生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用

1、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用張養(yǎng)軍 錢小紅軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所北京蛋白質(zhì)組研究中心主要內(nèi)容：一、蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展簡介二、蛋白質(zhì)組研究意義三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容四、蛋白質(zhì)組研究中的復(fù)雜性五、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要研究策略六、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用七、蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要技術(shù)挑戰(zhàn)一、蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展簡介蛋白質(zhì)組（proteome）： 一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對應(yīng)的全套蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics)： 研究細(xì)胞、組織或生物體中蛋白質(zhì)組成、定位、變化及其相互作用規(guī)律的科學(xué)。簡要?dú)v史回顧：1994年，澳大利亞的科學(xué)家首次提出蛋白質(zhì)組概念；1995年，蛋白質(zhì)組

2、一詞首次見諸報端；2001年4月，在美國成立了國際人類蛋白質(zhì)組研究組織(Human Proteome Organization, HUPO)，隨后歐洲、亞太 地區(qū)都成立了區(qū)域性蛋白質(zhì)組研究組織，試圖通過 合作的方式，融合各方面的力量，完成人類蛋白質(zhì) 組計劃(Human Proteome Project)；另外，除了相關(guān) 期刊外，創(chuàng)刊了蛋白質(zhì)組學(xué)專門雜志，如 Proteomics、Molecular & cellular proteomics和Journal of proteome research；2002年現(xiàn)在，已經(jīng)舉行了七屆HUPO國際會議和四屆中國蛋 白質(zhì)組學(xué)術(shù)大會。二、蛋白質(zhì)組

3、研究的意義1、一些物種如小鼠、大鼠等基因組測序工作的完 成，特別是人類基因組計劃草圖完成（2001 年），為蛋白質(zhì)組計劃的實施奠定了基礎(chǔ)。蛋白 質(zhì)組的研究不僅是基因組研究的深入和延續(xù)，更 重要的是要回答在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上無法回 答的生物學(xué)問題，比如它們之間的連鎖關(guān)系以及 功能網(wǎng)絡(luò)等。2、作為生命功能的執(zhí)行體蛋白質(zhì)組的研究是 為了從更高層次上深入解讀生命的本質(zhì)和生命 活動的規(guī)律。3、為人類疾病的病理研究、早期診斷、治療以及 藥物開發(fā)提供依據(jù)。三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容1、蛋白質(zhì)組表達(dá)譜 （proteome expression profiling） 針對已有基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體、組織或

4、細(xì)胞，建立相應(yīng)蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。如：Human plasma proteome project；Human liver proteome project。2、蛋白質(zhì)組修飾譜 (proteome modification profiling) 建立生命功能執(zhí)行和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的蛋白質(zhì) 翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫。3、基本生物學(xué)問題 研究與生命活動過程中密切相關(guān)的問題。 比如：Post-translational modification； Protein-protein interaction； Genome-Transcriptome-Proteome。4、臨床應(yīng)用問題 以重要的生命過程或人類一

5、些重大疾病為對 象，進(jìn)行重要的生理和病理體系或過程的研究， 即進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 比如：Disease marker-diagnosis Mechanism of the disease Drug target-therapy 5、蛋白質(zhì)組學(xué)中的新技術(shù)和新方法 建立蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)平臺以及生物信息 學(xué)研究工具。四、蛋白質(zhì)組研究中的復(fù)雜性一種細(xì)胞、組織或生物體有多少蛋白質(zhì)? 人類基因組含有34萬個基因，僅是果蠅 或線蟲的兩倍左右。人體：1個受精卵 1012細(xì)胞，103細(xì)胞類型。 其“蛋白質(zhì)組”隨“時” 、“空” 處于變化之中，而“基因組”則處于永恒于之中。生命體的統(tǒng)一性源于基因組 生命體

6、的復(fù)雜性基于蛋白質(zhì)組五、主要研究策略1、研究基礎(chǔ)（1）生物學(xué)的發(fā)展，特別是基因組測序的 完成為我們提供了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫；（2）生物質(zhì)譜和分離科學(xué)的進(jìn)步為我們提 供了分離和鑒定的必須手段；（3）計算機(jī)技術(shù)的提高，特別是生物信息 學(xué)的發(fā)展為我們處理海量數(shù)據(jù)提供了 有力的支持。2、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法分類（1）蛋白質(zhì)定性分析依據(jù)分析對象是整體蛋白質(zhì)混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白質(zhì)組的定性分析方法分為自下向上法（bottom up,針對多肽混合物）和自上向下法(top down，針對整體蛋白質(zhì)混合物)。 依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中是否存在所鑒定的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組的定性分析方法進(jìn)一步分為： 對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中含有

