現(xiàn)代分子生物學(xué)筆記(基礎(chǔ)理論部分)

1、第二章 染色體與DNA第一節(jié) 染色體1、真核細(xì)胞的染色體具有如下性質(zhì)：分子結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定；能夠自我復(fù)制，使親子代保持連續(xù)性；能指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而控制生命過(guò)程；能產(chǎn)生可遺傳的變異。2、染色體上的蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，它與DNA組成核小體。組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3、H4 。組蛋白：histones真和生物體細(xì)胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì)含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸特別多，二者加起來(lái)約為所有氨基酸殘基的四分之一。3、組蛋白的一般特性：進(jìn)化上的極端保守：不同種生物組蛋白的氨基酸組成是十分相似的，特別是H3、H4 可能對(duì)穩(wěn)定真核生物的染色體結(jié)構(gòu)起重要作用。無(wú)組織特

2、異性肽鏈上氨基酸分布的不對(duì)稱性存在較普遍的修飾作用富含賴氨酸的組蛋白H54、非組蛋白：主要包括與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶類、與細(xì)胞分裂有關(guān)的蛋白等。5、真核生物基因組DNA：真核細(xì)胞基因組的最大特點(diǎn)是它含有大量的重復(fù)序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質(zhì)的非功能DNA所隔開(kāi)。人們把一種生物單倍體基因組DNA的總值稱為C值。在真核生物中C值一般是隨生物進(jìn)化而增加的，高等生物的C值一般大于低等生物，但某些兩棲類的C值甚至比哺乳類還大，這就是著名的“C值反?，F(xiàn)象”。6、真核細(xì)胞DNA序列可分為三類：不重復(fù)序列：在單倍體基因組里，一般只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝，占DNA總量的40%80%。結(jié)構(gòu)基因基本上屬于不重

3、復(fù)序列。中度重復(fù)序列：重復(fù)次數(shù)在10104之間，占DNA總量的10%40%，各種rRNA、tRNA以及某些結(jié)構(gòu)基因（如組蛋白基因）都屬于此類。高度重復(fù)序列：如衛(wèi)星DNA。只在真核生物中出現(xiàn)占基因組的10%60%，由1060個(gè)堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)高達(dá)數(shù)百萬(wàn)次，這類DNA高度濃縮，是異染色質(zhì)的組成部分，可能與染色體的穩(wěn)定性有關(guān)。7、染色質(zhì)與核小體：染色質(zhì)纖維細(xì)絲是由DNA和組蛋白構(gòu)成，DNA和組蛋白構(gòu)成核小體，核小體連成念珠狀構(gòu)成染色質(zhì)。核小體的裝配過(guò)程：兩分子的H3和兩分子的H4先形成四聚體，然后由H2A和H2B構(gòu)成的異二聚體在該四聚體的兩側(cè)分別結(jié)合而形成八聚體。長(zhǎng)146bp的DNA按

4、左手螺旋盤(pán)繞在八聚體上1.8圈，形成核小體的核心顆粒，每圈約80bp。核心顆粒兩端的DNA各有11bp與H1結(jié)合，形成完整的核小體。核小體的形成是染色體壓縮的第一個(gè)階段。染色體的壓縮：DNA雙鏈以左手螺旋盤(pán)繞在組蛋白形成的八聚體核心上即核小體-念珠狀結(jié)構(gòu)-核小體結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤(pán)繞折疊形成染色質(zhì)絲-組成突環(huán)-玫瑰花結(jié)-螺線圈-由螺線圈組成染色單體。8、真核生物基因組的特點(diǎn):真核基因組龐大，一般都遠(yuǎn)大于原核生物的基因組真核基因組存在大量的重復(fù)序列真核基因組的大部分為非編碼序列，占整個(gè)基因組序列的90%以上，該特點(diǎn)是真核生物與細(xì)菌和病毒之間最主要的區(qū)別真核基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?。真核基因是斷裂基因?/p>

