肝素誘導(dǎo)結(jié)晶紫比色法檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生物活性

1、    肝素誘導(dǎo)結(jié)晶紫比色法檢測(cè)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生物活性葉春婷李斯明鄒海燕楊小紅葉惠貞 中國(guó)圖書分類號(hào)R392.33Q342.4 摘要目的：為尋找一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高而不需使用放射性同位素的生物活性檢測(cè)方法對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)進(jìn)行檢測(cè)。方法：利用肝素對(duì)Balb/c 3T3細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)，然后運(yùn)用結(jié)晶紫比色法對(duì)其進(jìn)行生物活性檢測(cè)。結(jié)果：最大吸光度 A值的一半為 0.315，所對(duì)應(yīng)的 aFGF濃度為24 pg/ml，而沒有肝素誘導(dǎo)的最大A值一半為 0.16，所對(duì)應(yīng)的濃度為156 pg/ml。結(jié)論：肝素的存在提高了結(jié)晶紫法的靈敏度。因此是一種

2、簡(jiǎn)便、快捷而值得推廣應(yīng)用的 FGF生物活性檢測(cè)法。 關(guān)鍵詞成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)晶紫肝素 Bioassay for fibroblast growth factor by crystal violet inducing with heparin YE Chun-Ting,LI Si-Ming,ZOU Hai-Yan et al (Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220 AbstractObjective：Fibroblast growth factor (FGF) is one of the important cytokines for wo

3、und healing.It can accelerate the regeneration of blood vessel,nerve and epidermis.To look for a bioassay of FGF that is not only easy,economic and high sensitivity ,but also not involving radioisotope such as3H-TdRMethods：The authors used heparin to induce the Balb/c 3T3 cells,and then the crystal

4、violet colorimetric analysis(CVCA) was used to measure its boiogical activity .Results:It showed that the half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml aFGF with inducing by heparin,while that was stimulated by 156 pg/ml aFGF without heparin inducing .Conclusion：The existing of heparin could en

5、hance the sensitivity of CVCA.It may be an easy,sensitive and valuable method to popularize for FGF bioassay. Key wordsFibroblast growth factorHeparinCrystal violet 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor, FGF)是一種重要的促創(chuàng)傷愈合因子，不但促進(jìn)創(chuàng)面的愈合1，而且對(duì)血管和神經(jīng)的再生有很強(qiáng)的促進(jìn)作用2，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。無(wú)論是生化提取物還是基因工程產(chǎn)品，其純度和生物活性都不斷提高，這就要求相應(yīng)

6、的生物活性的檢測(cè)手段也要不斷進(jìn)步。目前， FGF的生物活性檢測(cè)法以 3H-TdR方法為主，因其使用放射性同位素，受設(shè)備和儀器的限制，加上操作繁瑣，檢測(cè)費(fèi)用高，因此，我們致力于研究一種高靈敏度，操作簡(jiǎn)便而且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法。 1材料與方法 1.1材料aFGF：GIBCO BRL10g/瓶；DMEM：GIBCOBRL ；結(jié)晶紫：中國(guó)遠(yuǎn)航化工廠 A.R；SDS：INDONESIA CHEICALS；新生小牛血清(NCS)，成都華西生化制品廠。 1.2方法于96孔平底板加入含10%NCS的 DMEM培養(yǎng)基，再加入10ng/mlaFGF溶液進(jìn)行倍比稀釋，隨后加入含 50g/ml肝素鈉的Balb/c3T3細(xì)

7、胞懸液，于375%CO2培養(yǎng)48h，去除上清，加入0.5%結(jié)晶紫溶液染色15min后，沖去染色液，于50烘干，加入 1%SDS溶液，振蕩溶解，于540 nm讀吸光度 A值。 2結(jié)果 結(jié)果如圖1所示。 圖13T3細(xì)胞增殖反應(yīng)曲線 Fig.1Proliferation of 3T3 cell line Note:Half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml with heparin,by 156 pg/ml without heparin 3討論 FGF又分為 aFGF（酸性）和 bFGF（堿性）兩種，兩者具有相同的生物學(xué)功能。其中 bFGF