7、待鑒定的蛋白質(zhì)，包括:肽質(zhì)量指紋譜法（PMF，適合于簡單蛋白質(zhì)混合物);肽序列標(biāo)簽法（PST，適合于復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物） 對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中不存在待鑒定的蛋白質(zhì)，采用從頭測序法（de novo）（2）蛋白質(zhì)組相對定量分析方法 直接進(jìn)行比較，包括SDS-PAGE、2DE、HPLC； 標(biāo)記方法，包括同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽 （ICAT）、元素標(biāo)記親和標(biāo)簽（ECAT）、 同位素氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記(SILAC)和 DYGE技術(shù)； 直接同位素標(biāo)記法，如酶促18O標(biāo)記。 3 蛋白質(zhì)組研究方法進(jìn)展(1)復(fù)雜蛋白質(zhì)組體系 目前對于組織、細(xì)胞和血漿等復(fù)雜蛋白質(zhì)組的分析，均采用多維分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用的方法。（2）簡單的蛋白

8、質(zhì)組體系 對于特定的、簡單的蛋白質(zhì)組分析，既可采用多維分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，也可以采用較少步驟的分離和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。其技術(shù)路線如圖3所示。六、生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用 1、表達(dá)譜構(gòu)建 2、修飾譜構(gòu)建 3、蛋白質(zhì)組定量1、表達(dá)譜構(gòu)建(1) 2DE-MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)平臺 2DE-MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)路線具有分離效率高、直觀和相對定量的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。目前該技術(shù)在我們實驗室已經(jīng)成功地應(yīng)用于胎肝蛋白質(zhì)組、血漿蛋白質(zhì)組和成人肝臟蛋白質(zhì)組等組織和細(xì)胞系蛋白質(zhì)組的研究。2DE-MALDI-TOF/TOF MS技術(shù)平臺 技術(shù)路線特點(diǎn)：成功率(

9、考染): 大于90% 蛋白質(zhì)組雙向電泳zoom膠技術(shù)與MALDI-TOF/TOF MS聯(lián)用 為了獲得更高的分離度，展示更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)，采用ZOOM膠技術(shù)是一個重要的選擇，并通過MALDI-TOF/TOF MS的聯(lián)用，可鑒定更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)。胎肝全蛋白2-DE 表達(dá)譜 共鑒定：601，唯一蛋白質(zhì): 330（2） 多維分離-質(zhì)譜分析技術(shù)平臺構(gòu)建 作為2DE-MS技術(shù)平臺的重要補(bǔ)充，多維分離技術(shù)路線已經(jīng)受到人們的高度重視。 多維液相色譜既可用于整體蛋白質(zhì)預(yù)分離，也可用于多肽混合物的預(yù)分離。與小分子相比，由于蛋白質(zhì)或多肽的理化性質(zhì)（分子量、等電點(diǎn)和疏水性等）的顯著差異，使其在色譜柱中的傳質(zhì)速率和容量因子

10、相差較大，所以在對其進(jìn)行分離時，一般采用梯度洗脫，且色譜峰較寬。整體蛋白質(zhì)分離方法選擇依據(jù)：（1）依據(jù)分子形狀和大小，如超濾、體積排阻等；（2）依據(jù)分子密度性質(zhì)，如蔗糖梯度密度離心技術(shù)；（3）依據(jù)分子等電點(diǎn)不同，如離子交換、色譜聚焦、 等電聚焦；（4）依據(jù)分子疏水性不同，如反相色譜、疏水色譜；（5）依據(jù)親和性不同，如親和色譜；（6）依據(jù)與金屬離子螯合性質(zhì)的不同，如IMAC方法 對磷酸化肽段提?。唬?）依據(jù)特殊化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，如巰基填料選擇性富集 含巰基的肽段。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法用于嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜 合征冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的研究 到2003年5月初，全世界完成全基因組測序并提交到Geneba

