分子生物學(xué)北京培訓(xùn)內(nèi)部講義（Word）

1、第一部分 DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)一 聚合酶鏈反應(yīng) 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握基本PCR擴(kuò)增方法及PCR反應(yīng)條件優(yōu)化。 【實(shí)驗(yàn)原理】 用PCR方法進(jìn)行的基因擴(kuò)增過程類似于體內(nèi)DNA的復(fù)制過程。主要是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的過程，模仿體內(nèi)的復(fù)制過程，在附加的一對引物之間誘發(fā)聚合酶反應(yīng)。PCR全過程是由變性、模板與引物結(jié)合（復(fù)性）及引物延伸三個步驟組成的不斷重復(fù)的過程。每次重復(fù)的三個步驟稱為一個周期，經(jīng)過2530個周期之后，PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加可達(dá)106 107。目前，人們已根據(jù)各種用途設(shè)計了不同的特殊PCR，本實(shí)驗(yàn)介紹的是經(jīng)典PCR技術(shù)。 【實(shí)驗(yàn)材料】（一 ）模板DNA： 模板可以是單鏈或雙鏈；

2、可以是染色體DNA；亦可以是克隆的質(zhì)粒DNA。本實(shí)驗(yàn)使用克隆的質(zhì)粒pCDNA3.1-FHL2 (1g/l)經(jīng)100倍稀釋作為模板。表 PCR反應(yīng)體系模板量以50ul PCR 反應(yīng)體系為例人基因組DNA0.11g大腸桿菌基因組DNA10100ng質(zhì)粒DNA0.110ngDNA0.55ng（二 ）2×Taq PCR MasterMix: 0.1 U Taq Polymerase/µl，500 M dNTP each，20 mM Tris-HCl (pH8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl2，其它穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑，使用終濃度為1×PCR buffer。適用于

3、常規(guī)PCR反應(yīng)、復(fù)雜模板如GC含量高（>60%），有二級結(jié)構(gòu)等的擴(kuò)增和大規(guī)?；驒z測。（三 ）引物： PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設(shè)計。1 / 851. 引物序列：本實(shí)驗(yàn)PCR 擴(kuò)增片段FHL2大小約851bp。P1（FHL2-M1）：5'- gga tcc gt atg act gag cgc ttt gac tg -3'P2（FHL2-M2）：5'- gcg gcc gc tca gat gtc ttt ccc aca gtc -3'2. 引物的濃度 公司合成的引物通常為干粉，使用前應(yīng)先離心，然后再打開管蓋溶解。通常配成貯存液

4、濃度100pmol/ul，-20保存，使用濃度10pmol/ul，使用終濃度0.4pmol/ul。3. 引物稀釋計算示例：例一： 假設(shè)引物合成量為1 OD，配成貯存液濃度100pmol/L ；引物長度20nt ；A/G/C/T平均分子量為324；因此，總分子量：20×324=64801OD260=33ug，引物濃度為 33ug/6480=0.0050925 um=5.0925nm =5092.5pm 引物稀釋：5092.5pm/100pM=50.9ul，即用50.9ul去離子水溶解，貯存濃度為 100pmol/ul。 例二：直接法計算貯存濃度為100pmol/ul。預(yù)稀釋引物的微升數(shù)

5、（ul）=OD數(shù)×33×10000引物分子量 【實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件設(shè)置】 1循環(huán)溫度及參數(shù)設(shè)置 典型的PCR循環(huán)由三部分組成： 模板熱變性 退火 寡核苷酸延伸 變性溫度與時間: 由G+C含量決定； 由DNA分子長度決定 退火溫度與時間: 取決于引物的長度、濃度和G+C含量。引物長度為1525時，退火溫度可選用Tm -5，時間30sec。 延伸溫度與時間: 72 10min。 循環(huán)數(shù)一般以2030次為宜。 【實(shí)驗(yàn)器材】0.2ml PCR管 0.5離心管2400/ 9700 PCR擴(kuò)增儀 冰盒臺式離心機(jī) 水平式凝膠電泳設(shè)備 【實(shí)驗(yàn)步驟】 一、配制PCR反應(yīng)體系 1按25µl

6、 PCR反應(yīng)體積配制反應(yīng)混合液，用0.2ul PCR反應(yīng)專用薄壁管，按下列程序依次加入試劑(裝有2×Taq PCR MasterMix的PCR管為反應(yīng)管)，注意：模板DNA最后加，防止污染。成分加量（ul）終濃度模板10.110ngM1（上游引物）10.4pmol/LM2（下游引物）10.4pmol/L2×Taq PCR MasterMix12.51×Taq PCR MasterMixH2O 9.5補(bǔ)水至25 ul總體積 25 ul二、PCR反應(yīng)條件2將上述液體混合，短暫離心以集中液體，置PCR儀依下述條件進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)預(yù)變性變性退火延伸總延伸循環(huán)周期194

7、 5min12941min 60 40sec7240sec3337210min1注意：反應(yīng)結(jié)束后，如不立即使用，可將樣品于-20暫時保存。三、 電泳觀察結(jié)果配制0.8%瓊脂糖凝膠。往25µl PCR產(chǎn)物中加入10×上樣緩沖液4µl，取5µl上樣進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增DNA特異片段大小約851bp。其余樣品用于實(shí)驗(yàn)三 “PCR產(chǎn)物回收”。 【注意事項】 PCR反應(yīng)體系中的任何一個成分，對其結(jié)果都是非常重要的。由于PCR是以指數(shù)方式擴(kuò)增，極微量的DNA污染都可能造成假陽性結(jié)果，因此反應(yīng)體系的干凈程度是非常重要的。需要實(shí)驗(yàn)者在操作中加以注意。1.

