第1章核酸的物理化學性質(zhì)ppt課件

1、一、核酸的水解 核酸可被水解的位點有磷酸酯鍵和糖苷鍵，核酸可被水解的位點有磷酸酯鍵和糖苷鍵，其中糖苷鍵更易被水解。其中糖苷鍵更易被水解。 55端端3端端CGA核酸的酸水解 嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定，對酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷定，對酸最不穩(wěn)定的是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵。鍵。DNADNA在在pH1.6pH1.6于于3737對水透析可完全除去嘌呤堿；對水透析可完全除去嘌呤堿；在在pH2.8pH2.8于于100100加熱加熱1h1h，也可完全除去嘌呤堿。，也可完全除去嘌呤堿。 核酸的堿水解 RNA RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，

2、產(chǎn)生核苷酸。的磷酸酯鍵易被堿水解，產(chǎn)生核苷酸。 DNADNA的磷酸酯鍵那么不易被堿水解。這是由于的磷酸酯鍵那么不易被堿水解。這是由于RNARNA的核糖上有的核糖上有2 2OHOH，在堿作用下構成磷酸三酯。，在堿作用下構成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解，產(chǎn)生核苷2 2，3 3環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生環(huán)磷酸酯。該環(huán)磷酸酯繼續(xù)水解產(chǎn)生2 2核苷核苷酸和酸和3 3核苷酸。核苷酸。 DNA DNA普通對堿穩(wěn)定，假設在普通對堿穩(wěn)定，假設在1mol/L NaOH1mol/L NaOH中加中加熱至熱至100 4h100 4h，可以得到小分子的寡聚脫氧核苷，可以

3、得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。酸。核酸的酶水解 水解核酸的酶種類很多。非特異性水水解核酸的酶種類很多。非特異性水解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒解磷酸二酯鍵的酶為磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專注水解磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。專注水解核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有核酸的磷酸二酯酶稱為核酸酶。另外還有非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。非特異水解糖苷鍵的糖苷酶。 核酸酶的分類按底物專注性分類：作用于按底物專注性分類：作用于RNA的稱為的稱為RNA酶酶ribonuclease，RNase；作用于；作用于DNA的稱為的稱為DNA酶酶deoxyribonuclease，DNase。按

4、對 底 物 作 用 的 方 式 可 分 為 核 酸 內(nèi) 切 酶按 對 底 物 作 用 的 方 式 可 分 為 核 酸 內(nèi) 切 酶endonuclease和核酸外切酶和核酸外切酶exonuclease。少數(shù)核酸酶既可內(nèi)切又可外切。少數(shù)核酸酶既可內(nèi)切又可外切。核酸酶的分類核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割的，也有方向切割的，也有35方向方向切割的，分別稱為切割的，分別稱為53外切酶和外切酶和35外切酶。外切酶。還有對特定核苷酸序列部位進展切割的。如還有對特定核苷酸序列部位進展切割的。如:限制限制性核酸內(nèi)切酶性核酸內(nèi)切酶 二、核酸的酸堿性質(zhì)二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)構造特點具有芳香環(huán)構造特點能發(fā)

5、生酮式能發(fā)生酮式/ /烯醇式、氨式烯醇式、氨式/ /亞氨式互變亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性 _ _主要是環(huán)內(nèi)氨基的奉獻主要是環(huán)內(nèi)氨基的奉獻1 1、堿基的解離、堿基的解離ONHNHOON-NHOCH3ONHNHOCH3ON-NHO19.5pK 19.9pK HHONH2NH+NHONH2NNHO-NH2NNH212.5pK 14.6pK HH 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中NNH+NHNNH2NNNHNNH2NNN-NNH214.15pK HH29.8pK NNHNHNH+NH2ONNHNHNNH2ONN-NHNH+NH2ONN-N-NNH2OHHH13.2pK

6、29.6pK 312.4pK 鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子那么結合到鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子那么結合到N7N7上上2、核苷的解離、核苷的解離戊糖可加強堿基的酸性解離戊糖可加強堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.核苷酸的解離核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強的酸性磷酸基使核苷酸具有很強的酸性ROHOHOOPRO-OHOOPRO-O-OOP10.7 1.6pK HH25.96.5pK OHN-CH2OOOHOOPOHNCH2OOHN-CH2OOO-OOPOHNCH2OH11.5pK DNADNA等電點為等電點為4 44.54.5； RNARNA等電點為等電點為2 22.52.

