基因工程知識點(diǎn)全

1、第一章 基因工程概述 1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程（Genetic engineering）原稱遺傳工程。從狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。因此，供體、受體和載體稱為基因工程的三大要素。1.分離目的基因 2.限制酶切目的基因與載體3.目的基因和載體DNA在體外連接 4.將重組DNA分子轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞,進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng) 5.選擇、篩選含目的基因的克隆6.培養(yǎng)、觀察目的基因的表達(dá)第二章 基因工程的載體和工具酶 1. 基因工程載體必須滿足哪些基本條件？ 具有對受

2、體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性或親和性。 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)。 具有合適的篩選標(biāo)記。 分子量小，拷貝數(shù)多。 具有安全性。2. 質(zhì)粒載體有什么特征，有哪些主要類型？1、自主復(fù)制性2、可擴(kuò)增性3、可轉(zhuǎn)移性4、不相容性 主要類型有1.克隆質(zhì)粒2.測序質(zhì)粒3.整合質(zhì)粒4.穿梭質(zhì)粒5.探針質(zhì)粒6.表達(dá)質(zhì)粒3. 質(zhì)粒的構(gòu)建（1）刪除不必要的 DNA 區(qū)域，盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提高外源 DNA 片段的裝載量。一般來說，大于20Kb 的質(zhì)粒很難導(dǎo)入受體細(xì)胞，而且極不穩(wěn)定。（2）滅活某些質(zhì)粒的編碼基因，如促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的 mob 基因，杜絕重組質(zhì)粒

3、擴(kuò)散污染環(huán)境，保證 DNA 重組實(shí)驗(yàn)的安全，同時滅活那些對質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)的基因，提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)（3）加入易于識別的選擇標(biāo)記基因，最好是雙重或多重標(biāo)記，便于檢測含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。（4）在選擇性標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識別及切割位點(diǎn)的 DNA序列，即 多克隆接頭（Polylinker），便于多種外源基因的重組，同時刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)，使其單一化，以便環(huán)狀質(zhì)粒分子經(jīng)酶處理后，只在一處斷裂，保證外源基因的準(zhǔn)確插入。（5）根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。4. 什么是人工染色體載體？將細(xì)菌接合因子、酵母或人類染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在

4、一起，即可構(gòu)成染色體載體5. 什么是穿梭載體？人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的載體。6.入-噬菌體載體及構(gòu)建l-DNA為線狀雙鏈DNA分子，長度為48.5kb，在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端。 1縮短長度提高外源 DNA 片段的有效裝載量刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 引入單一的多酶切位點(diǎn)接頭序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 滅活某些與裂解周期有關(guān)基因。 使-DNA載體只能在特殊的實(shí)驗(yàn)條件下感染裂解宿主細(xì)菌，以避免可能出現(xiàn)的污染現(xiàn)象的發(fā)生。 加裝選擇標(biāo)記，便于重組體的檢測7.M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體 過定點(diǎn)誘變技術(shù)封閉重復(fù)的重要限制性酶

5、切口。 引入合適的選擇性標(biāo)記基因，如含有啟動子、操作子和半乳糖苷酶氨基端編碼序列（lacZ）的乳糖操縱子片段（lac）、組氨酸操縱子片段（his）以及抗生素抗性基因等。 將人工合成的多克隆位點(diǎn)接頭片段插在 lacZ標(biāo)記基因內(nèi)部，使得含有重組子的噬菌斑呈白色，而只含有載體 DNA 的混濁噬菌斑呈藍(lán)色。 （4）在多克隆位點(diǎn)接頭片段的兩側(cè)區(qū)域改為統(tǒng)一的 DNA 測序引物序列，使得重組 DNA 分子的單鏈形式經(jīng)分離純化后，可直接進(jìn)行測序反應(yīng)。8. II類限制性內(nèi)切核酸酶的特點(diǎn)限制性核酸內(nèi)切酶（ Restriction endonucleases）是一類能在特異位點(diǎn)上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的