8、 合理分隔實(shí)驗(yàn)室 根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室不同的條件科分為樣品的處理、配制反應(yīng)液、循環(huán)擴(kuò)增及產(chǎn)物的鑒定四部分。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。2 分裝PCR試劑 所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，-20保存。3. 設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?為確保結(jié)果的可肯定性，每次反應(yīng)都應(yīng)有設(shè)置嚴(yán)格的對照。陽性對照：陽性模板；陰性對照：不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照；空白對照（或試劑對照）：一管不加模板的試劑對照。4. 防止操作人員污染 盡量一次性使用手套、吸頭、離心管。選擇質(zhì)量好的PCR反應(yīng)管，打開離心管前應(yīng)先離心，開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。5. 加樣器 由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或

9、粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因此吸樣要慢，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠造成污染。設(shè)置專用的加樣器用于PCR，這套加樣器不能用于PCR的反應(yīng)產(chǎn)物分析。實(shí)驗(yàn)二 水平式瓊脂糖凝膠電泳電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的首選標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)制膠的材料可分為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠兩類。瓊脂糖凝膠分離度不如聚丙烯酰胺凝膠，但分離范圍廣，約100bp60kb的DNA分子，且操作簡便。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)介紹水平式瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。瓊脂糖凝膠濃度的變化形成大小不同的分子篩網(wǎng)孔，可分離不同分子量的核酸片段。 【實(shí)驗(yàn)原理】 各種生物大分子在一定的pH值條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中向相反電極

10、移動。瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液，凝固后，形成一種固體基質(zhì)，DNA分子沿其雙螺旋骨架兩側(cè)帶有富含負(fù)電荷的磷酸根殘基，接通電場后，在中性pH條件下帶負(fù)電荷的DNA分子由負(fù)極向正極遷移。不同長度的DNA 片段會表現(xiàn)出不同的遷移率，當(dāng)DNA長度增加時，來自電場的驅(qū)動力和來自凝膠的阻力之間的比率就會降低，DNA分子越大，摩擦阻力越大，越難于在凝膠孔隙中穿行，因而遷移的越慢，據(jù)此，DNA分子可以在凝膠中獲得有效分離并測得其分子量大小。 該過程可通過示蹤染料或分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。 凝膠電泳不僅可以分離不同分子量的DNA，也可以鑒別分子量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。

11、在抽提質(zhì)粒DNA分子中，由于各種因素影響，質(zhì)粒DNA分子存在閉環(huán)（I型）、開環(huán)（型）和線性（型）三種構(gòu)型，三者之間遷移速率一般為I型>型>型。有時也會出現(xiàn)相反的情況，I型共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA常態(tài)下為負(fù)超螺旋，當(dāng)溴化乙錠嵌合在DNA堿基對之間時，I型DNA負(fù)超螺旋逐漸解開，其分子半徑增加，遷移速率下降，當(dāng)溴化乙錠濃度達(dá)到臨界濃度時，不再有超螺旋，I 型DNA遷移率達(dá)到最小值，當(dāng)溴化乙錠濃度繼續(xù)增加時，形成正超螺旋，DNA分子遷移速率迅速增加。同時，由于電荷的中和，也由于溴化乙錠賦予DNA較大的剛性，型和型DNA遷移速率有不同程度的減少。 提取的質(zhì)粒DNA樣品中，如還有染色體DNA、RN

12、A或蛋白，在瓊脂糖凝膠電泳中也可以觀察到，如蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合，在點(diǎn)樣孔內(nèi)產(chǎn)生熒光亮點(diǎn)，提取的質(zhì)粒DNA如有RNA未被處理完全，在DNA條帶前方有云霧狀的亮帶，由此可分析樣品的純度。 【實(shí)驗(yàn)材料】（一）儀器 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 水平式凝膠電泳槽 紫外檢測儀 凝膠成像系統(tǒng)及凝膠圖象分析軟件（二）試劑15×TBE（1L）：54.0g Tris ；27.5g硼酸 ；20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，用時10×稀釋，使用終濃度0.5×TBE。2溴化乙錠（EB）：用水配制成10mg/ml的貯存液，分裝，避光，4保存。310×上樣緩沖液： 0.25%

13、(W/V)溴酚藍(lán)；0.25%(W/V)二甲苯青FF；50% (W/V)甘油；10mM EDTA，4保存。4電泳級瓊脂糖 5. D2000 標(biāo)準(zhǔn)分子Maker（TIANGEN公司） 【實(shí)驗(yàn)方法】（一）制備瓊脂糖凝膠1. 準(zhǔn)備電泳槽 選擇合適的水平式電泳槽，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢查穩(wěn)壓電源與正負(fù)極的連接線路。2. 配膠 根據(jù)所需濃度稱取一定量瓊脂糖加入，量取所需的電泳緩沖液（如：0.5×TBE）倒入三角燒瓶中，加熱。凝膠加熱時間不宜過長，以免引起暴沸；如蒸發(fā)過多應(yīng)補(bǔ)充部分緩沖液。凝膠濃度選擇參照表2.1。3. 倒膠 待凝膠冷至50左右時（手感容器能耐受），在凝膠中加入EB至終濃度0.5