5、有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。真核基因組存在大量的順式作用元件。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等真核基因組中存在大量的DNA多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性和串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性。真核基因組具有端粒結(jié)構(gòu)。單順?lè)醋樱赫婧嘶蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋樱匆粭lmRNA模板只含有一個(gè)翻譯起始點(diǎn)和終止點(diǎn)，因而一個(gè)基因編碼一條多肽鏈或RNA。多順?lè)醋樱涸谠松镏?，通常是幾種不同的mRNA連在一起，相互之間由一條短的不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列所隔開(kāi)，這種mRNA叫做多順?lè)醋觤RNA。這樣的一條mRNA鏈含有指導(dǎo)合成幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息。9、原核生物基因組：原核生物基因組很小，大多只有一條染色體，只有很少基因是以拷貝形式存在，且DNA含量很少。10

6、、原核生物基因組特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練：原核DNA分子的絕大部分是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的只有很少的一部分不轉(zhuǎn)錄存在轉(zhuǎn)錄單元：原核生物DNA序列中功能相關(guān)的RNA和蛋白質(zhì)基因，往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定部位，形成功能單元或轉(zhuǎn)錄單元，它們可被一起轉(zhuǎn)錄為含多個(gè)mRNA的分子，稱為多順?lè)醋觤RNA。有重疊基因：同一段DNA攜帶兩種或兩種以上不同蛋白質(zhì)的編碼基因。第二節(jié) DNA的結(jié)構(gòu)1、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)：指DNA分子中核苷酸的排列順序。DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)特征：DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸鏈盤(pán)繞而成；DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排在內(nèi)側(cè)；兩條鏈上的堿基互補(bǔ)配對(duì)2、DNA

7、的二級(jí)結(jié)構(gòu)：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤(pán)繞所生成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通常情況下分為兩大類：右手螺旋A-DNA、B-DNA和左手螺旋Z-DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)：兩條DNA鏈之間形成氫鍵；雙螺旋內(nèi)部形成的疏水區(qū)，消除了介質(zhì)中水分子對(duì)堿基之間氫鍵的影響；介質(zhì)中的陽(yáng)離子中和了磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷，降低了DNA鏈之間的排斥力、范德華力。Z-DNA指左手螺旋DNA。3、DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)：指DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤(pán)繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。負(fù)超螺旋（拓?fù)洚悩?gòu)酶或溴乙啶）松弛DNA（拓?fù)洚悩?gòu)酶或溴乙啶）正超螺旋第三節(jié) DNA的復(fù)制1、半保留復(fù)制：DNA在復(fù)制過(guò)程中，堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋被分開(kāi)，每條分子分別做模版合成

8、新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。每個(gè)子代DNA分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條是新合成的。2、半不連續(xù)復(fù)制：DNA在復(fù)制時(shí)，在一個(gè)復(fù)制叉上同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)方向的DNA復(fù)制，一條鏈的合成是連續(xù)的，另一條是不連續(xù)的先合成一系列的53的短片段，然后在DNA連接酶作用下連接成完整的DNA鏈3、復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開(kāi)成兩股鏈分別進(jìn)行；所以這個(gè)復(fù)制起點(diǎn)成叉子形式，被稱為復(fù)制叉。DNA復(fù)制是從固定起點(diǎn)開(kāi)始的。一般把生物的復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個(gè)復(fù)制子只含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。通常細(xì)菌、病毒和線粒體DNA分子都是作為單個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制的。而真核生物的基因組可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，即基因組

9、中包含多個(gè)復(fù)制子。原核生物和真核生物的DNA復(fù)制主要是從固定起點(diǎn)雙向等速?gòu)?fù)制方式進(jìn)行。4、幾種主要的復(fù)制方式：(1)線性DNA雙鏈的復(fù)制(2) 環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制：型、滾環(huán)型、D型第四節(jié) 原核生物和真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)1、原核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)：所有的DNA復(fù)制都是從一個(gè)固定的起點(diǎn)開(kāi)始的，而目前所知的DNA聚合酶都只能延長(zhǎng)DNA鏈而不能從頭合成DNA鏈。DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模版上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶從RNA引物3末端開(kāi)始合成新的DNA鏈。對(duì)于前導(dǎo)鏈，這個(gè)引發(fā)過(guò)程比較簡(jiǎn)單只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此為起點(diǎn)一直合成下去，但對(duì)于滯后鏈，這個(gè)

