降鈣素基因相關(guān)肽衍生物的優(yōu)化表達(dá)及純化

1、降鈣素基因相關(guān)肽衍生物的優(yōu)化表達(dá)及純化 作者：肖莉杰 林平 陳文 姜穎 劉紫君 于曉光【摘要】 目的 優(yōu)化重組降鈣素基因相關(guān)肽衍生物(CGRPVY)蛋白的表達(dá)體系，并利用親和層析獲得高純度的重組蛋白。方法 在前期研究的基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的pET32a(+)rhCGRPVY在大腸埃希菌中表達(dá)，分別對(duì)時(shí)間、溫度和IPTG的濃度進(jìn)行優(yōu)化。采用NiNTA親和層析柱分離純化可溶性蛋白，YLN凝膠影像分析系統(tǒng)和Bradford法檢測(cè)純化蛋白的純度與含量。結(jié)果 重組蛋白的最佳表達(dá)條件為誘導(dǎo)時(shí)間4 h、誘導(dǎo)溫度37、IPTG濃度0.75 mmol/L，重組蛋白的最高表達(dá)量占菌體總蛋白的70%80%，高效表達(dá)的CG

2、RPVY融合蛋白大部分可溶，純化后蛋白純度可達(dá)90%以上，蛋白濃度約為0.09 mg/ml。結(jié)論 成功優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件，并用親和層析法純化出大量可溶性TrxArhCGRPVY。 【關(guān)鍵詞】 降鈣素基因相關(guān)肽衍生物;VY;優(yōu)化;純化【Abstract】 Objective To optimize the expression level of engineering strain of calcitonin generelated peptide derivant(CGRPVY), then use affinity chromatograph to obtain recombinant pr

3、otein of high purity. Methods Based on the groundwork of former research, an expression vector pET32a(+)rhCGRPVY which was constructed by this group was used to express TrxArhCGRPVY in E coli. Expression of TrxArhCGRPVY was optimized on the induction time, temperature, and the concentration of IPTG

4、respectively. The soluble fusion protein was purified by NiNTA chromatography column and its purity and content were detected by YLN2000 gel image analysis and Bradford assay. Results The optimized expression condition of TrxArhCGRPVY was obtained which was 4 h of induction, 37 of incubation, 1.0 mm

5、ol/L IPTG of final concentration. Expression conditions was optimized, the maximum yield of fusion protein was about 70% 80% of the total mass of bacterial proteins. The purity reached at least 90% and about 0.09 mg/ml protein was acquired. Conclusions To optimize the expression condition of TrxArhC

6、GRPVY in E coli successfully and obtain soluble TrxArhCGRPVY by affinity chromatograph.【Key words】 CGRPVY ;VY;Optimization;Purification降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin generelated peptide alpha，CGRP)是迄今所知體內(nèi)較強(qiáng)的擴(kuò)張血管的多肽成分，具有舒張血管、降低血壓等生理功能，同時(shí)兼有治療心衰和增強(qiáng)心輸出量的作用。降血壓肽(Angiotensinconverting enzyme inhibitory peptides，ACEI

7、P)是一類能夠降低人體血壓的小分子多肽的總稱，是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensinconverting enzyme，ACE)的抑制劑，可通過抑制人體血管緊張素的生成而達(dá)到降低血壓的目的1。其突出優(yōu)點(diǎn)是對(duì)高血壓患者具有降血壓作用，而對(duì)血壓正常的人無降壓作用，降壓作用持久、無副作用2，3。二肽VY(ValTyr)是從清酒中提取的降血壓肽，在體內(nèi)具有降血壓功能4，且無毒副作用。本室已成功構(gòu)建CGRP衍生物(CGRPVY)的基因工程菌株，并進(jìn)行了體外表達(dá)及粗提物對(duì)蟾蜍腸系膜微循環(huán)的擴(kuò)血管活性檢測(cè)，證實(shí)CGRPVY菌株粗提物具有擴(kuò)血管活性，且活性高于CGRP的菌株粗提物5。本研究進(jìn)一步探索重組質(zhì)