14、g/ml，搖勻后緩緩倒入制膠模中，迅速放好梳子。凝膠的厚度在35mm之間。避免產(chǎn)生氣泡，尤其梳子周圍不能有氣泡，若有氣泡，可用吸管小心吸去。4. 凝膠條件 凝膠通常需要在室溫中放置3045min。低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠或低濃度凝膠應(yīng)放4冰箱，加速凝固，增強(qiáng)硬度。5加電泳緩沖液 凝膠完全凝固后，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，液面應(yīng)高出凝膠表面1mm，這樣凝膠兩端的電壓幾乎與外加電壓相等，電泳效率高。6拔梳子 小心移去梳子和瓊脂糖凝膠隔離板，保持點(diǎn)樣孔完整。（二）加樣 將DNA樣品管中加入其1/10體積的10×加樣緩沖液，混合均勻，短暫離心以集中樣品，用移液器逐一加至每個加樣孔中。如果

15、DNA樣品體積太小，可先稀釋樣品，再加加樣緩沖液加樣。加樣時Tip頭不必插入孔中，可對準(zhǔn)加樣孔，在孔的上方加樣，樣品會沉入孔內(nèi)。同時，根據(jù)待分離片段的大小選擇不同的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)作對照，同時起標(biāo)識樣品順序的作用。（三）電泳 接通電源線，開啟電源開關(guān)，觀察正負(fù)兩極是否有氣泡出現(xiàn)，如負(fù)極氣泡比正極多，則表示電泳槽已經(jīng)接通電源。電泳起始需先采用高壓（80100V），待電泳幾min后溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠中，調(diào)整電壓至15V/cm（按兩極間距離計算）繼續(xù)電泳。電泳時間視具體樣品而定，一般需要>30min。注：點(diǎn)樣孔處于電泳槽的陰極端。制備較好的電泳圖譜需小電壓長時間甚至過夜。（四）觀察 核酸與

16、溴化乙錠結(jié)合后，在UV燈下發(fā)橘紅色熒光。如制備凝膠時加入溴化乙錠，則可隨時觀察DNA條帶的遷移位置，如沒加溴化乙錠則根據(jù)溴酚藍(lán)指示劑在凝膠中的遷移距離判斷何時終止電泳，染色。分離大片段DNA或長時間電泳時溴酚藍(lán)可泳出凝膠。（五）照相及圖像分析 照相及結(jié)果分析是一個關(guān)鍵步驟。現(xiàn)有的凝膠成像分析系統(tǒng)鏡頭前加裝近攝裝置和紅色或橘紅色濾光片以消除背景。配備專門的圖像分析軟件。四、注意事項（一）凝膠濃度的選擇 不同濃度的凝膠可以分辨范圍廣泛的DNA分子，一般情況可參照表1選擇凝膠濃度。表1 凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍（kb）凝膠中的瓊脂糖含量%( W/V) 線狀DNA分子的有效分離范圍(kb)0

17、.3 5.0600.6 1.0200.7 0.810 0.9 0.5 7 1.2 0.4 6 1.5 0.2 3 2.0 0.1 2 染色 熒光染料溴化乙錠（EB）是核酸的染色劑，它與DNA形成熒光絡(luò)合物，用低濃度的溴化乙錠（0.5g/ml）對凝膠進(jìn)行染色，可確定DNA在凝膠中的位置。而發(fā)射的熒光強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估計出待測樣品的濃度。溴化乙錠是一種強(qiáng)誘變劑，有毒性，使用含有該染料的溶液時必須帶手套，注意防護(hù)。實(shí)驗(yàn)室使用溴化乙錠染色方法一般有2種方法： 在凝膠中加入EB至終濃度0.5g/ml，這是實(shí)驗(yàn)室常用的方法 ；電泳結(jié)束后，取出凝膠放入含有0.5

18、g/ml EB的電泳緩沖液（或雙蒸水）中染色1030min。 無污染染料SYBR Green 、，使用稀釋比例1：10，000。經(jīng)SYBR Green染色的凝膠幾乎不呈現(xiàn)背景熒光，300nm紫外照射透視下，與雙鏈DNA結(jié)合的SYBR Green呈現(xiàn)綠色熒光，單鏈DNA顏色為橘黃。 上樣緩沖液 上樣緩沖液的目的有3個：增加樣品密度，以確保DNA樣品均勻進(jìn)入點(diǎn)樣孔內(nèi)（含蔗糖、聚蔗糖400和甘油等）；使樣品呈現(xiàn)顏色（溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色，二甲苯青呈綠色），使加樣操作便利；DNA電泳時前沿指示劑，因溴酚藍(lán)在不同濃度的凝膠中遷移速度基本相同，二甲苯青在凝膠中遷移率比溴酚藍(lán)慢，以0.5×TBE作電泳緩