10、引發(fā)過(guò)程就非常復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用還涉及到崗崎片段的形成和連接。滯后鏈的引發(fā)由引發(fā)體來(lái)完成。DNA解鏈酶：DNA解鏈酶能水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA。單鏈結(jié)合蛋白SSB：作用是保證被解鏈酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制完成后才離開(kāi)。2、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)真核生物每條染色體上可以有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，而原核生物只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；真核生物的染色體在全部完成復(fù)制前，各個(gè)起點(diǎn)上的DNA不能再開(kāi)始，而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)制起點(diǎn)可以連續(xù)開(kāi)始新的DNA復(fù)制，表現(xiàn)為雖有一個(gè)復(fù)制單元，但卻可有多個(gè)復(fù)制叉。第五節(jié) DNA的修復(fù)1、錯(cuò)配修復(fù)：

11、一旦復(fù)制叉通過(guò)復(fù)制起點(diǎn)，母鏈就會(huì)在開(kāi)始DNA合成前的幾秒至幾分鐘內(nèi)被甲基化。此后只要兩條DNA鏈上堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)就會(huì)根據(jù)“保存母鏈，修復(fù)子鏈”的原則，找出錯(cuò)誤堿基所在的DNA鏈，并在對(duì)應(yīng)于母鏈甲基化腺苷酸上游鳥(niǎo)苷酸的5位置切開(kāi)自戀，再根據(jù)錯(cuò)配堿基相對(duì)于DNA切口的方位啟動(dòng)修復(fù)途徑，合成子鏈。2、切除修復(fù)：包括堿基切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)。步驟：首先由核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的5側(cè)切開(kāi)磷酸二酯鍵由DNA解鏈酶將有損傷的DNA片段解離在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按53方向合成DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙由DNA鏈連接酶新合成的DNA片段與原來(lái)的DNA

12、斷鏈連接起來(lái)。3、重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù)）：受損傷的DNA鏈復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口以另一條子鏈DNA為模板經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新的DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。4、DNA的直接修復(fù)5、SOS反應(yīng)：包括誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等。包括兩個(gè)方面DNA的修復(fù)和產(chǎn)生變異。第六節(jié) DNA的轉(zhuǎn)座1、轉(zhuǎn)座子：是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。插入序列是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子，它不含任

13、何宿主基因，它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成成分。第三章 生物信息的傳遞-從DNA到RNA第一節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程1、RNA鏈的合成都包括以下幾個(gè)特點(diǎn)：RNA是按照5-3方向進(jìn)行的；以DNA中的反義鏈為模版；在RNA聚合酶催化下；以四種三磷酸核苷為原料，根據(jù)堿基配對(duì)原則，各個(gè)核苷酸之間通過(guò)形成磷酸二酯鍵相連，不需要引物的參與，合成的RNA帶有與DNA有意義鏈相同的序列。轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程包括：模版識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過(guò)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。2、模版的識(shí)別：主要是RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過(guò)程。真核生物的RNA聚合酶不能直接識(shí)別基因的啟動(dòng)子區(qū)，所以，需要一些被稱

14、為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的輔助蛋白質(zhì)按特定的順序結(jié)合在啟動(dòng)子上，RNA聚合酶才能與之結(jié)合并形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物PIC，以保證有效的起始轉(zhuǎn)錄。3、起始轉(zhuǎn)錄：不需要引物。轉(zhuǎn)錄的起始就是RNA鏈上第一個(gè)核苷酸鍵的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個(gè)核苷酸短鏈的過(guò)程是通過(guò)啟動(dòng)子階段，此時(shí)RNA聚合酶一直處于啟動(dòng)子區(qū)，新生的RN鏈與DNA模版鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從dna鏈上掉下來(lái)并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開(kāi)始。一旦RNA聚合酶成功的合成了9個(gè)以上核苷酸并離開(kāi)啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入正常的延伸階段。一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)啟動(dòng)子的時(shí)間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。4、轉(zhuǎn)錄的延伸：RNA聚合酶釋放因子離開(kāi)啟動(dòng)子后，核心酶沿模版DNA鏈移

15、動(dòng)并使新生RNA鏈不斷延長(zhǎng)的過(guò)程就是轉(zhuǎn)錄的延伸。5、轉(zhuǎn)錄的終止：當(dāng)RNA鏈延伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時(shí)，RNA聚合酶不在形成新的磷酸二酯鍵，RNA-DNA雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而RNA聚合酶和RNA鏈都被從模版上釋放出來(lái)，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄機(jī)器主要成分1、RNA聚合酶：原核生物RNA聚合酶：在細(xì)菌中，一種RNA聚合酶幾乎負(fù)責(zé)所有的mRNA、rRNA、tRNA的合成。大多數(shù)原核生物的RNA聚合酶的組成是相同的，大腸桿菌RNA聚合酶首先由2個(gè)亞基、一個(gè)亞基、一個(gè)亞基和一個(gè)亞基組成的核心酶，加上一個(gè)亞基后則成為聚合酶全酶。轉(zhuǎn)錄的起始過(guò)程需要全酶，由因子辨認(rèn)起始點(diǎn)，延長(zhǎng)過(guò)程

