乳酸菌菌種的分離篩選方法剖析

1、乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸細(xì)菌是一類能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。為兼性厭氧菌，桿狀或球狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽抱，不運(yùn)動(dòng)。營(yíng)養(yǎng)要求高，需要提供豐富的肽類氨基酸維生素。在瓊脂表面或內(nèi)層形成較小的白色或淡黃色的菌落。通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS®脂作半選擇培養(yǎng)基。當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類時(shí)，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對(duì)于芽抱乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS®養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌

2、屬的一個(gè)種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽(yáng)性，圓形或橢圓形。乳酸片球菌細(xì)胞呈球狀，直徑0.61.0pm,在直角兩個(gè)平面交替形成四聯(lián)狀，一般細(xì)胞成對(duì)生，單生者罕見(jiàn)，不成鏈狀排列。革蘭氏陽(yáng)性，不運(yùn)動(dòng)，兼性厭氧。在MRSW養(yǎng)基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長(zhǎng)物呈絲狀。乳酸菌在一般瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落，不易觀察，所以分離時(shí)先富集培養(yǎng)并選擇合適的培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫-80等物質(zhì)，也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)乳酸菌無(wú)害。培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成透明圈，作為分離鑒別的依據(jù)，通過(guò)對(duì)生成的乳酸量進(jìn)行性能鑒定

3、。乳酸菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)需要多種氨基酸，維生素及微氧，一般菌落比較小。分離培養(yǎng)基一般可添加西紅柿酵母膏油酸吐溫等物質(zhì)，均具有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。也常常添加醋酸鹽抑制有些細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)乳酸菌無(wú)害。一.篩選方法：1 .溶鈣圈法：利用一些產(chǎn)酸類細(xì)菌在含CaCO3勺培養(yǎng)基上產(chǎn)生CaCO3容解圈，從而篩選出這些產(chǎn)酸類細(xì)菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養(yǎng)基中加入CaCO的作用是：鑒別能產(chǎn)生酸的細(xì)菌；中和產(chǎn)生的酸，以維持培養(yǎng)基的PH篩選過(guò)程：樣品預(yù)處理一梯度稀釋至10-6一選擇合適的稀釋度涂布-37c培養(yǎng)48h一挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落反復(fù)在MR斯養(yǎng)基上劃線一挑起單菌落染色，經(jīng)鏡檢確認(rèn)為純種一挑選革蘭氏陽(yáng)性單菌落一試管穿刺4

4、c冰箱保存。2 .澳甲酚綠指示劑法：培養(yǎng)基:MRSt養(yǎng)基（含澳甲酚綠酒精溶液）篩選過(guò)程：同上，不同之處是稀釋涂布后長(zhǎng)出菌落，挑取使澳甲酚綠變色的菌落。二.菌種的分離篩選1 .培養(yǎng)基：1.1 1.1麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基：麥芽汁（10BR1L預(yù)先滅菌碳酸鈣5-10g/LPH自然（分離用）1.2牛肉膏10g/L蛋白凍10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐溫0.05%CaCO315-20g/L澳甲酚綠0.01%PH6.0-6.5（分離用）1.2 1.3番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基：酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白陳7.5g/LKH2PO2.0g/L吐溫0.5mLPH6

5、.0-6.5（分離用）1.4 葡萄糖20g/L酵母膏10g/LPH6.0-6.51.5 蛋白陳8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/LMgSO0.3-0.5g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC3.0-5.0g/LPH5.5-6.51.6 蛋白陳0.8-1.0g/L糖蜜3.0-5.0g/L酵母膏3-5g/L玉米漿0.5-1.0g/LKH2PO40.1-0.3g/LMgSO0.3-0.5g/LNaC13-5g/L葡萄糖8-10g/LPH5.5-6.5（發(fā)酵或種子培養(yǎng)基）1.7MRSf養(yǎng)基（分離培養(yǎng)計(jì)數(shù)用）蛋白陳10.0g、牛肉膏10.0g、酵