11、nk的病毒株已達(dá)到11株，其中包括由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所和中國科學(xué)院基因組研究所提交的BJ01病毒株的全基因組序列。SARS-CoV （BJ01） 基因組基因組預(yù)測的SARS-CoV(BJ01) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 研究意義SARS冠狀病毒基因組序列的測定為SARS病原學(xué)及后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，但基因組全序列的解析并不等于揭示了基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)。依靠生物信息學(xué)的系統(tǒng)分析，可以較為全面地預(yù)測病毒基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)，但是難以洞悉蛋白質(zhì)合成后所發(fā)生的大量的裂解、修飾與定位、轉(zhuǎn)運(yùn)。 研究目的 采用蛋白質(zhì)組學(xué)的策略，通過系統(tǒng)研究SARS冠狀病BJ01 株的天然結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，全面驗證基

12、因組與生物信息學(xué)推測的SARS冠狀病毒的蛋白質(zhì)組及其裂解、修飾的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，為全面揭示SARS的發(fā)病機(jī)理、提供SARS早期診斷及藥物篩選的靶標(biāo)、研制有效的治療藥物提供基礎(chǔ)。N 蛋白質(zhì)肽序列檢索結(jié)果S 蛋白質(zhì)肽序列檢索結(jié)果M 蛋白質(zhì)肽序列檢索結(jié)果N 蛋白質(zhì)肽序列檢索結(jié)果 N蛋白質(zhì)分子量Theoretical:45935DaMeasured: 45929DaDifference: 0.13/1000MALDI-MS 測定N蛋白質(zhì)分子量1 N蛋白降解片段2 完整N蛋白SARS-CoV 攻擊Vero E6細(xì)胞裂解液蛋白質(zhì)HPLC 小結(jié)1、利用蛋白質(zhì)組學(xué)策略，從SARS CoV感染的Vero E6細(xì)胞

13、提取 液中成功鑒定出S、N及M三個結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其中M蛋白首次 在蛋白質(zhì)水平鑒定出來；2、精確測定N 蛋白的相對分子質(zhì)量，證明其氨基末端的第一 個氨基酸-絲氨酸發(fā)生乙?；揎?，提示不存在理論預(yù)測的 磷酸化修飾；3、通過比較表明兩種方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中各具優(yōu)缺點(diǎn)， 可根據(jù)不同目的選擇使用。胎肝線粒體蛋白質(zhì)制備 胎肝組織充分清洗后進(jìn)行勻漿，然后對勻漿液 (2%蔗糖，蛋白質(zhì)酶抑制劑，23g/10ml)進(jìn)行蔗糖密度梯度離心（120000g, 90min）提取線粒體，最后用裂解液（8M urea, 65mM DTT, 40mM Tris）提取全蛋白質(zhì)，25000g離心并過濾后，進(jìn)一步進(jìn)行整體蛋白質(zhì)分離。

14、用ProteomLab PF 2D色譜儀對胎肝線粒體提取液進(jìn)行二維色譜分離示意圖 對胎肝線粒體全蛋白提取液的一維色譜分離 一維色譜分離M2B3餾分的反相色譜分離圖色譜條件：反相柱為4.6mm I.d.´ 35mm, C18, 1.5m; 流速為0.5ml/min; 檢測波長214nm；溶劑梯度：0100B, 60min，100B保持8min，1.0min回到100A平衡色譜系統(tǒng)；每管收集2min。 整體蛋白混合物二維色譜分離實驗結(jié)果：一維色譜聚焦:40個餾分（0.3pH 或5min）二維反相色譜:20個餾分（1.0min）總計:800個餾分。M2C8_21反相色譜餾分酶切液進(jìn)行Mic

15、ro LC-ESI-Ion Trap MS 掃描中保留時間為12.90min時的一級質(zhì)譜圖SEQUEST 處理的結(jié)果判據(jù)：電荷為+1時，Xcorr值2.0；電荷為+2時，Xcorr值2.2；電荷為+3時，Xcorr值3.5；Cn0.1；而且至少2肽段或3個連續(xù)的y或b序列Nano LC-ESI-Q/TOF MSM2B3_18反相色譜餾分酶切液的Nano LC-ESI-Q/TOF MS 一級質(zhì)譜總離子流色譜圖M2B3_18反相色譜餾分酶切液的Nano LC-ESI-Q/TOF MS二級質(zhì)譜四通道總離子流色譜圖M2B3_18反相色譜餾分酶切液中m/z為795肽段的Nano LC-ESI-Q/TOF

