DNA指紋圖譜技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用-

1、D NA指紋圖譜技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用董慧明1,2,張穎23,張德民1,向光明2,李慧2(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連116029;2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所,遼寧沈陽110016摘要土壤中的微生物多樣性是十分豐富的,傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對土壤微生物多樣性的研究有很大局限性。近年來,各種基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析技術(shù)取得了長足的進步,并廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究。這些技術(shù)主要有變性梯度凝膠電泳(D GGE/溫度梯度凝膠電泳(T GGE、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP、隨機引物擴增多態(tài)性DNA(RA PD、限制性片段長度多態(tài)性(RFL P和擴增核糖體DNA限制性分

2、析(ARDRA等。對這些技術(shù)近年來在土壤微生物多樣性研究領(lǐng)域的應(yīng)用予以簡短綜述,并初步探討未來幾年土壤微生物分子生態(tài)學(xué)發(fā)展的方向。關(guān)鍵詞土壤微生物多樣性;16S rDNA;指紋圖譜分析;分子生態(tài)學(xué)中圖分類號S154.3文獻標識碼A文章編號1005-7021(200701-0045-05Application of Fingerprint Atlas Analysis B ased on16S rD NA G ene in Soil Microbial DiversityDON G Hui2ming1,2,ZHAN G Y ing2,ZHAN G De2min1,XIAN G Guang2min

3、g2,L I Hui2(1.Coll.of L i f e S ci.L i aoning N ormal Univ.Dalian116029;2.I nst.of A p pl.Ecol.Chn.A cad.of S ci.S heny ang110016AbstractThe diversity of microorganisms in soil is very abundant,however,the traditional methods to study the diversity of soil microbes were restricted greatly.Recently,f

4、ingerprints atlas analysis technologies based on 16S rDNA genes have made rapid progress,and have widely applied in the study of soil microbial diversity. They are mainly denaturing gradient gel electrophoresis(D GGE,temperature gradient gel electrophoresis (T GGE,single2strand conformation polymorp

5、hism(SSCP,randomly amplified polymorphic DNA(RA PD, terminal restriction f ragment length polymorphism(T2REL P,amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRAetc.Recent applications of these technologies in the study of soil microbial diversity were briefly summarized in this paper,and primarily

6、 investigate the direction of the development of soil microbiological mo2 lecular ecology in the near f uture.K eyw ordssoil microbial diversity;16S rDNA;fingerprints atlas analysis;molecular ecology微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。土壤中的微生物在生物圈中的生命元素(N、P等和許多痕量元素(Fe、Ni等的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,它們參與土壤中能量和營養(yǎng)交換,對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡

7、起著不可替代的作用。同時土壤微生物在土壤形成、發(fā)育、土壤肥力保持及高等植物生長方面也起著重要作用。土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的生命體,其群落結(jié)構(gòu)組成及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量及其健全性,因此對土壤微生物多樣性研究具有重要意義1。1土壤微生物學(xué)多樣性研究現(xiàn)狀依賴于顯微鏡技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)的傳統(tǒng)微收稿日期:2006-10-27作者簡介:董慧明女,碩士研究生?，F(xiàn)從事應(yīng)用與環(huán)境微生物方面的研究?；痦椖?國家自然科學(xué)基金項目(30670391;國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2004CB4185053通訊作者54微生物學(xué)雜志2007年1月第27卷第1期J OURNAL OF MICROBIO

8、LO GY J an.2007Vol.27No.1生物學(xué)研究方法對土壤微生物多樣性的描述與研究存在一定的局限性,據(jù)估計土壤中約有99%的微生物還不能在實驗室被成功地培養(yǎng)出來2。20世紀中后期隨著土壤微生物多樣性研究向多方面發(fā)展,人們也嘗試利用分析微生物細胞中某種指示成分(如磷脂脂肪酸PL FA來研究土壤微生物的種群組成,但是這些方法的缺陷是無法保證細胞中某種指示成分在土壤中的穩(wěn)定性,并且如果某種微生物的PL FA是未知的,則該不可培養(yǎng)微生物仍難以鑒別3,4。1980年,Torsvik教授首次建立了從土壤樣品中直接提取細菌DNA的方法,并于1990年用DNA雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),1g土壤中有4000