8、粒pET32a(+)CGRPVY在大腸埃希菌中的表達(dá)特點(diǎn)，以獲得可溶性重組CGRPVY 融合蛋白(TrxA recombinant human CGRPVY 即：TrxArhCGRPVY )的最佳表達(dá)和純化條件，以期純化出大量的TrxA rhCGRPVY，為以CGRPVY為主要成分的降血壓藥物的開發(fā)性研究做必要的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。1 材料與方法1.1 材料 菌株和質(zhì)粒：大腸埃希菌BL21trxB(DE3)pLysS和pET32a(+)質(zhì)粒載體為Novagen公司產(chǎn)品。重組菌株pET32a(+)CGRPVY由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存。主要試劑：異丙基D硫代半乳糖苷酶(IPTG)等購自

9、Promega公司，BugBuster NiNTA His.Bind 純化試劑盒為Novagen公司產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1 可溶性TrxArhCGRPVY的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化 按照單因子順序進(jìn)行，每項(xiàng)優(yōu)化結(jié)果用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首先挑選鑒定正確的單菌落接入牛肉膏蛋白胨(LB)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，獲得的菌液按照2%接種量接入含有氨芐青霉素和葡萄糖的LB培養(yǎng)基，用作培養(yǎng)條件的研究。1.2.1.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)產(chǎn)量的影響 LB培養(yǎng)基接種液在37繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.60.8，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，37 誘導(dǎo)培養(yǎng)1、2、3、4、 5、6 h，收獲細(xì)菌，15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯

10、酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分析。1.2.1.2 溫度對(duì)表達(dá)產(chǎn)量的影響 LB培養(yǎng)基接種液在37繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6 0.8，按照已經(jīng)優(yōu)化的誘導(dǎo)時(shí)間，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，在45、40、37、32、27不同條件誘導(dǎo)培養(yǎng)，收獲菌體，15% SDSPAGE分析。1.2.1.3 IPTG濃度對(duì)表達(dá)產(chǎn)量的影響 LB培養(yǎng)基接種液在已經(jīng)優(yōu)化的誘導(dǎo)溫度下繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.60.8，加入終濃度為 0.25 mmol/L、 0.50 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L IPTG，按照已經(jīng)優(yōu)化的誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間按照上步優(yōu)化

11、結(jié)果，收獲細(xì)菌，15% SDSPAGE分析。1.2.2 可溶性TrxArhCGRPVY的純化 按上一步找出的最佳表達(dá)條件，用100 ml含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB 液體培養(yǎng)基增菌后，收集菌體利用BugBuster NiNTA His.Bind 純化試劑盒中提供的裂解液裂解菌體，離心后分別將上清和沉淀進(jìn)行15%SDSPAGE電泳檢測(cè)。由于表達(dá)蛋白的N端融合了6個(gè)組氨酸，故可將菌體裂解液上清用NiNTA瓊脂糖樹脂親和層析進(jìn)行純化(具體方法參照其說明書)，純化后，15% SDSPAGE電泳檢測(cè)，采用考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。2 結(jié) 果2.1 可溶性T

12、rxA rhCGRPVY誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化2.1.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響 隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長TrxArhCGRPVY的表達(dá)量升高，但增加誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)量增高不明顯，因此，IPTG的適宜誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。見圖1。圖1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響2.1.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)量的影響 在37誘導(dǎo)時(shí)TrxArhCGRPVY的表達(dá)量最高，高于或低于37表達(dá)量均下降。見圖2。2.1.3 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的影響 隨誘導(dǎo)劑IPTG濃度的升高，蛋白表達(dá)量增加，但濃度高于0.75 mmol/L時(shí)表達(dá)量增加不明顯，因此，可選0.75 mmol/L的IPTG濃度作為最佳誘導(dǎo)劑濃度。見圖3。2.2 可溶性TrxA rh

