酶聯(lián)免疫分析法

1、會(huì)計(jì)學(xué)1酶聯(lián)免疫分析法酶聯(lián)免疫分析法n1971年第一屆國際免疫學(xué)會(huì)議 將免疫學(xué)與微生物學(xué)分開發(fā)展成一門獨(dú)立的學(xué)科。境穩(wěn)定的一種生理性功能。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述n具備上述兩種特性的物質(zhì)為完全抗原，僅具有 免 疫 反 應(yīng) 性 的 物 質(zhì) 被 稱 為 半 抗 原（hapten）。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述反應(yīng)，這種反應(yīng)具有高特異性（即專一性）和可逆性。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述衡常數(shù)（親和常數(shù)）。Kkk21AbAgAg-Ab第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質(zhì)。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免

2、疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述免疫分析標(biāo)記免疫分析放射免疫分析法化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)免疫分析法熒光免疫分析法酶聯(lián)免疫分析法競爭性酶聯(lián)免疫分析非競爭性酶聯(lián)免疫分析均相酶聯(lián)免疫分析非均相酶聯(lián)免疫分析非標(biāo)記免疫分析沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫電泳、免疫擴(kuò)散第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述酶酶來源來源EC編號編號辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶動(dòng)植物動(dòng)植物3.1.3.2堿性磷酸酶堿性磷酸酶牛腸牛腸3.1.3.1-D-

3、半乳糖苷酶半乳糖苷酶大腸桿菌大腸桿菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6過氧化氫酶過氧化氫酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛紅細(xì)胞牛紅細(xì)胞4.2.1.1乙酰膽堿酶乙酰膽堿酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶腸系膜明串細(xì)菌腸系膜明串細(xì)菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶雞卵白雞卵白3.2.1.17蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶豬心線粒體豬心線粒體1.1.1.49無機(jī)焦磷酸酶無機(jī)焦磷酸酶大腸桿菌大腸桿菌3.6.1.1熒光素酶熒光素酶發(fā)光生物發(fā)光

4、生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳動(dòng)物組織哺乳動(dòng)物組織2.7.1.40酶聯(lián)免疫分析常用酶酶聯(lián)免疫分析常用酶第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述（purpurogallinHRP1位。n用于標(biāo)記的HRP比活性應(yīng)大于250U/mg。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述n用作標(biāo)記的AP比活力應(yīng)大于1000U/mg。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述n葡萄糖氧化酶在4下可穩(wěn)定存在612個(gè)月。第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述第一節(jié)第一節(jié) 酶聯(lián)免疫分析概述酶聯(lián)免疫分析概述例；加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢物的量相關(guān)，用分光

5、光度法進(jìn)行定量。g。*( )( )gbgbggbAAAAFBAAA第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法n一般蛋白質(zhì)的包被濃度為0.120g/ml。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法列于表7-2。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法編編號號吐溫吐溫20/%組成組成稀稀釋釋液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.

6、05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗滌滌液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl緩沖液緩沖液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L表表7-2 常用的抗體稀釋液和洗滌液常用的抗體稀釋液和洗滌液第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法nTMB的，第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法-和溴麝香草酚藍(lán)（21

7、）等。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法NH2+ HCCHOONH2+CCNHHNCCNHHNCCNHHN+圖圖7-2 戊二醛一步法反應(yīng)原理戊二醛一步法反應(yīng)原理一步法一步法 將戊二醛將戊二醛直接直接加入加入酶與抗體的混合物酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。抗體。 該法操作該法操作簡便簡便、有效有效，重復(fù)性好重復(fù)性好。 缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)隨機(jī)的，酶與酶、抗體與抗的，酶與酶、抗體與抗體之間有可能交聯(lián)。體之間有可能交聯(lián)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法HCCHOONH2+

8、CCNOHHCCNHHNNH2圖圖7-3 戊二醛二步法反應(yīng)原理戊二醛二步法反應(yīng)原理兩步法兩步法 先將先將酶與戊二醛酶與戊二醛作用作用，透析透析除去多余的除去多余的戊二醛后，再與戊二醛后，再與抗體抗體作作用而形成酶標(biāo)抗體；用而形成酶標(biāo)抗體；或或先將抗體與戊二醛作用先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。，再與酶聯(lián)結(jié)。 兩步法的產(chǎn)物中絕大部兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，的比例結(jié)合的，有助于有助于本底的改善本底的改善。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法n圖7-4 過碘酸鹽氧化法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)

9、免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-5 雙抗體夾心法雙抗體夾心法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-6 間接法間接法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-7 競爭法競爭法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-8 異種動(dòng)物抗體夾心法異種動(dòng)物抗體夾心法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法和IgG連接起來。n最后讓酶與抗酶抗