16、僅需要核心酶的催化。大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基相對(duì)分子質(zhì)量亞基數(shù)組分功能3.65x1042核心酶核心酶組裝，啟動(dòng)子識(shí)別1.51x1051核心酶和共同組成RNA合成的活性中心1.55x1051核心酶11x1041核心酶7.0x1041因子存在多種因子，用于識(shí)別不同的啟動(dòng)子真核生物的RNA聚合酶：酶細(xì)胞內(nèi)定位轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對(duì)活性對(duì)-鵝膏堿的敏感程度RNA聚合酶核仁rRNA50%70%不敏感RNA聚合酶核質(zhì)hn RNA20%40%敏感RNA聚合酶核質(zhì)t RNA約10%存在物種特異性2、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物：模版的識(shí)別階段包括RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別，聚合酶與啟動(dòng)子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物，聚合酶全酶

17、所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開(kāi)。對(duì)強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，從封閉復(fù)合物到開(kāi)放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。開(kāi)放復(fù)合物與最初的兩個(gè)NTP相結(jié)合并在兩個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵后即轉(zhuǎn)變成包括RNA聚合酶、DNA和新生RNA的三元復(fù)合物。第三節(jié) 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始1、啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)子：是一段位于結(jié)構(gòu)基因5端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模版DNA鏈準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。因?yàn)榛虻奶禺愋赞D(zhuǎn)錄取決于酶與啟動(dòng)子能否有效的形成二元復(fù)合物。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親和力，從而影響了基因的表達(dá)水平。Pribnow區(qū)：是一個(gè)由5個(gè)核苷酸TATTA組成的保守序列，其中

18、央大約位于起點(diǎn)上游10bp處，所以又稱-10區(qū)。-35區(qū)：在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始位點(diǎn)上游-35區(qū)域也有一段保守序列，共同序列是TTGACA-10位的TATA區(qū)和-35位的TTGACA區(qū)是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合位點(diǎn)，能與因子相互識(shí)別而具有很高的親和力。2、啟動(dòng)子的識(shí)別：RNA聚合酶并不直接識(shí)別堿基對(duì)本身，而是通過(guò)氫鍵互補(bǔ)的方式加以識(shí)別。3、RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合：RNA聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過(guò)解鏈得到二元開(kāi)鏈復(fù)合物。一旦開(kāi)鏈區(qū)解鏈，酶分子能以正確的取向與解鏈后的有關(guān)單鏈相互作用，形成開(kāi)鏈復(fù)合物。4、-10區(qū)與-35區(qū)的最佳間距：在原核生物中，-35區(qū)與

19、-10區(qū)之間的距離大約是1619bp，小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子活性。5、增強(qiáng)子及其功能：增強(qiáng)子是DNA上能提高轉(zhuǎn)錄起始效率的序列，可位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5 或3端，而且一般與所調(diào)控的靶基因的距離無(wú)關(guān)，其特點(diǎn)如下：遠(yuǎn)距離效應(yīng)：一般位于上游-200bp處，但可增強(qiáng)遠(yuǎn)處啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，即使相距大于10kb也能發(fā)揮作用。無(wú)方向性：無(wú)論位于靶基因的上游還是位于靶基因的下游或內(nèi)部都可發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。順式調(diào)節(jié)：只調(diào)節(jié)位于同一染色體上的靶基因，而對(duì)其他染色體上的基因沒(méi)有作用。無(wú)物種和基因的特異性：可以連接到異源基因上發(fā)揮作用。具有組織特異性：增強(qiáng)子的作用需要特定的蛋白質(zhì)因子參與。有相位性：其作用