19、沖液時，溴酚藍(lán)的遷移速率約與300bp 雙鏈DNA分子相同，而二甲苯青約與4Kb雙鏈DNA分子相同，遷移速率與膠的濃度關(guān)系不大?？梢詤⒄罩甘緞┑倪w移情況決定是否停止電泳。 DNA 樣品的點(diǎn)樣量 正確估計DNA樣品的點(diǎn)樣量決定于兩方面因素：一是DNA樣品條帶的濃度，點(diǎn)樣量太多易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象或DNA條帶輪廓不清晰，點(diǎn)樣量太少UV燈下難以辨認(rèn)，影響結(jié)果判定。一般來說，電泳結(jié)果在紫外燈下可用肉眼分辨低至0.1g的DNA條帶，如在紫外燈下拍照，只需510ng DNA就可從照片上比較鑒別；二是DNA樣品的容積，每孔最大加樣容積由加樣孔大小決定，若樣品容積大于凝膠孔容積會導(dǎo)致樣品溢出，流入臨近樣品孔造成樣品

20、交差污染，影響結(jié)果分析。解決的方法是將凝膠制厚一點(diǎn)，或用乙醇沉淀濃縮DNA。 電泳條件1.電泳緩沖液 常用的電泳緩沖液為Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三種緩沖體系，以保證較穩(wěn)定的pH值。TAE的緩沖能力較弱，長時間電泳后陽極變?yōu)閴A性，陰極變?yōu)樗嵝?，因此長時間使用需循環(huán)或更換緩沖液。TBE和TPE緩沖能力較強(qiáng)，可重復(fù)使用數(shù)次，但用TPE配制的凝膠，尤其是低熔點(diǎn)凝膠，回收的DNA片段中含有較高的磷酸鹽，易與DNA一起沉淀而影響下面的一些酶反應(yīng)。故我們推薦以TBE緩沖液作為首選電泳緩沖液。這些緩沖液中均加入EDTA，目的在于螯合二價離子，抑制DNA酶以保

21、護(hù)DNA。電泳緩沖液常采用偏堿或中性pH值，使DNA分子帶負(fù)電荷，向正極泳動。2電壓 低電壓時，線狀DNA分子的遷移速度與電壓成正比，但隨著電場強(qiáng)度的增加，大分子量的DNA片段的遷移率就不再與電壓成正比。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大，一般凝膠電泳的電場強(qiáng)度不超過5v/cm，對于大分子量真核基因組DNA分子的電泳常采用0.51.0v/cm電泳過夜，以取得較好的分辨力和整齊的帶型。 3電場方向 如果電場方向保持不變，則長于50100kb的DNA分子在瓊脂糖凝膠上的遷移速率相同。但是，如果電場方向呈周期性改變，則DNA分子被迫改變路徑。由于DNA分子越大為適應(yīng)新的電場方向而重新排列所需

22、時間就越長，因此可以通過脈沖電場凝膠電泳來分辨極大的DNA分子（達(dá)到10 000Kb）。4電泳溫度 溫度對電泳的影響不太嚴(yán)格，在瓊脂糖凝膠電泳中不同大小的DNA片段的相對遷移率在4與30之間不發(fā)生改變。瓊脂糖凝膠電泳一般在室溫進(jìn)行，但是瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%或低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠較為脆弱，電泳宜在4下進(jìn)行，此時它們強(qiáng)度較大。實(shí)驗(yàn)三 PCR產(chǎn)物的回收【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含未結(jié)合的Taq酶、寡核苷酸引物、dNTPs、引物二聚體等，常常影響隨后的連接反應(yīng)，因此，有必要對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。 【實(shí)驗(yàn)材料】 一、試劑 TIANGEN Midi Purification Kit普通瓊脂糖凝膠

23、DNA回收試劑盒（TIANGEN公司，目錄號：DP209） 試劑盒成分 本實(shí)驗(yàn)使用量本實(shí)驗(yàn)分裝量 溶膠液PN 參照每位實(shí)驗(yàn)者所切凝膠塊的大小， 每10mg凝膠使用10ul Binding Solution1000ul 平衡液BL 500ul600 ul漂洗液PW(用前加無水乙醇) 700ul+500ul750ul×2 去離子水 20ul300ul 吸附柱CA2 1個1個 收集管（2 ml） 1個1個 1.5ml離心管 3個4個 二、其它試劑、耗材及儀器無水乙醇0.8% 瓊脂糖凝膠及凝膠電泳設(shè)備、0.5×TBE buffer50水浴13，000rpm臺式離心機(jī) 【用 途】 從

24、TBE或TAE 瓊脂糖凝膠中回收DNA片段。 從PCR反應(yīng)溶液中回收DNA，去除反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)。 從高熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖中回收DNA。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 （從瓊脂糖凝膠中回收DNA）（一） 準(zhǔn)備含有DNA片段的凝膠 1.行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開。紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀切下含所要回收DNA的瓊脂塊，放入1.5 ml離心管中，稱重膠塊。注意：判定DNA片段的位置時，要盡可能使用長波長UV，在UV下照射的時間應(yīng)盡可能短；此回收凝膠塊如不馬上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可放4或-20保存一周。2.柱平衡步驟：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500