8、對(duì)其受體的親和性大于 aFGF，因此 bFGF的生物學(xué)活性比 aFGF強(qiáng)10100倍左右3。但無(wú)論aFGF還是 bFGF都同樣能與肝素結(jié)合，從而加強(qiáng)了 FGF的生物學(xué)功能，在分離純化 FGF時(shí)就利用了這一點(diǎn)，從而大大提高了分離的效果和速度4。在本研究中，我們?cè)谏锘钚缘蔫b定上也利用這一點(diǎn)來(lái)提高其檢測(cè)的靈敏度。如上圖所示，不加肝素誘導(dǎo)的最大吸光度 A值一半為 0.16，所對(duì)應(yīng)的濃度為156 pg/ml，加肝素誘導(dǎo)最大 A值的一半為 0.315，所對(duì)應(yīng)的濃度為24 pg/ml，在aFGF的生物活性檢測(cè)中加入肝素其靈敏度明顯提高。據(jù)報(bào)道，肝素的存在可使 aFGF的活性增加10100倍，包括刺激 3T

9、3細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用的有效濃度范圍為10100 ng/ml5。由于 bFGF的活性比 aFGF高，其作用的有效濃度可能會(huì)適當(dāng)降低。 我們利用肝素作為誘導(dǎo)劑，不但提高了檢測(cè)的靈敏度，而且還縮短和簡(jiǎn)化了檢測(cè)的時(shí)間和步驟。因?yàn)殪`敏度高，分辨率也相應(yīng)提高，省略了無(wú)血清或低血清培養(yǎng) 3T3細(xì)胞的步驟，直接用細(xì)胞培養(yǎng)用血清濃度即可，細(xì)胞不用"饑鋨"，保持著良好的狀態(tài)，給后面的檢測(cè)工作提供了良好的基礎(chǔ)。 結(jié)晶紫法檢測(cè)細(xì)胞因子生物活性屬比色法范疇，它是利用結(jié)晶紫的甲醇溶液對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行固定染色，再用水充分洗去剩余的染色液，烘干后用 SDS溶解細(xì)胞即可比色。此法操作簡(jiǎn)便，需時(shí)

10、短，無(wú)需細(xì)胞代謝攝入的中間過(guò)程。對(duì)于象 3T3這樣的貼壁細(xì)胞尤其合適，因?yàn)槿旧蟮募?xì)胞仍然緊貼板壁，只要沿板邊小心沖洗掉多余的染料即可，省去了收集和離心洗滌細(xì)胞的麻煩。在檢測(cè)另一種類似的細(xì)胞因子即表皮生長(zhǎng)因子(EGF)時(shí)，我們也運(yùn)用了結(jié)晶紫法，而且還和 MTT和 3H -TdR方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)照，結(jié)果結(jié)晶紫法的靈敏度與 3H-TdR法相仿，比 MTT法高6。 運(yùn)用結(jié)晶紫法檢測(cè) FGF的生物活性，無(wú)論從操作的繁簡(jiǎn)，經(jīng)濟(jì)因素以及對(duì)人體和環(huán)境的危害等都比現(xiàn)時(shí)普遍應(yīng)用的 3H-TdR法具有優(yōu)勢(shì)，加肝素誘導(dǎo)后，靈敏度也相應(yīng)提高了，這就為結(jié)晶紫法的普遍應(yīng)用提供了前提。 作者簡(jiǎn)介：葉春婷，女，30歲，碩士，主

11、要從事組織工程學(xué)； 李斯明，男，37歲，副主任醫(yī)師 作者單位：廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所，廣州 510220 4參考文獻(xiàn) 1McGee G S.Recombinant basic fibroblast growth factor accelerates wound healing.J Surg Res,1988;45:145 2Gospodarowicz D.Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor： a cangiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neurectoderm derived cells.Cell Differ,1986;19:1 3周延沖.多肽生長(zhǎng)因子.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，1992：209-230 4Rogers M L,Belford D A,Francis G L et al.Identification of fibroblast growth factors in bovine cheese whey.J D