16、 MS二級質(zhì)譜的質(zhì)譜圖MASCOT 對數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索結(jié)論一、通過整體蛋白質(zhì)兩維色譜預(yù)分離和毛細(xì)管反相液相色譜質(zhì)譜鑒定方法聯(lián)用，離子阱質(zhì)譜鑒定出478個胎肝蛋白質(zhì)， Q/TOF質(zhì)譜鑒定出319個胎肝蛋白質(zhì)，總計797個胎肝蛋白質(zhì)，其中確定的線粒體蛋白質(zhì)接近20%，在國內(nèi)外人胎肝線粒體蛋白質(zhì)組表達(dá)譜構(gòu)建中首次分離鑒如此之多的蛋白質(zhì)，表明實驗設(shè)計和技術(shù)路線是可行的；二、實驗中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的疏水性、pI值、樣品緩沖液以及數(shù)據(jù)庫的選擇等都會對最終的檢出結(jié)果有影響，因此在進(jìn)行實驗及結(jié)果處理時值得注意。 反相色譜SDS-PAGE-串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)樣本制備方法：稱取成人肝臟組織樣品0.1g，加入提取液（8.0M脲

17、，2.0SDS）2.0mL，超聲(超聲0.5s,停2s，60次)溶解后，離心分離（15000g，40min），取上清備用。反相色譜分離人肝臟蛋白質(zhì)混合物色譜圖A, 第1次制備；B，第32次制備色譜條件：150mm×4.6mm i.d., C8，5mm，30nm; 流速： 0.75mL/min; 檢測波長：214nm；非線性溶劑梯度：100%A (5% aqueous acetonitrile plus 0.1%TFA)10%B(95% aqueous acetonitrile plus 0.1%TFA), 10min; 10%B35%B,10min; 35%B75%B,40min;

18、75%B100%B，8min; 100%B， 5min 100B 100%A, 3min; 平衡 32min后進(jìn)行下一次分離。餾分90中第24條蛋白質(zhì)帶的總離子流色譜圖（A）、相應(yīng)的 一級質(zhì)譜圖（B）和m/z：809離子的串聯(lián)質(zhì)譜圖（C）實驗結(jié)果和討論通過整體蛋白質(zhì)混合物的兩維分離、膠上酶切和提取，得到474個多肽混合物。按上述方法分析，共鑒定出9696條肽段，去冗余后得到2552條肽段，歸結(jié)于402種蛋白質(zhì)和240個蛋白質(zhì)簇。不同蛋白質(zhì)隨pI的分布不同蛋白質(zhì)隨分子量的分布不同蛋白質(zhì)隨疏水性參數(shù)的分布 結(jié)論 通過RPLC-SDS-PAGE與納升毛細(xì)管液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對人肝臟蛋白質(zhì)組表達(dá)

19、譜的構(gòu)建及其理化性質(zhì)的統(tǒng)計分析，表明該技術(shù)路線兼顧了反相色譜分離度高和SDS-PAGE兼容性號的優(yōu)點(diǎn)，可用于復(fù)雜組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的構(gòu)建或比較蛋白質(zhì)組的研究。全程自動化的固相金屬親和色譜反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜磷酸化蛋白質(zhì)分析技術(shù)IMAC毛細(xì)管親和色譜柱的制備 兩通固定濾膜篩板制作法及柱裝填技術(shù) 1，兩通閥 2，毛細(xì)管色譜柱 3，過濾膜 4，連接毛細(xì)管 5，加樣槍 6，刃環(huán)和空心螺母7，勻漿管 8，高壓恒流泵9，旋渦混合器 在100m內(nèi)徑的石英毛細(xì)管中成功裝填進(jìn)了20m粒徑的親和色譜填料 自動化IMAC-RP HPLC-MSMS分析平臺 IMAC-RPHPLC-MSMS分析平臺的測試和優(yōu)化