6、母膏5.0g、檸檬酸氫二錢2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫801.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸鈕0.25g、瓊脂18.0g、蒸儲(chǔ)水1L,pH6.5。（分離培養(yǎng)基），當(dāng)MRSS養(yǎng)基冷卻至4550c時(shí)，加入已滅菌的碳酸鈣，充分混勻，倒平板。1.8 BCP培養(yǎng)基（澳甲酚紫培養(yǎng)基）乳糖5.0g蛋白陳5.0g酵母膏3.0g0.5%澳甲酚紫10ml自來(lái)水1000mlpH6.5-7.0（分離用）1.9 BCGfr乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂：脫脂奶粉10g,溶于50ml水中，加入1.6%澳甲酚綠酒精溶液0.07ml,0.075Mpa20min。另取瓊脂2.0g,溶于50ml水中,加酵母膏

7、1.10 g溶解后調(diào)pH6.5-6.8,0.1Mpa20min.趁熱在無(wú)菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37c培養(yǎng)24h,檢查是否有雜菌。2 .分離篩選：2.1 富集培養(yǎng)：取1.0g(1.0ml)于無(wú)菌細(xì)口瓶中，加入無(wú)菌麥芽汁液體培養(yǎng)液于瓶口處，密閉，25-32C培養(yǎng)48h0若培養(yǎng)基表內(nèi)出現(xiàn)絹絲波紋物，鏡檢桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉(zhuǎn)接2-3次，接種量3-5%.2.2 菌種分離純化:溶鈣圈法：富集菌液或樣品適當(dāng)稀釋至10、混菌法分離，先加入10-12mlMRSt養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，凝固后再注入4-5ml水瓊脂培養(yǎng)基，制成厭氧環(huán)境，30c或37c培養(yǎng)2-3天(溫度低時(shí)間稍長(zhǎng))，可

8、出現(xiàn)針頭狀或圓形稍扁菌落，周圍形成透明圈。挑取透明圈大，培養(yǎng)基變黃的菌落，反復(fù)劃線純化2-3次，所得單菌落編號(hào)，經(jīng)鏡檢后，疑似乳酸菌落接種于MRSt養(yǎng)基培養(yǎng)后保存?zhèn)溆??；蚪尤胍后w培養(yǎng)基中，25-32C培養(yǎng)24-48h,然后穿刺于MRSS養(yǎng)基或麥芽汁碳酸鈣半固體培養(yǎng)基中，25-32C培養(yǎng)48h保存?zhèn)溆谩?.3 性能測(cè)定：乳酸菌定性試驗(yàn):不同條件下的產(chǎn)酸速率試驗(yàn)：將分離菌種接種于MR儆體培養(yǎng)基中25c37c溫度下培養(yǎng)測(cè)不同菌株不同溫度的pHo方法1.吸取發(fā)酵液10ml,注入空試管中，加入10%硫酸1.0ml,在加入2.0%高鈕酸鉀約1.0ml,此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化成乙醛。取濾紙一條，在含氨的硝酸銀溶液中浸

9、濕，橫搭在試管口上，將試管徐徐加熱至沸騰，使乙醛揮發(fā)，若管口濾紙變黑，證明有乳酸生成。方法2.紙層析法：展開(kāi)劑為正丁醇：甲醇：水=80:15:5,毛細(xì)血管吸取發(fā)酵液，多次點(diǎn)樣于新華濾紙上，1.5%標(biāo)準(zhǔn)乳酸為對(duì)照，平衡2小時(shí)后進(jìn)行層析，3%澳甲酚藍(lán)顯色計(jì)算Rf值。產(chǎn)酸量測(cè)定：5.0ml發(fā)酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸儲(chǔ)水10-20ml,酚丈指示劑2滴，用0.1mol/l氫氧化鈉滴定至微紅色。醋酸量（g/100mL）=氫氧化鈉摩爾濃度.Vx90.08x10-3/樣品毫升數(shù)x100同時(shí)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察醋酸速度，耐高溫，耐酒精度，耐低酸度等主要生產(chǎn)性能，選擇優(yōu)勢(shì)菌株。3 .菌株鑒定：3.