20、和DNA的構(gòu)象有關(guān)。有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。6、轉(zhuǎn)錄的抑制：分為兩類：第一類是DNA模版功能抑制劑，通過(guò)與DNA結(jié)合而改變模版的功能；第二類是RNA聚合酶的抑制物，它們與RNA聚合酶結(jié)合而抑制其活力。第四節(jié) 原核與真核生物mRNA的特征比較1、原核生物mRNA的特征：半衰期短多以多順?lè)醋拥男问酱嬖?5端沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，3端也沒(méi)有多聚A尾巴或者很短2、真核生物mRNA的特征5端有帽子結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)3端有poly A尾巴凡是編碼功能的真核基因都能通過(guò)RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，真核基因幾乎都是單順?lè)醋觤RNA，只包含一個(gè)蛋白質(zhì)信息。第五節(jié) 終止和抗終止（1）依賴于因子的終止：因子能水解各種核苷三磷

21、酸，實(shí)際是一種NTP酶，通過(guò)催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。（2）不依賴于因子的終止：模板上存在終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)終止子，每個(gè)基因或操縱子都有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)終止子。終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段4-8個(gè)A組成的序列，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止（3）抗終止：破壞終止位點(diǎn)的RNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的抗終止和依賴于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄終止。第四章 生物信息的傳遞 從mRNA到蛋白質(zhì)1、翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸序列從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開(kāi)始，按3個(gè)

22、核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過(guò)程。第一節(jié) 遺傳密碼-三聯(lián)子1、遺傳密碼的性質(zhì)：密碼的連續(xù)性：一個(gè)密碼子接一個(gè)密碼子連續(xù)的閱讀直至終止密碼密碼的簡(jiǎn)并性：由一種以上密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并，對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。密碼的通用性和特殊性：遺傳密碼無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，也無(wú)論是對(duì)病毒、細(xì)菌、動(dòng)物還是植物而言都是通用的。特殊性，支原體中終止密碼子UGA被用來(lái)編碼色氨酸。密碼子與反密碼子的相互作用：在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中，tRNA的反密碼子在核糖體內(nèi)是通過(guò)堿基的反向配對(duì)與mRNA上的密碼子相互作用的。在密碼子與反密碼子配對(duì)過(guò)程中，前兩對(duì)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)原則，

23、第三對(duì)堿基有一定的自由度，可以“擺動(dòng)”，因而使某些tRNA可以識(shí)別1個(gè)以上的密碼子。第二節(jié) tRNA1、tRNA在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中處于關(guān)鍵地位，它不但為每個(gè)三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無(wú)誤的將所需的氨基酸運(yùn)送到核糖體上提供了運(yùn)送載體，所以，它又被稱為 第二遺傳密碼。2、tRNA的結(jié)構(gòu)：受體臂（accept stem，也被稱作amino acid stem）是一個(gè)7個(gè)堿基長(zhǎng)的臂，其中包含5'端，與有3'端羥基（OH）（能結(jié)合氨基酸于其上）的3'端。受體臂有可能含有非Watson-Crick所發(fā)現(xiàn)的堿基對(duì)。.CCA尾（CCA tail）是tRNA分子3

24、9;端的CCA序列，在翻譯時(shí)，幫助酶識(shí)別tRNA。D臂（D arm）是在一個(gè)環(huán)（D loop）的端部4個(gè)堿基的臂，通常含有二氫尿嘧啶（dihydrouridine）。反密碼子臂（anticodon arm）有5個(gè)堿基，包括反密碼子（anticodon）。每一tRNA包括一個(gè)特異的三聯(lián)反密碼子序列，能夠與氨基酸的一個(gè)或者多個(gè)密碼子匹配。例如賴氨酸（lysine）的密碼子之一是AAA，相應(yīng)的tRNA的反密碼子可能是UUU（一些反密碼子可以與多于一個(gè)的密碼子匹配被稱為“擺動(dòng)”）。T臂（T arm）是5個(gè)堿基的莖，包括序列TC。3、tRNA的功能：運(yùn)輸?shù)墓ぞ咿D(zhuǎn)運(yùn)氨基酸；解讀mRNA的信息。4、tRNA