25、81;l平衡液BL，12,000 rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。3.按每10mg 瓊脂糖凝膠加入30 µl溶膠液PN，50水浴放置10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾min，直至膠塊完全溶解（若膠塊的體積過大，可事先將膠塊切成碎塊）。注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谳^高溫度時結(jié)合DNA的能力較弱。（二）結(jié)合DNA4.將吸附柱插入2 ml收集管中。5.將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到柱中，室溫放置2min。6.室溫，12,000 rpm離心3060sec7

26、.取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中。注意：吸附柱容積為800 l，若樣品體積大于800 l可分批加入。（三）漂洗8. 向吸附柱CA2中加入700 l漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），室溫離心12,000 rpm×1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測序，建議PW加入后靜置2-5min再離心。9向吸附柱CA2中加入500 l漂洗液PW，室溫離心12,000 rpm×1min，倒掉廢液。10將吸附柱CA2放回收集管中，室溫離心12,000 rpm

27、15;2min。，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置30sec，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。 注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。（四）洗脫DNA11將回收柱放入一新的1.5ml離心管中。12將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20l去離子水，（如果回收的目的片段>10 kb，則洗脫緩沖液EB應(yīng)置于6570水浴預(yù)熱），室溫放置2min。室溫離心12,000 rpm×2min ，收集DNA溶液。實(shí)驗(yàn)中如果回收樣品多，擔(dān)心混淆，可在回收柱上作好標(biāo)記。13. 為了提高DNA的回收量，將離心得到的溶液重新

28、加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟12。注意：DNA也可以用緩沖液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脫。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，以防DNA降解。14棄去柱子，離心管中的液體即為回收的DNA片段，作好標(biāo)記，可立即使用，或于-20保存?zhèn)溆谩?5. 本實(shí)驗(yàn)取3ul上述回收產(chǎn)物行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，參照Marker定量，接實(shí)驗(yàn)四進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)四 DNA連接反應(yīng)-利用 pGM-T載體進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握

29、PCR產(chǎn)物克隆方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組（又稱DNA克?。NA重組技術(shù)是分子克隆的基本技術(shù)，其關(guān)鍵步驟為在DNA連接酶的作用下將載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容簡介】 本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)四中回收的PCR 片段克隆入載體pGM-T。由于大部分耐熱聚合酶反應(yīng)時都會在PCR產(chǎn)物的3端添加一個A，可與pGM-T 3端的T互補(bǔ)連接。如果是使用pfu等高保真聚合酶擴(kuò)增的不帶A末端的片段，應(yīng)使用平末端連接試劑盒先加A末端后再連接。pGM-T載體介紹 pGM-T是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，由EcoR V線性化，在兩側(cè)的3端添加T而成。載體中有多克隆位點(diǎn)和-

30、半乳糖苷酶閱讀框，可根據(jù)互補(bǔ)原理，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，判斷載體中有無外源基因的插入（白色克隆為陽性重組克隆，藍(lán)色的為載體自環(huán)連接的克?。寺『?，可使用通用引物T7、SP6進(jìn)行測序。圖5.1 pGM-T 載體環(huán)形圖譜及相關(guān)的序列位點(diǎn) 【實(shí)驗(yàn)材料】 pGM-T克隆試劑盒（TIANGEN公司，目錄號：VT302-01）試劑盒成份使用量本實(shí)驗(yàn)分裝量（ul）pGM-T載體(50ng/ul)50ng2.0T4 DNA Ligase (3U/ul)3U1ul2×Rapid Ligation Buffe1×7 ul滅菌去離子水300ul 試劑盒中可選擇使用的試劑：10×Rapid

31、Ligation Buffe（本次實(shí)驗(yàn)不選用） 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1連接反應(yīng)體系 本實(shí)驗(yàn)T4 DNA Ligase 1 ul 已分裝至離心管，連接反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時，此管即作為各組反應(yīng)管，所需其它試劑由學(xué)員依次加入此管。（1）將載體在冰上融化（盡可能避免反復(fù)凍融載體，在初次使用時最好分裝成小份，每次使用時取出一份），短暫離心裝有載體的離心管，以免液體掛在管壁上。（2）按照下表的內(nèi)容往裝有T4 DNA Ligase的離心管中加入各種成分，載體與片段的摩爾比控制在1：3或3：1，請根據(jù)凝膠電泳或紫外分光光度計檢測后的濃度及載體與片段分子大小來計算其摩爾比。加入過多的片段反而會干擾連接反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)管（ul）p

32、GEM-T Easy Vector 12×Rapid Ligation Buffer5T4DNA ligase1PCR產(chǎn)物*滅菌去離子水* 總體積用去離子水補(bǔ)至10ul2 反應(yīng)條件 輕輕彈動離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心，4連接過夜。反應(yīng)結(jié)束后，可暫時放-20保存。 【注意事項】1載體和插入片段的摩爾濃度比 一般采用提高DNA的濃度來增加重組的比例，但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高，反應(yīng)體積太小(即濃度太大)時，連接效果也很差，這可能是分子運(yùn)動受到阻撓；當(dāng)DNA連接濃度太低與連接體積太大也易于造成DNA的自連。我們在實(shí)驗(yàn)中采用目的基因與載體的比通常為3：1或1：3，變化范圍可為8：11：16。插入片

