保藏法5---微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程

1、定期移植保藏法適用范圍本方法適用于大多數(shù)細(xì)菌和真菌。原理低溫條件下保藏可減緩微生物菌種的代謝活動(dòng)，抑制其繁殖速度，達(dá)到減少菌株突變，延長菌種保藏時(shí)間的目的。保藏培養(yǎng)基一般含較多有機(jī)氮，糖分總量不超過2%，既能滿足菌種培養(yǎng)時(shí)生長繁殖的需要，又可防止因產(chǎn)酸過多而影響菌株的保藏。技術(shù)要求不同菌種應(yīng)根據(jù)要求選擇合適的培養(yǎng)基。接種時(shí)要求無菌操作，避免染菌。保藏期間要定期檢查菌種存放的房間、冷庫、冰箱等的溫度、濕度，各試管的棉塞有無污染現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)取出該管，重新移植培養(yǎng)后補(bǔ)上空缺。大量菌種同時(shí)移植時(shí)，各菌株的菌號(hào)、所用培養(yǎng)基要進(jìn)行核對(duì)，避免發(fā)生錯(cuò)誤。每次移植培養(yǎng)后，應(yīng)與原保藏菌株和菌株的登記卡片逐個(gè)

2、對(duì)照，檢查無誤后再存放。斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對(duì)照，防止因意外和污染造成損失。方法與步驟培養(yǎng)基制備器皿準(zhǔn)備培養(yǎng)基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，根據(jù)不同情況洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項(xiàng)材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。調(diào)pH值配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸或稀堿調(diào)pH值。加酸或堿液時(shí)要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導(dǎo)致測量不準(zhǔn)確和營養(yǎng)成分被破壞。加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基

3、中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。過濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過濾并分裝，斜面培養(yǎng)基不宜超過試管高度的四分之一。分裝過程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。包扎標(biāo)記將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌。滅菌后擺放斜面時(shí)，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無菌檢驗(yàn)。接種斜面接種A.4.2.1.1 點(diǎn)接把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。A.4.2.1.2 中央劃線從斜面中部自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等

4、。A.4.2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。A.4.2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。A.4.2.1.5 挖塊接種法挖取菌絲體連同少量瓊脂培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。穿刺接種用直接種針從原菌種斜面上挑取少量菌苔，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。液體接種挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)

5、箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。保藏保藏溫度和時(shí)間培養(yǎng)好的菌種于46保存，根據(jù)要求每36個(gè)月移植一次。對(duì)于某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須13個(gè)月移植一次。保藏濕度用相對(duì)濕度表示，通常為50%70%。測量儀表采用毛發(fā)濕度計(jì)或干濕球濕度計(jì)。移植培養(yǎng)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到另一新鮮培養(yǎng)基中，再在適宜條件下培養(yǎng)。菌種復(fù)壯菌種如有退化，應(yīng)將退化的菌種引入原來的生活環(huán)境中令其生長繁殖，通過純種分離，在宿主體內(nèi)生長等方法進(jìn)行復(fù)壯。液體石蠟保藏法適用范圍本方法適用于不能分解液體石蠟的酵母菌、某些細(xì)菌(如芽孢桿菌屬，醋酸桿菌屬等)和某些絲狀真菌(如青霉屬，曲霉屬等)。原理液體石蠟保

6、藏法可作為定期移植保藏法的輔助方法。在液體石蠟覆蓋下，菌種的生物代謝受到抑制，細(xì)胞老化被推遲。此方法可阻止氧氣進(jìn)入，使好氣菌不能繼續(xù)生長，也可防止因培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)而引起的菌體死亡，達(dá)到延長菌種保藏時(shí)間的目的。技術(shù)要求菌種培養(yǎng)參照附錄A。應(yīng)選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟。液體石蠟易燃，在對(duì)液體石蠟保藏菌種進(jìn)行操作時(shí)注意防止火災(zāi)。保藏場所應(yīng)保持干燥，防止棉塞污染。保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充滅菌的液體石蠟。方法與步驟液體石蠟將液體石蠟分裝加棉塞，用牛皮紙包好，0.1MPa滅菌30分鐘取出，置40恒溫箱蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A，斜面宜短，不超過試管三分之一

7、為宜。灌注石蠟 無菌條件下將滅菌的液體石蠟注入剛培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1厘米左右，使菌體與空氣隔絕。保藏將注入石蠟油的菌種斜面直立存放于低溫(4-15)干燥處，保藏時(shí)間為2-10年不等。恢復(fù)培養(yǎng)恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。沙土管保藏法適用范圍本方法適用于產(chǎn)孢類放線菌、芽孢桿菌、曲霉屬、青霉屬以及少數(shù)酵母如隱球酵母和紅酵母等。不適用于病原性真菌的保藏，特別是不適于以菌絲發(fā)育為主的真菌的保藏。原理干燥條件下微生物菌種代謝活動(dòng)減緩，繁殖速度受到抑制。此方法可減少菌株突變，延長存活時(shí)間。方法與步驟沙土管制備 將河沙用60目過篩，棄去大顆

8、粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細(xì)沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機(jī)物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時(shí)后倒去鹽酸，用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。另取瘦紅土100目過篩,水洗至中性，烘干，按沙土= 21混合。把混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1厘米左右。塞好棉塞，0.1MPa滅菌30分鐘，或常壓間歇滅菌3次，每天每次1小時(shí)。滅菌后在不同部位抽出若干管，分別加營養(yǎng)肉汁、麥芽汁、豆芽汁等培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)檢查后無微生物生長方可使用。斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄A。制備菌懸液向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入3mL-5mL無菌水，洗下細(xì)胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液