25、種類：起始tRNA和延伸tRNA：能特異性的識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫tRNA，其他的統(tǒng)稱為延伸tRNA同工tRNA：代表同一種氨基酸的tRNA叫同工tRNA校正tRNA：分為無(wú)義突變和錯(cuò)義突變校正。5、氨酰tRNA合成酶：是一類催化氨基酸與tRNA結(jié)合的特異性酶，由它決定氨基酸能否與對(duì)應(yīng)的tRNA結(jié)合，既能識(shí)別tRNA，又能識(shí)別氨基酸，對(duì)兩者都具有高度的專一性。催化反應(yīng)：AA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi第三節(jié) 核糖體1、核糖體的結(jié)構(gòu)：核糖體由大小兩個(gè)亞基組成。每個(gè)亞基都含有一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的tRNA和許多不同的蛋白質(zhì)分子。核糖體蛋白。核糖體上有多個(gè)活性中

26、心，每個(gè)中心都由一組特殊的核糖體蛋白質(zhì)構(gòu)成，形成一個(gè)多種酶的結(jié)合體，單個(gè)酶或蛋白質(zhì)只有在這個(gè)總體結(jié)構(gòu)上才擁有催化性質(zhì)，他們共同承擔(dān)了蛋白質(zhì)生物合成的任務(wù)。核糖體RNA。2、核糖體的功能：合成的場(chǎng)所，選擇對(duì)信息專一的AA-tRNA；同時(shí)容納另一種攜帶肽鏈的tRNA，既肽基-tRNA核糖體包括至少五個(gè)活性中心:mRNA結(jié)合部位、結(jié)合或接受AA-tRNA部位、結(jié)合或接受肽基-tRNA的部位、肽基轉(zhuǎn)移部位及形成肽鍵的部位。第四節(jié) 蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)基質(zhì)1、氨基酸的活化：氨基酸必須在氨酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸-AA-tRNA2、翻譯的起始：原核生物翻譯的起始：需要的7種成分：30S小亞基

27、、模版mRNA、fMet-tRNA fMet、三個(gè)翻譯起始因子IF-1、IF-2、IF-3、GTP、50S大亞基、Mg2+第一步：30S小亞基首先與翻譯起始因子IF-1、IF-3結(jié)合，通過(guò)SD序列與mRNA模版結(jié)合；第二步：在IF-2和GTP的幫助下，fMet-tRNA fMet進(jìn)入小亞基的P位tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對(duì)；第三步：帶有tRNA、mRNA三個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放翻譯起始因子。3、肽鏈的終止：肽鏈延伸過(guò)程中，當(dāng)終止密碼子UAA、UAG、UGA出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí)，沒(méi)有相應(yīng)的AA-tRNA能與其結(jié)合，而釋放因子能識(shí)別這些

28、密碼子并與之接合，水解P位上的多肽鏈與tRNA之間的二酯鍵，然后，新生成的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放，核糖體大小亞基解體，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。4、蛋白質(zhì)前體的加工：新生的多肽鏈大多是沒(méi)有功能的，必須經(jīng)過(guò)加工修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)：N端fMet或Met的切除、二硫鍵的形成、特定氨基酸的修飾、切除新生肽鏈中的非功能片段5、蛋白質(zhì)的折疊：新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)的特定部位，在多種蛋白質(zhì)的幫助下卷曲成正確構(gòu)象，大多數(shù)蛋白質(zhì)的折疊是邊翻轉(zhuǎn)邊折疊的。至少兩類因子參與了折疊過(guò)程：酶、分子伴侶。6、蛋白質(zhì)合成抑制劑：主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素?？股貙?duì)蛋白質(zhì)合成的作用可能是阻止m

29、RNA與核糖體結(jié)合(氯霉素)或阻止AA-tRNA與核糖體結(jié)合（四環(huán)素）或干擾AA-tRNA與核糖體結(jié)合而產(chǎn)生錯(cuò)讀（鏈霉素）。專題七、雙向電泳與質(zhì)譜檢測(cè)掌握雙向電泳中等電聚焦電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理；掌握雙向電泳的步驟；掌握質(zhì)譜分析的基本原理；掌握質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)；掌握質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用領(lǐng)域；了解蛋白質(zhì)電泳凝膠染色的方法；了解雙向電泳的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)：1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2、等電聚焦3、雙向電泳1、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 利用聚丙烯酰胺形成的凝膠對(duì)大分子生物物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)）通過(guò)附加電場(chǎng)使分子不同的按照分子量大小在凝膠中得到分離。2、 蛋