7、5三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 堿基含有共軛雙鍵堿基含有共軛雙鍵 最大吸收峰最大吸收峰260nm左右左右核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷酸。磷即相當于摩爾核苷酸。30.98APWL（ ） ：摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù) A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷分量：每升溶液磷分量 L ：比色杯內(nèi)徑：比色杯內(nèi)徑 OD260的運用：的運用： 1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相當于相當于 50g/ml雙鏈雙鏈DNA 40g/ml單鏈單鏈DNA或或RNA 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸 2.判別核酸樣品的純度判別

8、核酸樣品的純度 DNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8 RNA純品純品: OD260/OD280 = 2.0 含雜蛋白及苯酚，降低含雜蛋白及苯酚，降低 3.判別判別DNA能否變性能否變性四、核酸的變性、復性與雜交四、核酸的變性、復性與雜交( (一一) ) 核酸的變性核酸的變性denaturationdenaturation 1 1、DNADNA的變性：的變性： 在某些理化要素作用下，在某些理化要素作用下，DNADNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。雙鏈解開成兩條單鏈的過程。 某些理化要素破壞了氫鍵和堿基堆積力，某些理化要素破壞了氫鍵和堿基堆積力， 使核酸分子高級構造改動、理化性質(zhì)及使核

9、酸分子高級構造改動、理化性質(zhì)及 生物活性發(fā)生改動。生物活性發(fā)生改動。 不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級構造不變不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級構造不變2 2、變性的本質(zhì)、變性的本質(zhì)降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂磷酸二酯鍵的斷裂DNADNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂 高溫普通高溫普通7575 熱變性熱變性 強酸、堿強酸、堿 酸堿變性酸堿變性 甲醛甲醛AgaroseAgarose中中RNA RNA 尿素尿素PAGEPAGE中中DNA DNA 3 3、變性要素、變性要素 OD260 OD260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下降比旋度下降 浮力密度

10、升高浮力密度升高 酸堿滴定曲線改動酸堿滴定曲線改動生物活性喪失生物活性喪失4、變性后理化性量變化、變性后理化性量變化RNA變性：從螺旋到線團之間的轉(zhuǎn)變變性：從螺旋到線團之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性量變化沒有的變性引起的性量變化沒有DNA明顯明顯完全變性后核酸紫外吸收值添加：完全變性后核酸紫外吸收值添加：天然天然DNA 2540%、RNA 約約1.1%本質(zhì)：堿基暴露本質(zhì)：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收添加的景由于變性或降解引起紫外吸收添加的景象稱增色效應象稱增色效應DNA變性變性5、DNA熱變性的特征熱變性的特征變性過程是變性過程是“躍變式的，而非漸變躍變式的，而非漸變解鏈曲線：延續(xù)加熱解

11、鏈曲線：延續(xù)加熱DNADNA，以溫度，以溫度對對A260A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。線。指增色效應達指增色效應達50%時的溫度時的溫度普通普通DNA Tm 值在值在85 - 90 C之間之間 Tm：DNA變性時，變性時，OD260到達最大值的到達最大值的50%時的溫度時的溫度稱為稱為DNA的解鏈溫度或融解的解鏈溫度或融解溫度溫度(Tm)。大小與大小與G+C含量成正比。含量成正比。1 1DNADNA的均一性：的均一性：2 2G GC C含量：含量： 閱歷公式：閱歷公式： XG+C XG+CTmTm69.369.32.442.443 3介質(zhì)中的離子強度：介質(zhì)中的離子強度： Tm值大小與以下要素有關：值大小與以下要素有關：( (二二) )核酸的復性核酸的復性renaturationrenaturation 變性變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈單鏈重新締合成雙鏈復性。復性。熱變性的熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火這一過程稱為退火(annealing) 。DNA復性復性 分子量越大復性越難；分子量越大復性越難； 濃度越大，復性越容易；濃度越大，復性越容易； DNADNA復性也與它本身組成和構造有關復性也與它本身組成和構造有關 具有很多反復序列具有很多