33、段的長度和序列的變化會影響和同一載體的連接效果。每一個連接反應(yīng)最好作幾個實(shí)驗(yàn)梯度，來選擇最佳的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在最小的反應(yīng)體積中（10l），通常一個連接反應(yīng)用1050ng的載體DNA。載體和插入片段比推薦使用公式如下：ng of vector×kb size of insert×Insert ：vector molar rationg of insertkb size of vector2連接反應(yīng)均為微量操作，要注意取樣的準(zhǔn)確性，不要漏加溶液，反應(yīng)中所用的Eppendorf管與Tip應(yīng)一次性使用并于實(shí)驗(yàn)前高壓滅菌。3取酶時，應(yīng)把酶放在冰盒，用完立即放回-20冰箱保

34、存。吸酶時Tip要從溶液的表面吸取。4連接酶反應(yīng)緩沖液（10× Rapid Ligation Buffer或2× Rapid Ligation Buffer）含支持連接反應(yīng)的輔助因子，如ATP，商品化的緩沖液購買后，最好先分裝，20保存，以減少反復(fù)凍融的次數(shù)。實(shí)驗(yàn)五 轉(zhuǎn)化反應(yīng) 【實(shí)驗(yàn)原理】 轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R,M),它可以包容外源DNA分子

35、進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2)等化學(xué)試劑法)的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent Cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有外源DNA分子的受體細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)室常用的感受態(tài)細(xì)胞有兩大類，即化學(xué)感受態(tài)及電轉(zhuǎn)感受態(tài)。電轉(zhuǎn)感受態(tài)需配備相應(yīng)的儀器。本實(shí)驗(yàn)室通常使用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。目前常用的制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法。本實(shí)驗(yàn)使用的感受

36、態(tài)細(xì)胞為TOP10，轉(zhuǎn)化效率108cfu/ug?？蓾M足一般的分子克隆實(shí)驗(yàn)。 【實(shí)驗(yàn)材料】 儀器及耗材 超凈臺、平皿、 玻璃涂棒、試管、Eppendof管、Tip尖 試劑1LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨（bacto-trptone） 10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g NaCl 10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用5mol/L NaOH（約0.2ml）調(diào)節(jié)PH值至7.0，加入去離子水至總體積為1L，在15磅(1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。2氨芐青霉素

37、（Ampicillin） 貯存濃度100 mg/ml,20保存，使用濃度100ug/ml。3LB平板（含Ampicillin,Amp+） 先按上述配方配制液體培養(yǎng)基，臨高壓滅菌前加入細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂（bacto-agar），15g/L，在15磅(1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min。從高壓滅菌器中取出培養(yǎng)基時應(yīng)輕輕旋動以使熔解的瓊脂能均勻分布于整個培養(yǎng)基溶液中。必須小心，此時培養(yǎng)基溶液可能過熱，旋動液體會發(fā)生暴沸。應(yīng)使培養(yǎng)基降溫至50，方可加入不耐熱的抗生素（如Ampicillin），為避免產(chǎn)生氣泡，混勻培養(yǎng)基時應(yīng)采取旋動的方式，然后可直接從燒瓶中傾出培養(yǎng)基鋪制平板。90m

38、m直徑的培養(yǎng)皿約需3050ml培養(yǎng)基。將平皿蓋斜蓋在盛瓊脂的底板上，使瓊脂變硬冷卻至室溫，蓋好，放入4可保存一個月。40.1M IPTG貯存液：稱1.2g IPTG，加去離子水至50ml，濾過除菌，分裝成1ml小份貯存于-20。5X-Gal貯存液：100mg X-Gal用2ml二甲基甲酰胺溶解，用鋁泊紙包裹避光、20保存24月。X-Gal貯存液無須過濾除菌。6LB平板（含Ampicillin/IPTG/X-Gal） 參照3配制LB平板（含ampicillin），取100ul 100mM IPTG和20ul 50mg/ml X-Gal，混勻，加到平皿表面，涂布均勻，放37正向放置吸收30min，

39、用于重組子篩選鑒定。7SOC培養(yǎng)基(TIANGEN公司pGM-T克隆試劑盒中自帶) 在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中可用LB液體培養(yǎng)基替代8TOP10感受態(tài)細(xì)胞（TIANGEN 公司） （1）用于化學(xué)轉(zhuǎn)化； （2）可與-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。 【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 取-70下保存的40ml Top10感受態(tài)細(xì)胞兩管，置于冰上，完全解凍后輕輕地將細(xì)胞均勻懸浮。分別標(biāo)記 ，為實(shí)驗(yàn)四中各實(shí)驗(yàn)組連接反應(yīng)產(chǎn)物，為由本實(shí)驗(yàn)室提供的陽性對照。2. 兩管分別加入上述連接反應(yīng)產(chǎn)物及陽性對照3ml(連接產(chǎn)物的加入量不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一），輕彈管底使之混勻。注意：不要用力吹打。3. 冰上放置30min。4