13、CGRPVY的純化 融合蛋白TrxA rhCGRPVY主要以可溶性形式存在于菌體裂解液的上清中，經(jīng)NiNTA瓊脂糖柱親和層析純化后的洗脫液有一條清晰的約為21.2 kD的特異帶;經(jīng)光度掃描分析，TrxA rhCGRPVY蛋白占細(xì)菌總蛋白的30%，純化后蛋白純度可達(dá)90%以上，蛋白濃度約為0.09 mg/ml。見圖4。圖2 誘導(dǎo)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響泳道1，2，3，4，5的IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.25 mmol/L,0.50 mmol/L，0.75 mmol/L，1.0 mmol/L，1.5 mmol/L圖3 IPTG濃度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響泳道1：未被IPTG誘導(dǎo);泳道26：重組菌誘導(dǎo)條件均為

14、37、IPTG 誘導(dǎo)4 h，3：上清，2,4：沉淀，5，6：層析洗脫液圖4 表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE3 討 論CGRP是由Amara和Rosenfold等于1982年發(fā)現(xiàn)的37肽6，因其具有較強(qiáng)的舒張血管、降低血壓、激動(dòng)心肌和抑制血管平滑肌增殖等作用7,與心血管疾病、特別是高血壓密切相關(guān)。CGRP不僅參與疾病的發(fā)生與發(fā)展，更可以作為抗高血壓物質(zhì)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1994年，Saito等人從清酒中分離得到二肽VY，并通過口服給藥途徑，使得自發(fā)性高血壓大鼠血壓顯著下降8。VY是由纈氨酸酪氨酸組成的二肽，目前大多是從沙丁魚中提取此種活性短肽的混合品加以使用9，但提取過程繁瑣，耗時(shí)較長，不適于

15、大規(guī)模生產(chǎn)10。為了獲得降壓活性更強(qiáng)的多肽，將VY與CGRP耦聯(lián)，耦聯(lián)后不會(huì)因肽鏈太長改變蛋白分子空間構(gòu)型而影響生物活性。相反，由于降血壓肽VY可以抵抗蛋白酶的降解，在體內(nèi)降壓作用持久，因此耦聯(lián)了VY的CGRP(CGRPVY)，降壓幅度有所提高，而副作用沒有增加。在構(gòu)建pET32a(+)rhCGRPVY重組質(zhì)粒與初步表達(dá)及純化的基礎(chǔ)上，本文通過設(shè)立培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間及IPTG濃度的梯度實(shí)驗(yàn)，成功的摸索出了可溶性的TrxArhCGRPVY最佳表達(dá)條件。本研究發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度對(duì)可溶性的TrxA rhCGRPVY表達(dá)有很大的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度37、IPTG濃度0.75 m

16、mol/L和誘導(dǎo)4 h是可溶性TrxA rhCGRPVY的較佳表達(dá)條件，經(jīng)親和層析可獲得高純度的融合蛋白。本研究為以rhCGRP為主要成分的降血壓藥物的開發(fā)性研究工作奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Fujita H，Yokoyama K，Yoshikawa M.Classification and antihypertensive activity of angiotensin Iconverting enzyme inhibitory peptides derived from food proteinsJ.J Food Sci，2000;65(4)：5649.2 Pentzien AK，

17、Meisel H.Transepithelial transport and stability in blood serum of angiotensinIconverting enzyme inhibitory dipeptidesJ.Z Naturforsch C，2008;63(56):4519.3 Wu J，Ding X.Hypertensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously

18、hypertensive ratsJ.J Agric Food Chem，2001;49(1)：5016.4 Matsui T,Tamaya K,Seki E,et al.Absorption of ValTyr with in vitro angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activity into the circulating blood system of mild hypertensive subjectsJ.Biol Pharmacol Bull，2002;25(9):122830.5 林 平，鄒海峰,于 靖,等.降鈣素基因相關(guān)肽衍生物克隆表達(dá)與活性鑒定J.中國老年學(xué)雜志,2008;28(18)：17902.6 Rosenfeld MG，Mermod JJ，Amara SG，et a