9、個以上不同的細菌種類,說明土壤中微生物多樣性是極其豐富的5。16S rDNA在原核微生物中普遍存在,并且含有相對保守區(qū)域和可變區(qū)域,大小也適合電泳技術(shù)分析,目前主要應(yīng)用16S rDNA 序列分析來研究原核微生物群落多樣性,通過與已建立的微生物16S rDNA序列數(shù)據(jù)庫比較,可以確定特定微生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系6。1986年, Pace等第一次以16S rDNA確定環(huán)境樣品中的微生物后,使人們對大量不可培養(yǎng)微生物群體有了全新的認識,此后,基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析的分子生物學(xué)技術(shù)得到迅速發(fā)展2。這些技術(shù)克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的限制,提供了一種分析整個微生物群落的方法,更為精確地揭示土壤中微生

10、物種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化。因此,基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析技術(shù)近年來被國內(nèi)外諸多學(xué)者廣泛應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究中。其總的技術(shù)路線:分離微生物基因組DNA,用特異性引物擴增16S rRNA基因片段,再將該PCR擴增產(chǎn)物進行更深一步分析,從而可在種、屬的水平上研究不同生境中的微生物種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化7。2基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析技術(shù)2.1變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳1993年,Muyzer等將變性梯度凝膠電泳(denat uring gradient gel elect rop horesis,D GGE技術(shù)引入環(huán)境微生物學(xué)多樣性的研究8。隨后,該技術(shù)被廣泛用

11、于比較不同生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落的多樣性及監(jiān)測特定微生物種群的動態(tài)變化。D GGE和T GGE(temperat ure gradient gel elect rop horesis的原理是根據(jù)含有不同序列的DNA片段(16S rRNA基因擴增產(chǎn)物在具有變性劑梯度或溫度梯度的凝膠上由于其解鏈行為的不同而導(dǎo)致遷移率的不同,部分解鏈的DNA片段在凝膠中的遷移速率低于完全螺旋形式的DNA分子,從而含有不同堿基序列的DNA片段就得到有效分離。結(jié)合PCR擴增標記基因或其轉(zhuǎn)錄物(rRNA和mRNA的D GGE方法能直接顯示微生物群落中優(yōu)勢組成成分。由于它可同時對多個樣品進行分析,使之非常適合研究微生物群落

12、的時空變化,而且可以通過對切下條帶進行序列分析或通過與獨特的探針雜交鑒定群落組成,可以方便地了解環(huán)境被干擾后的微生物群落變化或某種指示微生物的命運9。J acek和J an 利用D GGE方法分析了不同污染程度土壤細菌的群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,在微生物群落結(jié)構(gòu)上顯示出了極大的差異性10。Oliver等用D GGE方法考察了農(nóng)田微生物的變化情況,認為環(huán)境變化對農(nóng)田微生物的多樣性有很大影響11。但是, D GGE/T GGE技術(shù)也存在一定的局限性。其缺陷之一是只能分離約500bp大小的DNA片段,這限制了作為下一步用于雜交分析的探針設(shè)計。并且,研究報道有些種類細菌16S rDNA在D GGE上不只顯示

13、1條帶12,而不同種細菌的16S rDNA序列在D GGE上也可能因為具有相同的解鏈行為而不能被分開13。即便存在以上的一些局限性,D GGE/T GGE仍是分析微生物群落多樣性較為敏感的方法之一。2.2單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single2st rand conformation polymorp hism,SSCP是對16S rRNA基因擴增產(chǎn)物進行分析的另一種簡便有效的方法。該技術(shù)最初用來檢測人類DNA的基因多態(tài)性,Lee等在1996年首次報道將SSCP技術(shù)應(yīng)用到環(huán)境樣品微生物群體多樣性分析14。不同堿基序列的單鏈DNA分子構(gòu)象不同,DNA片段變性成單鏈后受到凝膠不同分子篩作用力最