10、體結(jié)合，通過對底物的作用而揭示在固相載體上待測抗原的存在。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法。n因?yàn)橹苽淇姑缚贵w必須在動(dòng)物中進(jìn)行，故抗酶抗體法多適用于檢測動(dòng)物中的抗體。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法圖圖7-9 抗酶抗體法抗酶抗體法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法光度。n選擇吸光度為1的稀釋度作為酶標(biāo)抗體最適濃度。圖圖7-10 酶標(biāo)抗體濃度的選擇酶標(biāo)抗體濃度的選擇第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法n的飽和包被濃度。圖圖7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反應(yīng)的關(guān)系反應(yīng)的關(guān)系 第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附

11、分析法包被質(zhì)量濃度（包被質(zhì)量濃度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA測定結(jié)果（測定結(jié)果（A A492492SDSD）（n n=4=4）4 41.0981.0980.06280.06281 1* *1.0111.0110.03020.03020.50.50.9690.9690.08760.08760.250.250.7920.7920.10230.1023第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法時(shí)，IgG量為0.62mg/ml；0.94表示酶、戊二醛結(jié)合后，A280nm增加約6。403/0.4nmmg mLA酶量（）62. 09

12、4. 0)42. 0(/IgG403280nmnmAAmLmg）量（第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法結(jié)果。）結(jié)合物溶液量（）每毫升溶液中的酶量（）結(jié)合物中酶量（mLmLmgmg/%100%）標(biāo)志時(shí)加入的酶量（）結(jié)合物中酶量（酶結(jié)合率mgmgHRPHRP/HRPHRP/160000IgGIgG/IgGIgG/40000mg mLmg mLmg mLmg mL（）分子量（）（摩爾比）（）分子量（）第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法n采用放大系統(tǒng)是提高ELISA靈敏度的主要途徑。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法ELISAn生物素-親和素標(biāo)記體系有靈

13、活多變的運(yùn)用方式，可以適應(yīng)不同的分析設(shè)計(jì)。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法蛋白，靈敏度放大兩個(gè)數(shù)量級。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法體、酶結(jié)合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。n這些試劑在冰箱中可保存半年以上，因此實(shí)驗(yàn)室中只需要用蒸餾水稀釋全套試劑即可。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法nELISA測定125SerIL-2中青霉噻唑蛋白的結(jié)果如下（見表7-4）：第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分

14、析法酶聯(lián)免疫吸附分析法表表7-4 ELISA實(shí)驗(yàn)測定實(shí)驗(yàn)測定125SerIL-2*中青霉噻唑蛋白中青霉噻唑蛋白第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法指每摩爾反應(yīng)物輻射出光子的量。第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析+D*C B+AhvC*C 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析、。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 圖圖7-12 吖啶酯氧化反應(yīng)過程吖啶酯氧化反應(yīng)過程第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免

15、疫分析 圖圖7-13 光澤精的氧化反應(yīng)光澤精的氧化反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 圖圖7-14 魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結(jié)構(gòu)式魯米諾、異魯米諾及其某些衍生物的結(jié)構(gòu)式第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 圖圖7-15 魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 圖圖7-16 咯吩堿的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)咯吩堿的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析獲化學(xué)能

16、，使熒光體處于激發(fā)態(tài)，退激至基態(tài)時(shí)，放出光子。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析疫測定過程。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析n光反應(yīng)。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析n某些酸類衍生物尤其是對碘酸、苯甲酸等的增強(qiáng)效果更佳，可使其發(fā)光強(qiáng)度提高1000倍，且延長發(fā)光持續(xù)時(shí)間。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析度大，持續(xù)時(shí)間長，發(fā)光穩(wěn)定，故生物發(fā)光分析靈敏度高，容易測定。第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 n越廣泛地引起人們的重視。 第

17、三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析max=490nm，從而可以進(jìn)行生物發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析n以鄰苯三酚-H2O2為底物測定登革熱型病毒b、傷寒桿菌、細(xì)菌內(nèi)毒素等物質(zhì)。 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析 第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)光酶聯(lián)免疫分析發(fā)光酶聯(lián)免疫分析么要求？HRP的常用底物有哪些？AP的常用底物有哪些？-D-半乳糖苷酶的常用底物有哪些？青霉素酶的常用底物有哪些？ 思考題思考題些？化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析常用的發(fā)光增強(qiáng)劑有哪些？17、最常用于生物發(fā)光酶聯(lián)免疫分析的生物發(fā)光反應(yīng)有哪些？ 思考題思考題第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法和IgG連接起來。n最后讓酶與抗酶抗體結(jié)合，通過對底物的作用而揭示在固相載體上待測抗原的存在。第二節(jié)第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附分析法酶聯(lián)免疫吸附分析法光度。n選擇吸光度為1的稀釋度作為酶標(biāo)抗體最適濃度。圖圖7-10 酶標(biāo)抗體濃度的選擇酶標(biāo)抗