6、限制性片段的核酸水解酶。 識別位點(diǎn)的特異性：每種酶都有其特定的DNA識別位點(diǎn)，通常是由4、5或6核苷酸組成的特定序列（靶序列）。 識別序列的對稱性：靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。 切割位點(diǎn)的規(guī)范性：雙鏈DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的切割位點(diǎn)旋轉(zhuǎn)對稱（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。同位酶：一部分酶識別相同的序列，但切點(diǎn)不同，這些酶稱為同位酶。同裂酶：識別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同的不同來源的酶稱為同裂酶同尾酶（Isocandamers）：識別位點(diǎn)不同，但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列，這些酶稱為同尾酶。9.甲基化酶類限制性內(nèi)切酶有相應(yīng)甲基化酶伙伴，甲

7、基化酶的識別位點(diǎn)與限制性內(nèi)切酶相同，并在識別序列內(nèi)使某位堿基甲基化，從而封閉該酶切口。甲基化酶在封閉一個限制性內(nèi)切酶切口的同時，卻產(chǎn)生出另一種酶的切口 甲基化酶可修飾限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，從而使DNA免受相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶的切割。 甲基化酶的用途就是在必要時可以封閉某一限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。10.DNA連接酶連接作用的特點(diǎn):DNA連接酶需要一條DNA鏈的3末端有一個游離的羥基（-OH），另一條DNA鏈的5末端有一個磷酸基（-P）的情況下，只有在這種情況下，才能發(fā)揮連接DNA分子的作用。只有當(dāng)3OH和5P彼此相鄰，并且各自位于與互補(bǔ)鏈上的互補(bǔ)堿基配對的兩個脫氧核苷酸末端時，DNA連

8、接酶才能將它們連接成磷酸二酯鍵。DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。DNA連接酶只能封閉雙螺旋DNA上失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈缺口（nick），而不能封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的單鏈裂口（gap）。由于在羥基和磷酸基團(tuán)之間形成磷酸二酯鍵是一種吸能反應(yīng)，因此，DNA連接酶在進(jìn)行連接反應(yīng)時，還需要提供一種能源分子（NAD或ATP）11.大腸桿菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？DNA聚合酶作用的特點(diǎn)： 要有底物4種dNTP為前體催化合成DNA。 接受模板指導(dǎo)。 需要有引物（3羥

9、基）的存在。 不能起始合成新的DNA鏈。 催化dNTP加到生長中的DNA鏈3-OH末端。 催化DNA的合成方向是53。Klenow酶的基本性質(zhì)： 大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端604個氨基酸殘基片段,即Klenow酶。分子量為76kDa。 Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和53的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。 Klenow酶的基本用途： 修復(fù)由限制性核酸內(nèi)切酶造成的 3凹端，使 之成為平頭末端。 以含有同位素的脫氧核苷酸為底物，對DNA 片段進(jìn)行標(biāo)記。 用于催化 cDNA 第二鏈的合成。 用于雙脫氧末端終止法測定 DNA 的序列。

10、12.T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性： 有35的核酸外切酶活性和53的DNA聚合酶活性。 在無dNTP時，可以從任何3-OH端外切。 在只有一種dNTP時，外切至互補(bǔ)核苷酸。 在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3粘性末端13. 影響連接效率的因素有： 溫度（最主要的因素）離子濃度 ATP的濃度( 10mM - 1mM ) 連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高） 反應(yīng)時間（通常連接過夜） 插入片段和載體片段的摩爾比 DNA末端性質(zhì) DNA片段的大小 14.如何將不同DNA分子末端進(jìn)行連接？ 1.相同粘性末端的連接 如果