20、· IMAC柱對磷酸肽吸附的選擇性· 洗脫液類型對質(zhì)譜結(jié)果的影響· Wash buffer對親和選擇性的影響· 甲酯化修飾對親和選擇性的影響IMAC柱對磷酸肽吸附的選擇性樣品：磷酸肽+磷酸酶水解去磷酸化肽段混合物ü 使用磷酸鈉(鉀)溶液洗脫容易生成堿金屬加和峰，使質(zhì)譜圖變得更復(fù)雜而且使肽段的信號分散，離子信號強(qiáng)度減弱ü 用磷酸氨鹽溶液洗脫沒有發(fā)現(xiàn)堿金屬加和峰洗脫液類型對質(zhì)譜結(jié)果的影響 Wash buffer對親和選擇性的影響 ü 含酸性氨基酸殘基的肽段，側(cè)鏈上的羧基也易與金屬離子發(fā)生靜電作用導(dǎo)致非特異性吸附ü 使用

21、高鹽濃度的酸性溶液可減少部分非特異性吸附甲酯化修飾對親和選擇性的影響 ü 對肽段末端及酸性氨基酸殘基的羧基進(jìn)行甲酯化修飾，會提高IMAC親和柱對磷酸肽的親和選擇性 ü 甲酯化反應(yīng)不能完全進(jìn)行，一個肽段上修飾不同數(shù)目甲基的幾種形式會同時存在，分散了肽段的信號強(qiáng)度 ü 產(chǎn)生立體異構(gòu)體，使肽段在反相色譜中的保留也被分裂ü 甲酯化反應(yīng)過程會造成樣本的損失ü 使用要慎重，與常規(guī)方法互補(bǔ)IMAC-RPHPLC-MSMS自動化分析平臺測試結(jié)論n 整個技術(shù)平臺的工作都可以通過儀器參數(shù)設(shè)置和樣品表的編排來自動完成 ，程序控制，全程自動化，便于改變條件優(yōu)化實驗參數(shù)

22、n 用標(biāo)準(zhǔn)肽的分析表明該體系對磷酸肽具有一定的選擇性親和富集能力，采用適當(dāng)?shù)那逑春拖疵撊芤簳岣哂H和提取效率n 對肽段的酸性氨基酸殘基的羧基進(jìn)行甲酯化修飾，會提高IMAC親和柱對磷酸肽的親和選擇性，但可能會造成信號分散和樣本損失 建立了磁性納米材料制備、選擇性富集結(jié)合生物質(zhì)譜分析磷酸肽新方法方法特點(diǎn)：l 修飾過程簡單、快速;l 無樣品損失、高靈敏度；l 可處理飛摩爾-皮摩爾的樣品; l 高通量。應(yīng)用：磁性納米材料制備、選擇性富集結(jié)合生物質(zhì)譜分析磷酸肽新方法已經(jīng)用于鼠肝質(zhì)膜的磷酸化蛋白質(zhì)組分析。 相關(guān)工作已經(jīng)在RCM 和JPR上發(fā)表。生物素酰肼標(biāo)記-親和素純化富集方法的建立及在肝癌細(xì)胞膜糖蛋白研

23、究中的應(yīng)用生物素法富集膜糖蛋白流程圖三個富集技術(shù)路線：肽段水平富集；：蛋白水平富集；：兩次富集(蛋白/肽段)(3000cutoff：3000Da超濾)質(zhì)譜圖顯示糖肽富集效果富集前富集后三條富集技術(shù)路線結(jié)果 HepG2膜糖蛋白分析蛋白水平富集酶切后，其肽段體系復(fù)雜程度和動態(tài)范圍都大大增加，低豐度糖肽的檢出幾率會大大減小，因此，采用肽段水平富集方法。 結(jié)論（1）從蛋白水平富集，對HepG2細(xì)胞膜糖蛋白進(jìn)行研究，共 鑒定 到171個跨膜蛋白， SP庫確認(rèn)其中44個蛋白是糖 蛋白。（2）從肽段水平富集，對HepG2細(xì)胞膜糖蛋白進(jìn)行研究，鑒 定到70個非冗余糖肽，73個糖基化位點(diǎn)，其中3個肽段 各 有2

