)皿或小型加熱器）上加熱器）上開啟小電扇，計時開啟小電扇，計時觀察、記錄中毒癥狀和觀察、記錄中毒癥狀和動物死亡情況。染毒結(jié)束后，關(guān)閉電源，打開蓋子，驅(qū)走動物死亡情況。染毒結(jié)束后，關(guān)閉電源，打開蓋子，驅(qū)走柜內(nèi)殘存的含毒空氣，取出動物，存活者歸籠繼續(xù)觀察。柜內(nèi)殘存的含毒

13、空氣，取出動物，存活者歸籠繼續(xù)觀察。（癥狀：嘔吐、昏迷、抽搐、呼吸麻痹而死亡）（癥狀：嘔吐、昏迷、抽搐、呼吸麻痹而死亡） LC50計算：同計算：同LD50 急性毒性試驗的觀察和記錄內(nèi)容主要包括急性毒性試驗的觀察和記錄內(nèi)容主要包括4個方面：中個方面：中毒體征及發(fā)生過程、死亡情況和時間分布、體重和病理形毒體征及發(fā)生過程、死亡情況和時間分布、體重和病理形態(tài)學(xué)變化。態(tài)學(xué)變化。觀察和記錄中毒癥狀及出現(xiàn)的時間，死亡數(shù)量和時間觀察和記錄中毒癥狀及出現(xiàn)的時間，死亡數(shù)量和時間及死亡前的特征。急性毒性試驗觀察周期一般為及死亡前的特征。急性毒性試驗觀察周期一般為14天，天，LD50或或LC50計算時以觀察周期內(nèi)各組

14、動物的總死亡數(shù)為依計算時以觀察周期內(nèi)各組動物的總死亡數(shù)為依據(jù)。根據(jù)觀察情況分析中毒特點和毒作用靶器官。按照實據(jù)。根據(jù)觀察情況分析中毒特點和毒作用靶器官。按照實驗結(jié)果，填寫急性毒性實驗記錄表。驗結(jié)果，填寫急性毒性實驗記錄表。中毒癥狀和動物死亡情況觀察中毒癥狀和動物死亡情況觀察l 結(jié)果評定結(jié)果評定/結(jié)果評價結(jié)果評價 依據(jù)實驗動物中毒癥狀、死亡時間、依據(jù)實驗動物中毒癥狀、死亡時間、LC50及急性毒作用帶，參考相應(yīng)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，及急性毒作用帶，參考相應(yīng)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，評價毒物的急性毒性強(qiáng)弱，判斷該受試物的毒性評價毒物的急性毒性強(qiáng)弱，判斷該受試物的毒性大小及其毒性特征。大小及其毒性特征。實驗報

15、告實驗報告l 實驗動物的種屬、品系、性別及來源。實驗前動物禁食和實驗動物的種屬、品系、性別及來源。實驗前動物禁食和健康狀況。健康狀況。l 實驗動物體重和隨機(jī)分組情況。實驗動物體重和隨機(jī)分組情況。l 受試物的名稱、來源、純度、性狀等情況。受試物的名稱、來源、純度、性狀等情況。l 詳細(xì)描述實驗觀察的中毒表現(xiàn)和死亡情況等。詳細(xì)描述實驗觀察的中毒表現(xiàn)和死亡情況等。l LD50/LC50的計算方法和結(jié)果。的計算方法和結(jié)果。l 受試物的毒性分級、分級依據(jù)和結(jié)果評價。受試物的毒性分級、分級依據(jù)和結(jié)果評價。 注意事項注意事項l 敵敵畏溶液灌胃前要搖勻敵敵畏溶液灌胃前要搖勻！l 注意注意染毒柜密閉染毒柜密閉，保持柜內(nèi)受試物濃度，防止污染周圍環(huán)境，保持柜內(nèi)受試物濃度，防止污染周圍環(huán)境和影響操作者。和影響操作者。l 在染毒結(jié)束時，應(yīng)在通風(fēng)柜內(nèi)或通風(fēng)處開啟染毒柜，迅速小在