9、，均勻滴入沙土管中，每管0.2mL -0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。干燥用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器內(nèi)。純培養(yǎng)檢查從做好的沙土管中，按101比例抽查。無菌條件下用接種環(huán)取出少量沙土粒，接種于適宜的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察其生長情況和有無雜菌生長。如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少，或根本不長，則須進(jìn)一步抽樣檢查。保藏將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低溫(4-15)干燥處，半年檢查一次活力及雜菌情況。也可將純培養(yǎng)檢查合格的沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置干燥器內(nèi)保存。用此方法保藏時(shí)間為2-10年不等。復(fù)活復(fù)活時(shí)在無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于

10、適宜的斜面培養(yǎng)基上，長出菌落后再轉(zhuǎn)接一次，也可取沙土粒于適宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面。微生物菌種的冷凍干燥保藏技術(shù)規(guī)程好氧菌冷凍干燥管的制備4.1.1.1安瓿管準(zhǔn)備安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí)，先用2%鹽酸浸泡過夜，自來水沖洗干凈后，用蒸餾水浸泡至pH中性，干燥后、貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間，加入脫脂棉塞后，121下高壓滅菌15-20分鐘，備用。保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度及pH值，以及滅菌方法。如血清，可用過濾滅菌；牛奶要先脫脂，用離心方法去除上層油脂，一般在100間歇煮沸2-3次，每次10-30分鐘，備用。4.1.1.3凍

11、干樣品的準(zhǔn)備在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后（參見科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件微生物菌種純度檢測技術(shù)規(guī)程（試行），與保護(hù)劑混合均勻，分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜（以大腸桿菌為例，為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升瓊脂斜面兩支）。采用較長的毛細(xì)滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要濺污上部管壁，每管分裝量約0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物，應(yīng)離心去除培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻，再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短，最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完

12、畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無菌條件下操作。4.1.1.4預(yù)凍一般預(yù)凍2小時(shí)以上，溫度達(dá)到-20到-35左右。4.1.1.5冷凍干燥采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi)，開始冷凍干燥，時(shí)間一般為8-20小時(shí)。終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷： 安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀 真空度接近空載時(shí)的最高值 樣品溫度與管外溫度接近 選用1-2支對(duì)照管，其水份與菌懸液同量，視為干燥完結(jié) 選用一個(gè)安瓿管，裝1-2%氯化鈷，如變深蘭色，可視為干燥完結(jié)冷凍干燥完畢后，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，備用。4.1.1.6真空封口及真空檢驗(yàn)將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì)，然后采用真空泵抽真空

13、，在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。 熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測定儀測定真空度。4.1.1.7保藏安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。4.1.1.8質(zhì)量檢查冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查，如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。厭氧菌冷凍干燥管的制備主要程序與需氧菌操作相同安瓿管準(zhǔn)備參見4.1.1.1保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備保護(hù)劑使用前應(yīng)在100的沸水中煮沸15分鐘左右，脫氣后放入冷水中急冷，除掉保護(hù)劑中的溶解氧。凍干樣品的準(zhǔn)備參見4.1.1.3預(yù)凍參見4.1.1.4冷凍干燥參見4.1.1.5真空封口及真空檢驗(yàn)參見4.1.1.6保藏參見4.1.1.7質(zhì)量檢查參見4.1.1.8冷凍干燥法適用

14、范圍適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的保藏，但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。保藏周期不同微生物復(fù)蘇周期不同，一般10年左右。復(fù)蘇方法 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， 將安瓿管頂部燒熱， 用無菌棉簽沾冷水，在頂部擦一圈，頂部出現(xiàn)裂紋，用挫刀或鑷子頸部輕叩一下，敲下已開裂的安瓿管的頂端， 用無菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊，使用無菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上，進(jìn)行適溫培養(yǎng)。微生物菌種低溫冷凍保藏技術(shù)液氮超低溫保藏技術(shù)4.2.1.1安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈， 121下高壓滅菌15-2

15、0分鐘，備用。4.2.1.2保護(hù)劑的準(zhǔn)備保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度，一般采用10-20%甘油。4.2.1.3微生物保藏物的準(zhǔn)備微生物不同的生理狀態(tài)對(duì)存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。分裝時(shí)注意應(yīng)在無菌條件下操作。4.2.1.4菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法：刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi)；將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng)，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌最好取菌落邊緣的菌塊，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；在小安瓿管中裝1.2-2毫升的

16、瓊脂培養(yǎng)基，接種菌種，培養(yǎng)2-10天后，加入保護(hù)劑，待保藏。4.2.1.5預(yù)凍預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1為好、使樣品凍結(jié)到-35。目前常用的有三種控溫方法： 程序控溫降溫法，應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫，能很好地控制降溫速率。 分段降溫法：將菌體在不同溫級(jí)的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20至-40冰箱中1-2小時(shí)，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5。 對(duì)耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。4.2.1.6保藏將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150，液相中溫度為-196。保藏周期一般10年以上。4.2.1.7復(fù)蘇方法從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置在38-40水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。4.2.1.8適用范圍各類微生物。液氮保藏應(yīng)注意事項(xiàng) 防止凍傷，操作注意安全，帶面罩及皮手套 塑料凍存管一定要擰緊螺帽 運(yùn)送液氮時(shí)一定要用專用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運(yùn)輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮 注意存放液氮容器的室內(nèi)通風(fēng)，防止過量氮?dú)馐谷酥舷?防止安瓿管或塑料凍存管破裂爆炸，如液氮滲入管