24、個糖基化位點(diǎn)。糖肽對應(yīng)于48個非冗余糖蛋白。（3）合并蛋白和肽段富集 鑒定結(jié)果，共 83個HepG2膜糖蛋 白，73個糖基化位點(diǎn)，構(gòu)建了HepG2肝癌細(xì)胞膜糖蛋白 數(shù)據(jù)。（4）這些膜糖蛋白主要是一些免疫相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、癌 癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞粘附因子以及膜受體等，參與了炎癥 反應(yīng)、細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種重要生理過程。3、蛋白質(zhì)定量新技術(shù)新方法蛋白質(zhì)定量新技術(shù)新方法蛋白質(zhì)（組）定量的意義(1)作為生命執(zhí)行體的蛋白質(zhì)，通過其定位、修飾和相互作用 發(fā)揮功能作用時都與其量的多少相關(guān)；(2)蛋白質(zhì)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與相對定量方法相關(guān)；(3)蛋白質(zhì)標(biāo)志物的臨床應(yīng)用也涉及到絕對定量方法；(4)蛋白質(zhì)組學(xué)（表達(dá)譜

25、、修飾譜和相互作用）已經(jīng)向動態(tài)蛋 白質(zhì)組學(xué)發(fā)展，必然要求定量方法的支持。擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題(1)規(guī)?；鞍踪|(zhì)組絕對定量方法的建立；方法的靈 敏度、重現(xiàn)性和動態(tài)范圍優(yōu)化。(2)不同狀態(tài)中低豐度蛋白質(zhì)組的相對定量；相對定 量方法動態(tài)范圍、覆蓋率和準(zhǔn)確度。(3)非標(biāo)記定量模式與科學(xué)合理的新算法。蛋白質(zhì)定量內(nèi)容：蛋白質(zhì)的定量包括絕對定量和相對定量，其蛋白質(zhì)定量的研究對象包括：(1)純化后蛋白質(zhì)的絕對定量；(2)總蛋白質(zhì)的絕對定量；(3)復(fù)雜生物體系中一種或數(shù)種蛋白質(zhì)的絕對和相對定量；(4)復(fù)雜生物體系中大多數(shù)及全部蛋白質(zhì)的絕對和相對定量。蛋白質(zhì)定量的常用方法(1)基于光吸收或發(fā)射性質(zhì)的光譜定量方法，

26、如紫外及 可見光吸收和熒光定量方法；(2)基于色譜或毛細(xì)管電泳與紫外光吸收定量方法；(3)基于同位素稀釋的質(zhì)譜定量方法；(4)基于凝膠電泳和光密度度的定量方法；(5)基于抗體和熒光標(biāo)記的定量方法；(6)蛋白質(zhì)相對定量方法。目前國內(nèi)外蛋白質(zhì)定量研究現(xiàn)狀絕對定量方法（1）光譜定量 280 nm 光吸收蛋白質(zhì)定量法； LOWRY蛋白質(zhì)定量法或改進(jìn) LOWRY蛋白質(zhì)定量法； BCA蛋白質(zhì)定量法法； BRADFORD蛋白質(zhì)定量法； Fluoraldehyde蛋白質(zhì)定量法； ELISA蛋白質(zhì)定量法等。(2）穩(wěn)定同位素稀釋法（內(nèi)標(biāo)法）用于質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)的 絕對定量；（3）多反應(yīng)檢測蛋白質(zhì)或肽定量法；（4）

27、規(guī)?；鞍踪|(zhì)的半絕對定量方法（基于統(tǒng)計方法）。 采用蛋白鑒定的分值與相應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度的關(guān)系 進(jìn)行半定量的方法； 蛋白質(zhì)豐度指數(shù)（PAIs，protein abundance indices）與相應(yīng)蛋白質(zhì)豐度的關(guān)系進(jìn)行半定量的方法； 指數(shù)蛋白質(zhì)豐度指數(shù)（emPAIs，exponentially modified protein abundance indices）與相應(yīng)蛋白質(zhì) 豐度的關(guān)系進(jìn)行半定量的方法。相對定量方法（1）在蛋白質(zhì)水平上，基于兩維分離或與熒光標(biāo)記結(jié)合的比 較方法，如2DE、PF-2D和DIGE；（2）基于質(zhì)譜技術(shù)的不同狀態(tài)的同一種肽段提取的離子流色 譜圖比較的方法（非標(biāo)記定量）；