14、終使不同DNA片段得到分離。電泳結(jié)束后可以將不同的條帶切下并測序,或采用特異性探針進行雜交,進而顯示該特定微生物類群的動態(tài)變化。Holly等利用SS264微生物學(xué)雜志27卷CP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在植物根際土壤中大量存在古菌Crenarchaeot,該類微生物以往一直被認為只存在于極端嗜熱環(huán)境當中15。Sabine等通過SSCP技術(shù)考察了不同鹽度(020%土壤中微生物菌群的變化,研究發(fā)現(xiàn)在高鹽度土壤中R al2 stoni a spp.和一些桿菌,包括H alomonas、Dietz i a 和A lcani vorax為優(yōu)勢菌,而在低鹽度土壤中S p hi ngomonas spp.為主要優(yōu)勢菌16

15、。但是,SS2 CP技術(shù)重現(xiàn)性較差,易受膠濃度和電泳溫度等條件的影響,另外SSCP能夠有效分離的DNA序列過短(150400bp。2.3隨機引物擴增多態(tài)性D NA由Williams建立的RA PD(Randomly am2 plified polymorp hic DNA技術(shù),因具有操作簡便、快速和經(jīng)濟等優(yōu)點而得到了廣泛應(yīng)用17。該技術(shù)以隨機寡核苷酸(510nt做為引物,擴增得到的多態(tài)性片段較短,更方便檢測兩個同源或異源等位基因的有無,適用于種內(nèi)和亞種更為細致的分類。張巒等在室內(nèi)培養(yǎng)條件下,采用RA PD分子標記技術(shù)研究了重金屬鎘和多環(huán)芳烴菲復(fù)合污染對土壤中微生物群落DNA序列多樣性的影響。結(jié)

16、果表明,培養(yǎng)15d和30d后,鎘2菲單一和復(fù)合污染均導(dǎo)致土壤微生物群落DNA 序列的豐度、均度和多樣性指數(shù)增加18。重復(fù)性不好是該技術(shù)存在的主要問題,而DNA模板的質(zhì)量與數(shù)量、MgCl2和引物濃度的變化都有可能導(dǎo)致得到不同的圖譜。另外,從條帶圖譜中無法得到任何微生物系統(tǒng)發(fā)育信息。2.4限制性片段長度多態(tài)性和擴增核糖體D NA 限制性分析RFL P(rest riction fragment lengt h polymor2 p hism方法和A RDRA(Amplified ribo somal DNA restriction analysis方法也常用于微生物群落的分析。通用引物PCR擴增得

17、到16S rDNA片段,被限制酶切割,然后再進行電泳形成不同長度的片斷進行分析。其所獲得的譜帶更為簡單,易于分析,不受菌株是否純培養(yǎng)的限制,不受宿主的干擾,具有特異性強,效率高的特點。廣泛應(yīng)用于新物種的發(fā)現(xiàn)、微生物分類及鑒定、共生菌、病原菌的微生物遺傳多樣性的檢測等。Qvreas等利用ARDRA方法考察兩種不同農(nóng)田土壤的微生物群落時,發(fā)現(xiàn)兩者無顯著差異19。張于光等利用RFL P方法對三江源地區(qū)不同的植物類型的土壤中固氮微生物群組成進行了研究,發(fā)現(xiàn)所有土壤樣品中分別具有12個優(yōu)勢微生物種群20。但是該技術(shù)所能獲得的信息量相對較少,并且難以用來評估物種的豐度和均度。2.5末端限制性片段長度多態(tài)性

18、T2RFL P(terminate2restriction lengt h f rag2 ment polymorp hism是RFL P/A RDRA方法的進一步發(fā)展,所不同的是在PCR擴增16S rRNA 基因過程中,其中一個引物用熒光標記,在計算機程序自動分析時僅分析熒光標記的末端限制片段,這樣使得限制片段長度多態(tài)性圖譜更為簡化并且每個可見的條帶都代表一個“核型”或一個分類單元21。這種方法能夠得到一個群落的特征指紋圖譜,可用于比較不同群落的相似性和由于污染壓力造成的群落結(jié)構(gòu)在時間和空間上的改變。Pett等22利用T2RFL P技術(shù)考察氧化還原電位對土壤菌群的影響,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過4d的好氧