40、. 42水浴中放置90sec。（此步驟要求42溫度準(zhǔn)確，水浴過程中不要搖動。）5. 快速將管轉(zhuǎn)入冰浴放置23min。6. 加500ml SOC或LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，37 150200rpm振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。7. 取500ml上述菌液加入90mm LB平板中(含抗生素、IPTG、X-gal)，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。8. 待平板表面干燥后，倒置平板，37培養(yǎng)過夜(12-16小時)。注意：培養(yǎng)時間不要超過16小時，否則會產(chǎn)生衛(wèi)星菌落（雜菌）9. 結(jié)果分析：取出培養(yǎng)板，觀察菌落生長情況。白色菌落為所要菌落，藍(lán)色菌落為自環(huán)或不含重組子

41、的菌落。隨機(jī)挑選白色菌落進(jìn)行重組子鑒定（接實(shí)驗(yàn)六）；如暫時不做，可用石蠟?zāi)し饪冢?保存，一月之內(nèi)使用。 【注意事項】 1感受態(tài)細(xì)胞置于-70保存，不可反復(fù)凍融。 2. 轉(zhuǎn)化過程中陰性對照、陽性對照是非常必要的，在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題時可以更快地找到原因。 3. 建議留下部分連接產(chǎn)物，在出現(xiàn)問題后能迅速的補(bǔ)救，減少不必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 4. 涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)作相應(yīng)調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300 l轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心（4,000rpm，2min）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后將其涂布

42、于一個平板中（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）。 5細(xì)菌培養(yǎng)超過16小時長出的菌落視為雜菌。 6藍(lán)/白斑篩選的平皿4放置幾小時后，可使藍(lán)色顯色更清楚。實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒DNA的小量提取 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?細(xì)菌質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的雙鏈DNA分子。通常提取細(xì)菌質(zhì)粒用做克隆載體、是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌大量擴(kuò)增和表達(dá)的媒介物。提取質(zhì)粒DNA的目的是將細(xì)菌質(zhì)粒DNA與菌體染色體DNA分開，去除菌體殘片及蛋白，以獲取質(zhì)粒DNA?，F(xiàn)有提取方法很多，各有利弊，可根據(jù)菌株類型，質(zhì)粒大小及應(yīng)用提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行何種實(shí)驗(yàn)等具體情況選擇實(shí)施。本實(shí)驗(yàn)將介紹目前被廣

43、泛采用的堿變性法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。在pH1212.5這個范圍內(nèi)，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性和復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。本實(shí)驗(yàn)所用試劑盒沿用傳統(tǒng)的SDS堿裂解法，結(jié)合硅基質(zhì)膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。 【應(yīng) 用】 本實(shí)驗(yàn)提取質(zhì)粒DNA可用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 【實(shí)驗(yàn)材料】 一、試劑盒組成 以TIAGEN公司TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒（目錄號：DP103）為例。成分分裝量使用量RNaseA(10 mg/ml)已加入到溶液P1平衡液BL600 ul50

44、0 ul溶液P1300 ul250 ul溶液P2300 ul250 ul溶液P3400 ul350 ul漂洗液PW（用前參照說明書加無水乙醇）750ul×2 750ul +500ul吸附柱CB31個1個收集管（2 ml）1個1個去離子水300ul20ul1.5ml 離心管3個3個0.5ml 離心管1個1個試劑盒中帶有的其他試劑（本次實(shí)驗(yàn)不用）：去蛋白液PD，洗脫緩沖液EB二、其它試劑、儀器及耗材1LB培養(yǎng)基（Ampicillin,Amp+） 使用之前，加入氨芐青霉素。2氨芐青霉素（Ampicillin,Amp）：用去離子水配制成100mg/ml, 20保存。使用濃度100ug/ml。

45、3儀器及試驗(yàn)耗材 恒溫?fù)u床；臺式離心機(jī) （離心力14，000g）；紫外分光光度計；電泳設(shè)備；紫外檢測儀 ；1.5/0.5ml Eppendorf管；Tip尖；試管架；移液器。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 一、細(xì)胞培養(yǎng)：隨機(jī)調(diào)取實(shí)驗(yàn)五中單個、白色菌落，接種到5ml LB培養(yǎng)基（Amp+）中，于37恒溫?fù)u床，200rpm（轉(zhuǎn)/分）培養(yǎng)過夜。 二、小量質(zhì)粒DNA快速提?。ㄒ唬┝呀饧?xì)胞1柱平衡步驟：向吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500 ul的平衡液BL，室溫離心12,000 rpm×1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當(dāng)天處理過的柱子）2收集過夜培養(yǎng)的15ml的細(xì)菌

46、，室溫離心12，000rpm×1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。3沉淀中加入250ul 溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)胞。（注意：此步驟充分懸浮細(xì)胞很重要。）4加入250ul 溶液P2，立即上下顛倒45次，使細(xì)菌裂解充分至溶液變澄清，室溫放置15min。注意：此步驟不要劇烈混搖。 注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片斷。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。5

47、加入350ul 溶液P3，立即上下顛倒45次，此時不要劇烈震動，使之充分中和,此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。6室溫離心，12,000rpm×10min。（二）提取和純化 取出2ml收集管和吸附柱CB3，將吸附柱CB3插入收集管中，在吸附柱壁作好標(biāo)記。7將步驟6中上清全部轉(zhuǎn)到吸附柱里。注意：轉(zhuǎn)移上清時不要吸取沉淀，否則會出現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染。8室溫離心12,000rpm×1min。取下吸附柱，棄去收集管中的廢液。9可選步驟：向吸附柱CB3中加入500 l去蛋白液PD，12,000 rpm (13,400×g )離心3060sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3

