發(fā)酵法生產(chǎn)L-天冬酰胺酶

1、發(fā)酵法生產(chǎn)發(fā)酵法生產(chǎn)L L天冬酰胺酶天冬酰胺酶 學生模擬組建運營一個學生模擬組建運營一個L天冬酰胺酶生產(chǎn)企天冬酰胺酶生產(chǎn)企業(yè)，撰寫計劃書業(yè)，撰寫計劃書(在理論教學期間完成在理論教學期間完成)。 市場部：市場部：L天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)、功能、天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)、功能、用途，用途，L天冬酰胺酶市場狀況與銷售預測，天冬酰胺酶市場狀況與銷售預測，競爭對手狀況與分析。競爭對手狀況與分析。 技術部：確定技術部：確定L天冬酰胺酶生產(chǎn)的工天冬酰胺酶生產(chǎn)的工藝流程及工藝參數(shù)，編制生產(chǎn)操作規(guī)程，藝流程及工藝參數(shù)，編制生產(chǎn)操作規(guī)程，確定生產(chǎn)車間的布局。確定生產(chǎn)車間的布局。 品控部：制定品控部：制定L天冬酰胺酶的質(zhì)量標天冬

2、酰胺酶的質(zhì)量標準，生產(chǎn)取樣分析操作規(guī)程，質(zhì)量檢測標準，生產(chǎn)取樣分析操作規(guī)程，質(zhì)量檢測標準和操作規(guī)程。準和操作規(guī)程。 總經(jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿總經(jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿出完整的計劃書。出完整的計劃書。L-天冬酰酶生產(chǎn)工藝天冬酰酶生產(chǎn)工藝l一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)l 由四個相同亞基組成，有由四個相同亞基組成，有222個對稱軸，個對稱軸，每個亞基含每個亞基含326個氨基酸殘基。個氨基酸殘基。l 用于兒童急性淋巴細胞白血病用于兒童急性淋巴細胞白血病 、單細胞、單細胞白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。l 機理：機理：l 降低人體內(nèi)天冬酰胺和谷氨酰胺濃度，降低人體內(nèi)

3、天冬酰胺和谷氨酰胺濃度，正常細胞可自我合成，癌細胞不具備這種正常細胞可自我合成，癌細胞不具備這種能力，從而受到抑制。能力，從而受到抑制。l 性狀：性狀：l 白色粉末，微吸濕，溶于水，不溶于有白色粉末，微吸濕，溶于水，不溶于有機溶劑。機溶劑。l二、生產(chǎn)工藝二、生產(chǎn)工藝l1 工藝路線工藝路線l2 工藝過程及控制要點工藝過程及控制要點l(1)菌種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)l 采取大腸桿菌采取大腸桿菌AS1-375，普通牛肉培養(yǎng)，普通牛肉培養(yǎng)基，接種后于基，接種后于37培養(yǎng)培養(yǎng)24h。 l(2) 種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)l 16玉米漿，接種量玉米漿，接種量11.5，37通氣攪拌培養(yǎng)通氣攪拌培養(yǎng)48h。l(3)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵

4、罐培養(yǎng)l 玉米漿培養(yǎng)基，接種量玉米漿培養(yǎng)基，接種量8，37通氣通氣攪拌培養(yǎng)攪拌培養(yǎng)68h，離心分離發(fā)酵液，得菌體，離心分離發(fā)酵液，得菌體，加加2倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然倍量丙酮攪拌，壓濾，濾餅過篩，自然風干成菌體干粉。風干成菌體干粉。 l(4) 提取、沉淀、熱處理提取、沉淀、熱處理l 每千克菌體干粉加入每千克菌體干粉加入0.OlmolL pH8.0的硼酸緩沖液的硼酸緩沖液lOL 37保溫攪拌保溫攪拌1.5h，降，降溫到溫到30以后，用以后，用5molL醋酸調(diào)節(jié)醋酸調(diào)節(jié)pH4.24.4進行壓濾，濾液中加入進行壓濾，濾液中加入0.2倍體倍體積的丙酮，放置積的丙酮，放置34h，過濾，收集沉

5、淀，過濾，收集沉淀，自然風干，即得干粗酶。自然風干，即得干粗酶。 l 取粗制酶，加入取粗制酶，加入0.3甘氨酸溶液，調(diào)節(jié)甘氨酸溶液，調(diào)節(jié)pH8.8，攪拌，攪拌1.5h，離心，收集上清液，加，離心，收集上清液，加熱到熱到6030min進行熱處理。離心棄去沉進行熱處理。離心棄去沉淀，上清液加淀，上清液加2倍體積的丙酮，析出沉淀，倍體積的丙酮，析出沉淀，離心，收集酶沉淀，用離心，收集酶沉淀，用0.01molL，pH8.0磷酸緩沖液溶解，再離心棄去不溶物，磷酸緩沖液溶解，再離心棄去不溶物，得上清酶溶液。得上清酶溶液。 l(5)精制、凍干精制、凍干l 上述酶溶液調(diào)節(jié)上述酶溶液調(diào)節(jié)pH8.8，離心棄去沉淀

6、，清液，離心棄去沉淀，清液再調(diào)再調(diào)pH7.7加入加入50聚乙二醇，使?jié)舛冗_到聚乙二醇，使?jié)舛冗_到16。在在25放置放置45天，離心得沉淀。用蒸餾水溶天，離心得沉淀。用蒸餾水溶解，加解，加4倍量的丙酮，沉淀，同法反復倍量的丙酮，沉淀，同法反復1次，沉淀次，沉淀用用pH6.4，0.05molL磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液溶解，50聚聚乙二醇反復處理乙二醇反復處理1次，即得無熱原的次，即得無熱原的L天門冬酰天門冬酰胺酶。溶于胺酶。溶于0.5molL磷酸緩沖液，在無菌條件磷酸緩沖液，在無菌條件下用下用6號垂熔漏斗過濾，分裝，冷凍干燥制得注號垂熔漏斗過濾，分裝，冷凍干燥制得注射用射用L天門冬酰胺酶成品，每支天門冬酰胺酶成品，每支1萬或萬或2萬單位。萬單位。l3 檢測方法檢測方法l 取取lml0.04molL的的L天門冬酰胺，天門冬酰胺，0.5molLpH8.4的硼酸緩沖液，的硼酸緩沖液，0.5ml細細胞懸浮液或酶液，于胞懸浮液或酶液，于37水浴中保溫水浴中保溫15min后加后加0.5ml15三氯醋酸，以終止反三氯醋酸，以終止