30、白質(zhì)的聚丙烯凝膠電泳類型： 按蛋白質(zhì)變性與否分為變性電泳和非變性電泳3、 蛋白質(zhì)變性：打開(kāi)二硫鍵，蛋白質(zhì)失去生物活性，故稱變性（denature）。4、 變性的方法：95加熱5分鐘。為避免復(fù)性常使用-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）保護(hù)自由的半胱氨酸巰基。5、 變性電泳的方法：十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-PAGE6、 SDS-PAGE原理：蛋白質(zhì)在SDS凝膠電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)速度和距離完全取決于其分子量。7、 SDS-PAGE操作程序：蛋白質(zhì)樣品制備、凝膠制備：分離膠 濃縮膠、樣品上樣、電泳、凝膠染色、脫色、電泳結(jié)果分析SDS-PAGE凝膠的工作原理：制膠緩沖液使用的是Tris-HCl緩

31、沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.8，分離膠pH8.8；而電泳緩沖液使用Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。濃縮膠中，pH呈弱酸性，甘氨酸解離很少，在電場(chǎng)中泳動(dòng)效率低；而Cl-卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。進(jìn)入分離膠后，膠中pH增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。SDS-PAGE電泳凝膠染色：考馬斯亮藍(lán)染色、銀染2、等電聚焦 是利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不

32、同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可到達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分。 適用: 1.研究蛋白質(zhì)微觀不均一性 2.測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH梯度構(gòu)建：固相pH梯度(IPG)：將緩沖基團(tuán)共價(jià)鍵合在介質(zhì)上成為凝膠介質(zhì)的一部分而建立pH梯度（線性和非線性），分辨率比前者高一個(gè)數(shù)量級(jí)。載體兩性電解質(zhì)（CA）應(yīng)具備的條件在等電點(diǎn)處必需有足夠的緩沖能力在等電點(diǎn)必需有足夠高的電導(dǎo)分子量要小，便于與被分離的高分子物質(zhì)用透析或凝膠過(guò)濾法分開(kāi)?；瘜W(xué)組成應(yīng)不同于被分離物質(zhì)，不干擾測(cè)定。應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。3、雙向電泳蛋白質(zhì)組學(xué) 闡明各種生物基因組在細(xì)胞中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的

33、表達(dá)模式及功能模式的學(xué)科。包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、存在方式(修飾形式)、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。是蛋白質(zhì)（protein）和基因組（genome）研究在形式和內(nèi)容兩方面的組合蛋白質(zhì)組學(xué)關(guān)鍵技術(shù) 由于蛋白質(zhì)分離（雙向電泳和高效液相層析技術(shù)）和鑒定技術(shù)（現(xiàn)代質(zhì)譜）的進(jìn)步，以及基因組學(xué)和生物信息學(xué)的交叉滲透，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)獲得了長(zhǎng)足的發(fā)展。雙向電泳技術(shù)：（等電聚焦（Isoelectric focusing，IEF）及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）雙向電泳技術(shù)。） 即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS-PAGE（按照分子大小），經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。

34、雙向電泳的實(shí)驗(yàn)流程：樣品制備、蛋白質(zhì)定量、上樣、第一向等電聚焦電泳、膠條的平衡、第二向SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)（染色）、生物信息學(xué)分析鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線 ：通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖（peptide mass fingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 雙向電泳技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可以從復(fù)雜蛋白質(zhì)得到單一蛋白質(zhì)可以觀察到同一蛋白質(zhì)的異構(gòu)體和不同的修飾和質(zhì)譜技術(shù)兼容分辨率較高信息化程度高缺點(diǎn)：低拷貝蛋白、過(guò)大過(guò)小蛋白、極酸極堿蛋白、疏水性膜蛋白等檢測(cè)苦難；穩(wěn)定性差。雙向電泳技術(shù)的應(yīng)用:分離復(fù)雜組分蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究、差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究生物質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜的基本原理：質(zhì)譜分析法是

35、通過(guò)對(duì)被測(cè)樣品離子的質(zhì)荷比的測(cè)定來(lái)進(jìn)行分析的一種方法。 被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開(kāi)而得到質(zhì)量圖譜，通過(guò)樣品的質(zhì)量圖譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。質(zhì)譜儀是一個(gè)用來(lái)測(cè)量單個(gè)分子質(zhì)量的儀器，實(shí)際上質(zhì)譜儀提供的是分子的質(zhì)量與電荷比(m/z or m/e).生物質(zhì)譜:不僅可以測(cè)定生物大分子的質(zhì)量，還可以解析其分子結(jié)構(gòu)、修飾位點(diǎn)和修飾類型等屬性，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究最有力和最重要的工具之一。質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)：進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、串聯(lián)質(zhì)譜三、常見(jiàn)生物質(zhì)譜離子源：基質(zhì)輔助的激光解析質(zhì)譜（MALDI）、電噴霧