11、外源DNA與載體DNA均用相同的限制性內(nèi)切酶切割，則不管是單酶酶解還是雙酶聯(lián)合酶解，兩種DNA分子均含有相同的粘性末端，因此混合后能順利的連接成一個重組DNA分子 2.平頭末端的連接T4-DNA連接酶在ATP和高濃度酶的條件下，能連接具有完全堿基配對的平末端DNA分子，但平末端連接效率不高，基因操作不經(jīng)常采用。 3.不用粘性末端的連接 3端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平 5端的粘性末端用klenow酶補(bǔ)平，或者用S1核酸酶切平 最后用T4-DNA連接酶進(jìn)行平末端連接15. 堿性磷酸酶有什么作用？1.該酶用于載體 DNA的5末端除磷操作，以提高重組效率；2.用于外源DNA片段的5端除磷，則可

12、有效防止外源 DNA 片段之間的連接。16. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶有哪些作用？ 給載體或目的DNA加上互補(bǔ)的同聚物尾。 DNA片段3末端的同位素標(biāo)記。17. 2、細(xì)菌轉(zhuǎn)化的步驟： 感受態(tài)的形成。感受態(tài)時細(xì)胞表面出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶類，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合、切割及加工。感受態(tài)細(xì)胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)某些與感受態(tài)有關(guān)的特征性蛋白質(zhì)（如細(xì)菌溶素）的合成，使細(xì)菌胞壁部分溶解，局部暴露出細(xì)胞膜上的 DNA 結(jié)合蛋白和核酸酶等。 轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合。受體菌細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，單鏈DNA或RNA雙鏈RNA以及DNA/RN

13、A雜合雙鏈都不能結(jié)合在膜上。 轉(zhuǎn)化因子的吸收。雙鏈 DNA 分子與結(jié)合蛋白作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而另一條鏈則被吸收到受體菌中。 整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈 DNA 與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復(fù)合物前體結(jié)構(gòu)，它能有效地保護(hù)單鏈DNA免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導(dǎo)至受體菌染色體DNA處。 轉(zhuǎn)化因子單鏈DNA的整合。供體單鏈DNA片段通過同源重組，置換受體染色體DNA的同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈 DNA結(jié)構(gòu)。18.Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原理：在0的Cacl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核

14、酸酶解離開來，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。 Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。 但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。19.PEG介導(dǎo)細(xì)菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚體,它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu), 使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)

15、生疏散和重組,此時相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能,從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合。20.電穿孔法是指在細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質(zhì)膜上形成納米大小的微孔，DNA直接通過這些微孔或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法。P52 接合轉(zhuǎn)化，入噬菌體感染未歸納 21.轉(zhuǎn)化率的影響因素.載體及重組DNA方面載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。載體的空間構(gòu)象：與受體細(xì)胞親和性較強(qiáng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體。插入片段大?。簩|(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低。重組DNA分子的濃度和純度受體細(xì)胞方面：受體細(xì)胞必

16、須與載體相匹配轉(zhuǎn)化操作的影響22.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作：指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37培養(yǎng)一個小時 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程 噬菌體轉(zhuǎn)染后的30培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作擴(kuò)增操作的目的 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序。 擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選。 表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定。23.抗藥性篩選法這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標(biāo)記進(jìn)行的篩選方法?？顾幮院Y選法的基本原理：抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)： 非重組子呈 Ap

17、r、Tcr 重組子呈 Apr、Tcr 將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcs 抗藥性篩選法的基本操作：先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Tc的平板上 在Ap平板上生長，但在Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為重組子 P56抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法 經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了進(jìn)一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進(jìn)行再次篩選。如果外源基因插入在載體的抗藥性基因中間使得該抗藥性基因失活，這種抗藥性標(biāo)記就會消失，從而篩選出陽性重組子。 24. 什么是藍(lán)白斑篩選法？這種方

18、法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來篩選重組體。主要是在l載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌b半乳糖苷酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的l載體轉(zhuǎn)入lac的宿主菌后，在含有5溴4氯3引哚bD半乳糖苷(X-gal)平板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解X-gal的能力，轉(zhuǎn)入lac-宿主菌后，在含有5溴4氯3引哚bD半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。25.PCR篩選法利用合適的引物，以從初選出來的陽性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，通過對PCR產(chǎn)物的電泳分析，確定目的基因是否插入到載體中。由于在載體DNA分