19、/厭氧處理與未處理的土壤樣品菌群結(jié)構(gòu)相似,而經(jīng)過持續(xù)12h的厭氧或好氧處理的土壤樣品得到的分子條帶則明顯不同,在所有樣品的179種條帶圖譜中只有3種是普遍存在的,同時還發(fā)現(xiàn)土著菌群對氧化還原電位的變化具有耐受性。Cat herine等對T2RFL P方法進行了完善,采用多個限制性酶來代替單一限制性酶更有利于排除選擇酶的干擾,通過疊加靶基因酶切位點,使待定鑒定種屬在數(shù)據(jù)庫中匹配度提高23。為得到較精確的結(jié)果,可以在產(chǎn)生圖譜的同時,對分析樣品創(chuàng)建克隆、測序鑒定,但所需費用較高。3存在的問題及展望目前,以上這些技術(shù)在土壤微生物多樣性分析中得到了較為廣泛的應(yīng)用。近年來也有部分學(xué)者總結(jié)了基于16S rD

20、NA序列分析的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)用于微生物多樣性分析的局限性6,24,25。一方面,16S rDNA可能過于保守,無法把親緣關(guān)系很近的種群區(qū)分開來24,16S rRNA基因在基因組中的拷貝數(shù)多少也直接關(guān)系到PCR擴增的效率高低。另一方面,我們對于很多已經(jīng)成功培養(yǎng)出來的細菌的系統(tǒng)發(fā)生的知識了解得并不全面25。Suzuki等26從水環(huán)境樣品提取DNA構(gòu)建了16S rRNA基因文庫,同時從該樣品中分離741期董慧明等:DNA指紋圖譜技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用微生物進行純培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)許多純培養(yǎng)出來的細菌卻無法通過16S rRNA基因序列分析的方法檢測到。這意味著基于16S rDNA序列分析的分子

21、生態(tài)學(xué)方法可能低估了樣品中的微生物多樣性。此外,在基因組DNA的提取過程中可能丟失一部分DNA信息,在PCR擴增過程中由于PCR的放大也可能丟失一部分信息,因此,實驗中所提取和擴增的DNA是否能夠定量反應(yīng)整個微生物群落的種群豐度是一個值得討論的問題。指紋圖譜上的條帶是代表最豐富的種群,最容易提取DNA的種群,最具活性的種群還是這些種群的集合都是一個懸而未知的問題。但不管怎樣,基于16S rDNA序列的DNA指紋圖譜分析仍是研究土壤微生物多樣性最為有效的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)之一。它們在準確評價土壤微生物總的豐度,確定某一物種在群落中的比例和群落多樣性評價等方面都存在著不可替代的優(yōu)勢。隨著環(huán)境的惡化、污

22、染的加劇,許多寶貴的土壤微生物資源正在消失,這就更加激發(fā)人類迫切了解、認識微生物物種的緊迫性。盡快確定對于土壤生態(tài)系統(tǒng)起核心作用的微生物類群并深入研究它們的功能是一個很重要的科學(xué)問題。這可能直接關(guān)系到多樣性的保護和世界的可持續(xù)發(fā)展。因此需要不斷完善現(xiàn)有的方法,使之更加簡便準確,另外同時使用不同的技術(shù)手段從不同側(cè)面去分析研究,綜合分析應(yīng)該是科學(xué)的選擇,可能會得出一個更為準確的結(jié)果。目前已有報道,將16S rDNA指紋圖譜技術(shù)與熒光標記技術(shù)和雜交技術(shù)相結(jié)合來研究微生物群落多樣性。另外,在方法學(xué)上可以預(yù)見雜交自動化分析和平行雜交即將實現(xiàn)27,DNA微陣列(DNA microarray28、穩(wěn)定同位素

23、探針(Stable2isotope probing,SIP29、宏基因組技術(shù)(metagenome30、mRNA雜交分析27等也將會有更大的發(fā)展,這些方法與基于16S rDNA指紋圖譜分析技術(shù)相結(jié)合勢必在微生物多樣性領(lǐng)域研究中發(fā)揮重大作用,將為闡明生態(tài)和生物進化原理提供新的模式,同時也將為許多新興學(xué)科、交叉學(xué)科的發(fā)展開辟廣闊的前景。參考文獻:1Kennydy A C,Smit h K L.Soil microbial diversity and t hesustainability of a cultural soilsJ.Plant and Soil,1995,170:75286.2Pace

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