【課件】重組DNA技術的基本工具課件2021-2022學年高二下學期生物人教版選擇性必修3

1、重組DNA技術的基本工具第1節(jié)一、基因工程基因工程是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦子生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品，從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術。對基因工程概念的理解基因工程的別名：操作環(huán)境：操作對象：操作水平：基本過程：原理：結果：重組DNA技術、轉基因技術生物體外基因DNA 分子水平剪切拼接導入表達基因重組創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”一、基因工程來源：種類：主要來自原核生物特點：數(shù)千種能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每

2、一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（限制酶不是一種酶，而是一類酶）二、限制性內切核酸酶“分子手術刀”作用部位：識別序列長度：結 果：特定切點上的磷酸二酯鍵大多數(shù)是6個核苷酸序列產生黏性末端或平末端5353磷酸二酯鍵二、限制性內切核酸酶“分子手術刀”EcoR I(在G與A之間切割)Sma I(在G與C之間切割)55335533黏性末端平末端二、限制性內切核酸酶“分子手術刀”能被限制性酶特異性識別的切割位點一般都具有回文序列：即在切割位點，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條反向讀的堿基序列完全一致。在切割含目的基因的DNA分子時，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內切酶切割，會產生4個末端。注意

3、：二、限制性內切核酸酶“分子手術刀”將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。作用：三、DNA連接酶“分子縫合針”E.coli DNA連接酶種類：T4 DNA連接酶從大腸桿菌分離得到只能連接互補黏性末端的DNA片段從T4噬菌體分離得到黏性末端和平末端均能連接，但連接平末端的效率相對較低。平末端黏性末端三、DNA連接酶“分子縫合針”磷酸二酯鍵作用部位：三、DNA連接酶“分子縫合針”DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA聚合酶相同點：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶。不同點：DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板； DNA連接酶連接的是DNA片段。

4、三、DNA連接酶“分子縫合針”總結歸納幾種相關酶的比較名稱作用部位作用結果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈三、DNA連接酶“分子縫合針”質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。四、基因進入受體細胞的載體“分子運輸車”作用：種類：將目的基因轉入受體細胞，在受體細胞內對目的基因進行大量復

5、制通常是用質粒、噬菌體、動植物病毒也可以。四、基因進入受體細胞的載體“分子運輸車”運載體需具備的條件：能在受體細胞中穩(wěn)定保存并復制有一個至多個限制酶切割位點，便于插入（攜帶）目的基因具有標記基因，便于篩查含有重組DNA分子的細胞對受體細胞無害、易分離真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。四、基因進入受體細胞的載體“分子運輸車”請你根據圖3-3中的相關信息找到兩條片段上EcoRI的識別序列和切割位點。然后，用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來。思考討論四、基因進入受體細胞的載體

6、“分子運輸車”1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具” ？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。四、基因進入受體細胞的載體“分子運輸車”1.實驗原理：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法對它們進行提取。例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DN

7、A與蛋白質。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/LNaCl溶液。提取原理鑒定原理五、DNA的粗提取與鑒定在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。3.材料用具：材料：新鮮洋蔥（也可以選擇香蕉、菠菜、菜花或豬肝等作為實驗材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、體積分數(shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。用具：燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網、三腳架、火柴、刀片和天平等。2.目的要求：了解DNA的物理和化學性質，理解DNA粗提取和鑒定的原理。學會DNA粗

8、提取的方法以及用二苯胺試劑對DNA進行鑒定。五、DNA的粗提取與鑒定各試劑的作用：研磨液：體積分數(shù)為95%的酒精：2mol/L的NaCl溶液：二苯胺試劑：蒸餾水：破壞細胞，釋放出細胞內的物質析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用滴入NaCl溶液中，使其濃度逐漸下降至0.14mol/L，從而析出DNA五、DNA的粗提取與鑒定研磨稱取約30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。過濾取上清液在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。4.過

9、程：五、DNA的粗提取與鑒定析出DNA在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液（體積分數(shù)為95%），靜置23min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；或者將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。五、DNA的粗提取與鑒定DNA的鑒定取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝螅瑢⒃嚬苤糜诜兴屑訜?min。待試管冷卻后，比較兩支試管中

10、溶液顏色的變化?？瞻讓φ战M： 在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。五、DNA的粗提取與鑒定課堂練習一、概念檢測1.DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶。下列相關敘述正確的是（ ） A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵 B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵 C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵 D.只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端2.在重組DNA技術中，將外源基因送入受體細胞的載體可以是（ ） A.大腸桿菌的質粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端

11、 D.用來識別特定基因的DNA探針CA二、拓展應用1.想一想，為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子?迄今為止。在基因工程操作中使用的限制酶絕大部分都是從細菌或霉菌中提取出來的，它們可以識別DNA上特定的堿基序列并使特定部位的磷酸二酯鍵斷開。微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，可以將外源入侵的DNA降解。細菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因為含有某種限制酶的細胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶，也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA入侵。課堂練習2.有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進行切割，B片段分別用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI進行切割。各限制酶的識別序列和切割位點如下。（1）哪種限制酶切割B片段產生的DNA片段能與限制酶SpeI切割A片段產生的DNA片段相連接?為什么?XbaI。因為XbaI與SpeI切割產生了相同的黏性末端。課堂練習（2）不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端，這在基因工程操作中有什么意義?識別DNA分子中不同核