48、重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM101， ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5，TOP10等），這步可省略。10將柱子放入同一個收集管中，加入750 µl漂洗液PW。11. 室溫離心12,000rpm×1min。取下吸附柱，棄去收集管中的廢液，將柱子重新插回收集管。12. 重復(fù)洗一遍，加入500 µl 漂洗液PW。室溫離心12,000rpm×1min。13室溫高速離心12,000rpm×2min。盡量去除殘余液體

49、。注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CB3開蓋，置于室溫放置30sec，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。（三）洗脫質(zhì)粒DNA14將吸附柱插入一新的1.5ml離心管中，在離心管壁作好標(biāo)記。在柱子膜中央加25 µl 水，不用蓋上離心管蓋，室溫放置2min，室溫離心12,000rpm×1min。注意: 將去離子水預(yù)熱到50加入洗脫DNA時有利于提高DNA 的洗脫效率。注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，重復(fù)步驟14。 15離心管中洗脫的液體即含有質(zhì)粒DNA，可立即使用或保

50、存于-20或以下溫度備用。 16本實(shí)驗(yàn)課提取的質(zhì)粒DNA用于重組子酶切鑒定。接后續(xù)實(shí)驗(yàn)：接實(shí)驗(yàn)七，酶切質(zhì)粒DNA進(jìn)行重組子鑒定； 瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量； 紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA濃度和純度。三、質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳分析 配制0.8%瓊脂糖凝膠(含0.5ug/ml溴化乙錠)，取2ul質(zhì)粒 DNA進(jìn)行電泳，檢測提取的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。方法：取0.5ml離心管，加2ul質(zhì)粒DNA2ul 10×上樣緩沖液，加入點(diǎn)樣孔電泳。100V電壓使點(diǎn)樣孔的樣品進(jìn)膠，60mV電壓30min電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。 四、紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA含量 取5ul上述質(zhì)粒DNA加600

51、ul去離子水稀釋，在紫外分光光度計下測定A260nm 和A280nm處的吸光值。DNA濃度（ug/ul）=A260×50×稀釋倍數(shù) 100012質(zhì)粒DNA純度 A260nm /A280nm 大約為 1.8左右。若低于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染，可用酚或酚：氯仿：異戊醇抽提；高于2.0疑有RNA污染。3示例：如OD260=0.10，稀釋倍數(shù)為500，則：0.10 × 50 ×500 =2500g/ml 即DNA濃度2.5g /ul 式中“50”系DNA的消光系數(shù)，即1OD A260的DNA相當(dāng)于大約50g/ml。實(shí)驗(yàn)七 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng) 【實(shí)驗(yàn)原理】 遺

52、傳工程中經(jīng)常使用的是II型限制性內(nèi)切酶，它能識別雙鏈DNA分子中某一段特定核苷酸，并在該序列之中切割。有的限制酶在雙鏈DNA 兩條鏈正好相對的位置上切割產(chǎn)生平齊末端，另外一些限制酶在兩條鏈上交錯切割，成為“粘末端”。酶切反應(yīng)需要一個理想的反應(yīng)系統(tǒng)，要有Mg2+做輔助因子，并要有一定的鹽離子濃度，經(jīng)特定反應(yīng)條件后，產(chǎn)生大小不同的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果。 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?初步掌握限制性內(nèi)切酶小量酶切技術(shù)。 【實(shí)驗(yàn)材料】（一）儀器及耗材 水浴鍋或37溫箱；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；水平式凝膠電泳槽；紫外檢測儀；移液器；臺式離心機(jī)；0.5ml Eppendorf管；試管架；Tip尖（110l、2020

53、0l）；冰盒（二）試劑1質(zhì)粒DNA （本實(shí)驗(yàn)六中純化的質(zhì)粒DNA ） 2限制性內(nèi)切酶 EcoR I （12U/ul） -20貯存。3限制性內(nèi)切酶10×H buffer4電泳級瓊脂糖 5滅菌去離子水6溴化乙錠（EB，10 mg/ml） 【實(shí)驗(yàn)步驟】 本次實(shí)驗(yàn)主要介紹小量酶切反應(yīng)。其主要用于質(zhì)粒DNA的酶切反應(yīng)鑒定。典型的反應(yīng)為20l反應(yīng)體積中含有0.21.0g DNA。1 配制酶切反應(yīng)體系：向1支滅菌的新Eppendorf管中依次加入下列試劑，先加滅菌的去離子水：質(zhì)粒DNA*l10×H buffer2lEcoR I 1l去離子水 補(bǔ)去離子水至總體積20l總體積20l 2 經(jīng)離心機(jī)簡短離心混合均勻，集中樣品。3 酶切反應(yīng)條件：37水浴1h。4 終止反應(yīng)：65水浴1015min終止酶切反應(yīng)，樣品置4冰箱備用。5 結(jié)果鑒定：用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切反應(yīng)。 【注意事項】1限制性內(nèi)切酶：注意保持酶的活性，將酶從低溫冰箱中取出后應(yīng)立即置事先準(zhǔn)備好的冰盒中，用后及時放回低溫冰箱；限制酶保存于50%甘油，粘稠，加樣時Tip尖不要過多的插入液體，加后