10、1 菌落形態(tài)：3.2 菌體形態(tài)：（革蘭氏染色觀察）染色鏡檢：桿狀陽(yáng)性。3.3 乳酸菌運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)：半固體穿刺法3.4 生理生化：3.3.1 生化試驗(yàn)：產(chǎn)過(guò)氧化氫，產(chǎn)硫化氫，葡萄糖產(chǎn)生，硝酸鹽還原，產(chǎn)生呷咪，甲基紅，明膠液化，需氧，精氨酸，糖發(fā)酵試驗(yàn)。3.3.2 生理試驗(yàn)：乳酸菌產(chǎn)酸能力曲線：將篩選的乳酸菌接種于MR儆體培養(yǎng)基中，25-32C培養(yǎng)48h,間隔4-6h測(cè)定發(fā)酵液pH。食鹽對(duì)乳酸菌的影響：在MR儆體培養(yǎng)基中，添加0.0%2.0%4.0%6.0%氯化鈉，菌種分別接種于培養(yǎng)基中，32c培養(yǎng)48h,測(cè)定ODfi。澳甲酚綠指示劑法：原理：澳甲酚綠指示劑在酸性環(huán)境中呈黃色，堿性環(huán)境呈藍(lán)色，分離培

11、養(yǎng)基配制后PH為6.8,加入澳甲酚綠指示劑呈藍(lán)綠色，產(chǎn)酸后菌落周圍變成黃色，較容易鑒別。培養(yǎng)基：BCG乳營(yíng)養(yǎng)瓊脂初篩：將樣品富集液梯度稀釋，適溫培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)扁平的黃色菌落及周圍培養(yǎng)基也為黃色初定為乳酸菌。復(fù)篩：將典型菌落轉(zhuǎn)接脫脂乳發(fā)酵管，若凝固，無(wú)氣泡，呈酸性，鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，連續(xù)傳代若干次培養(yǎng)，挑選出3-4h能凝固的乳管保存?zhèn)溆?。注?.乳酸菌篩選常在幾種培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行:分別在麥芽汁碳酸鈣培養(yǎng)基，番茄汁碳酸鈣培養(yǎng)基，BCP養(yǎng)基（澳甲酚紫培養(yǎng)基）同時(shí)進(jìn)行混菌劃線或涂布培養(yǎng)（放厭氧袋），分別25C37c培養(yǎng)48h。菌落觀察：平板表面形成淺色（黃色或白色）小菌落。麥芽汁碳

12、酸鈣培養(yǎng)基表面,菌落周圍形成透明圈，BCRW養(yǎng)基（澳甲酚紫培養(yǎng)基）周圍使紫色的培養(yǎng)基形成黃色包圍圈。觸酶反應(yīng)：厭氧菌一般無(wú)觸酶（過(guò)氧化氫酶），用滴管滴加3.0%過(guò)氧化氫于菌落上，若無(wú)氣泡產(chǎn)生，證明該菌為觸酶陰性。將各種特征菌落分別接入斜面，培養(yǎng)后保存，進(jìn)一步生理生化試驗(yàn)，以鑒定分別何種乳酸菌。2.菌落鑒定：半固體或雙平板瓊脂利于乳酸菌的生長(zhǎng)，菌落出現(xiàn)早。2.1 菌落形態(tài)觀察：乳白色邊緣不整齊，稍呈半球狀凸起，實(shí)心菌落個(gè)體形態(tài)：半透明細(xì)桿狀鏈狀排列，大量時(shí)呈發(fā)絲狀堆積。初步認(rèn)為乳桿菌2.2 生化鑒定：在呷咪試驗(yàn)中，加入菌種試管無(wú)任何變化，為陰性反應(yīng)。說(shuō)明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生呷咪的能力。明膠液化淀粉水解氫氧化鉀試驗(yàn)均為陰性，說(shuō)明此菌為乳酸菌。（過(guò)氧化氫酶還原硝酸鹽）糖發(fā)酵試驗(yàn)：發(fā)酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖產(chǎn)酸為陽(yáng)性反應(yīng)，其余麥芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖產(chǎn)酸為陰性反應(yīng)。根據(jù)手冊(cè)第九版判斷此種乳酸菌為德氏乳桿菌保加利亞亞種。（纖維二糖甘露醇山梨醇七葉甘水楊甘）2.3 乳酸菌生長(zhǎng)曲線pH-t測(cè)定結(jié)果：飼科檢測(cè)歷保加利亞乳桿菌vwwWjcw，8E.en嗜酸乳桿苗乳酸就在MRS培養(yǎng)基上三.幾種乳酸菌篩選舉例1 .嗜熱鏈球菌：樣品來(lái)源：市售酸奶培養(yǎng)基：M17改良培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度：42C,需氧情況：兼性厭氧，篩選方法：常規(guī)的稀釋涂布和劃線分離2 .保加利亞乳桿菌