28、（3）穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，包括化學(xué)標(biāo)記和代謝標(biāo)記，如18O 水標(biāo)記、同位素酸酐試劑標(biāo)記、同位素醛試劑標(biāo)記、 cICAT、iTRAQ和SILAC等;（4）雙功能試劑結(jié)合金屬標(biāo)記的方法; (5) 同系物標(biāo)記-SDS-PAGE或2DE結(jié)合質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相對定量 方法。iTRQA試劑結(jié)合生物質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的相對定量方法 基本原理（1）試劑的反應(yīng)基團(tuán)（PRG）特異地與肽段的N-端氨基和Lys的-氨基結(jié)合；（2）平衡基團(tuán)與不同質(zhì)量的報告基團(tuán)在一級質(zhì)譜圖上顯示為一個峰，為肽段質(zhì)量數(shù)加上144 Da；(3) 在二級質(zhì)譜圖上，報告基團(tuán)特異性地斷裂，其比值即為兩樣本中蛋白的相對定量。考察因素（1）標(biāo)記完全程度；（

29、2）動態(tài)范圍(30倍，相對誤差<30%)； (3) 靈敏度;（4）色譜行為，同位素效應(yīng)不顯著；（5）質(zhì)譜行為，主要為y離子序列。 通過實驗的考察和優(yōu)化，建立了iTRAQ標(biāo)記試劑結(jié)合MALDI TOF-TOF MS的蛋白組相對定量方法。應(yīng)用：脂肪肝大鼠肝組織全蛋白注意事項：（1）不能引入帶有伯氨基的試劑（還原劑：TCEP；半胱氨酸殘基封閉劑： MMTS（硫甲磺酸S-甲酯 ）；（2）標(biāo)記過程中水相比例：小于30；（3）體系不能肽復(fù)雜，即對于復(fù)雜生物樣本需要預(yù)分離步驟。SILAC標(biāo)記結(jié)合生物質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組方法的建立和應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)的基本原理：分別用含有天然同位

30、素和穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必須氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中的相應(yīng)氨基酸，通過5-6代的細(xì)胞傳代，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞合成的蛋白質(zhì)中，從而實現(xiàn)基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量分析。方法特點(diǎn)：簡單、直接、高效、準(zhǔn)確。應(yīng)用：尋找陽性率高、特異性強(qiáng)的肝癌標(biāo)志物的研究課題。通過對甲胎蛋白陽性肝癌細(xì)胞系和甲胎蛋白陰性肝癌細(xì)胞系差異比較研究，發(fā)現(xiàn)了一批甲胎蛋白陰性的差異蛋白，其中蛋白分子TGM2在甲胎蛋白陽性和陰性肝癌細(xì)胞中有顯著差異，有可能成為肝癌診斷的標(biāo)志物。DTPA螯合稀土金屬標(biāo)簽蛋白質(zhì)組定量原理和方法流程圖實驗方法考察結(jié) 論建立了一種以稀土元素為質(zhì)量標(biāo)簽的自主創(chuàng)新的定量蛋白質(zhì)組新方法，該方法具有以下的優(yōu)點(diǎn)

31、：n 化學(xué)試劑價廉易得n 化學(xué)標(biāo)記反應(yīng)條件溫和，為普遍標(biāo)記，無肽段歧視n 肽段的二級圖譜為連續(xù)的y系列離子，可提高蛋白鑒定的可信度n 有種稀土元素是單同位元素，有28種自由組合，可大大擴(kuò)展質(zhì)量標(biāo)簽的選擇范圍基于酸酐雙功能試劑修飾輔助、結(jié)合穩(wěn)定同位素18O標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量新方法方法特點(diǎn) 化學(xué)18O標(biāo)記方法，無回交現(xiàn)象；化學(xué)與酶切結(jié)合的18O標(biāo) 記方法，無同位素峰重疊 標(biāo)記肽段在MS/MS譜圖中是連續(xù)的y系列離子，簡化圖 譜，提高鑒定可靠性 標(biāo)記試劑價廉易得、反應(yīng)簡單快速、反應(yīng)體系兼容，為 普遍標(biāo)記的方法 同一樣本兩種18O標(biāo)記定量方法，節(jié)省樣本準(zhǔn)備的時間、 減少實驗誤差。 兩種定量結(jié)果可以互相驗證，顯著提高蛋白質(zhì)組定量的 準(zhǔn)確性和可靠性。乙酸酐穩(wěn)定同位素標(biāo)記-液質(zhì)聯(lián)用蛋白質(zhì)組相對定量新方法開發(fā)了自動化定量分析軟件：MSAQMALDI MS 實驗流程ESI MS 實驗流程方法特點(diǎn)：標(biāo)記試