36、質(zhì)譜（ESI-MS）MALDI-TOF的工作原理：將蛋白質(zhì)酶解成小肽段后與基質(zhì)（主要是有機(jī)酸）混合，將樣品混合物點(diǎn)到金屬靶表面上并使之干燥結(jié)晶，然后用激光轟擊，將呈離子化氣體狀態(tài)的待分析物從靶表面噴射出去。離子化氣體肽段在電場(chǎng)中被加速后到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間由肽段的質(zhì)量和其所帶電荷數(shù)的比值（m/z）決定。四、與生物質(zhì)譜聯(lián)用的分離技術(shù)氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用毛細(xì)管電泳/質(zhì)譜聯(lián)用五、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)突變的檢測(cè)與鑒定驗(yàn)證重組蛋白或重組肽的結(jié)構(gòu)和純度翻譯后修飾的檢測(cè)1、蛋白質(zhì)鑒定的路線 :I、通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖（peptide mass fingerprinting，P

37、MF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 。II、通過(guò)測(cè)出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配。 2肽指紋圖譜（PMF）鑒定:原理就是利用了蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的多肽質(zhì)量的信息與實(shí)際測(cè)得的質(zhì)量信息進(jìn)行對(duì)比而實(shí)現(xiàn)鑒定。PMF鑒定的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：是用一級(jí)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，算法簡(jiǎn)單，速度快缺點(diǎn)：質(zhì)量相近的多肽增加匹配難度無(wú)法實(shí)現(xiàn)混合蛋白的鑒定二級(jí)質(zhì)譜鑒定質(zhì)譜儀選擇一級(jí)質(zhì)譜中的一個(gè)峰，讓這些峰所代表的離子高速撞擊質(zhì)譜儀中的惰性氣體，使其肽鍵斷裂，并對(duì)庫(kù)搜索鑒定蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：鑒定準(zhǔn)確度更高，可以得到蛋白的序列可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白的鑒定缺點(diǎn)：增加了一步操作算法更復(fù)雜，而且需要更多的操作經(jīng)驗(yàn)翻譯后修飾

38、的檢測(cè)：糖基化修飾、磷酸化修飾練習(xí)題在雙向電泳技術(shù)中，SDS-PAGE電泳是按照蛋白質(zhì)的（ C ）進(jìn)行分離。 A. 等電點(diǎn) B. 電荷數(shù) C. 分子量 D. 結(jié)構(gòu)類型雙向電泳研究時(shí)，先進(jìn)行等電聚焦，再進(jìn)行SDS-PAGE。Y雙向電泳可用于差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Y雙向電泳研究時(shí)，蛋白樣品制備時(shí)要盡量避免蛋白質(zhì)的降解。Y對(duì)于雙向電泳所得到的差異蛋白點(diǎn)，需要利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。Y生物質(zhì)譜既可以測(cè)定生物大分子的質(zhì)量，還可以解析其分子結(jié)構(gòu)。Y下列哪個(gè)不是質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)成分？ （A） A. 生物傳感器 B. 離子源 C. 質(zhì)量分析器 D. 離子檢測(cè)器質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)鑒定時(shí)，一般先通過(guò)肽質(zhì)量指紋圖，如果得不

39、到結(jié)果再利用二級(jí)質(zhì)譜。Y質(zhì)譜技術(shù)可用于驗(yàn)證重組蛋白或重組肽的結(jié)構(gòu)和純度。Y質(zhì)譜技術(shù)可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)突變。Y專題八、基因功能研究方法掌握定點(diǎn)突變技術(shù)的定義和方法；掌握基因敲除的定義；掌握哺乳動(dòng)物基因敲除的步驟；掌握RNA干擾的定義；了解RNA干擾的原理和研究方法。了解什么是基因過(guò)量表達(dá)？一、基因定點(diǎn)突變(site-directed mutagenesis) 通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個(gè)（些）氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù) (gene splicing by overlap extension PCR) 和大引