19、子中，外源DNA插入位點(diǎn)的兩側(cè)序列多數(shù)是已知的，可以設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的PCR引物，以待鑒定的轉(zhuǎn)化子或重組子的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)特異性擴(kuò)增DNA帶，并且其分子量同預(yù)期的一致，則可確定含此重組DNA分子的重組子是期待的重組子。第三章 基因工程的常規(guī)技術(shù) 1. 探針有哪些類型？探針標(biāo)記有哪些方法？類型：同源或部分同源探針cDNA探針 人工合成的寡核苷酸探針標(biāo)記方法：5端標(biāo)記法反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法缺刻前移標(biāo)記法ABC標(biāo)記法4.什么是ABC熒光（顯色酶）標(biāo)記法？ABC 標(biāo)記法。 A為Avidin（生物素抗性蛋白），每個Avidin分子可結(jié)合3 - 4個生物素分子； B為Bi

20、otin（生物素），每個Biotin分子可結(jié)合2個Avidin分子； C為Complex，首先將Biotin共價結(jié)合在探針分子上，熒光胺標(biāo)記在Avidin上，兩者形成復(fù)合物，即可將熒光胺標(biāo)記在探針上，發(fā)出的熒光也能使普通膠片感光。如果將某一生色酶接在Avidin上，并輔以合適底物，則雜交反應(yīng)還可直接以顏色反應(yīng)檢測，這一技術(shù)稱為酶標(biāo)技術(shù)5.亞克隆法 亞克?。菏菍⒖寺∑芜M(jìn)一步片段化后再次進(jìn)行的克隆。 一般是將重組DNA分別用幾種限制性核酸內(nèi)切酶切割后，將所得各片段分別重組到載體上再轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，然后通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型鑒定或鑒定，獲得含有目的基因的重組子。此時，該重組分子中的無關(guān)DNA區(qū)域以被大量

21、刪除。6. 菌落（嗜菌斑）原位雜交的基本原理、流程 該項(xiàng)技術(shù)是直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合再與特異性DNA探針雜交,篩選出含有插入序列菌落。 操作步驟：菌落生長轉(zhuǎn)移到NC膜上DNA釋放和變性 （變成單鏈DNA）： 10SDS 0.5M NaOH中和 0.5M Tris-HCl pH 8.0固定 80 120雜交（包括預(yù)雜交，加探針DNA雜交）放射自顯影對照比較，選出重組克隆7.鳥槍法 鳥槍法：將某種生物體的全基因組或單一染色體切成大小適宜的 DNA 片段，分別連接到載體 DNA上，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，形成一套重組克隆，從中篩選出含有目的基因

22、的期望重組子。鳥槍法制備目的基因的主要步驟 目的基因組DNA片段的制備超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端。 （原核生物的基因長度大都在2Kb以內(nèi)，真核生物的基因長度變化很大，最大的基因可達(dá)100Kb以上)。全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控。部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。 DNA片段與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體。 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體

23、細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。 篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）。 目的基因的定位利用鳥槍法獲得的期望重組子只是含有目的基因的 DNA 片段，必須通過次級克隆或插入滅活，在已克隆的 DNA 片段上準(zhǔn)確定位目的基因，然后對目的基因進(jìn)行序列分析，搜尋其編碼序列以及可能存在的表達(dá)調(diào)控序列。8.cDNA法酶促逆轉(zhuǎn)錄主要用于合成分子質(zhì)量較大，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA易分離的目的基因。這種方法以目的基因的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成互補(bǔ)的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段，與適

24、當(dāng)?shù)妮d體重組后轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，獲得目的基因的cDNA克隆。9.mRNA的分離純化 絕大多數(shù)的真核生物mRNA在其3端都存在一個多聚腺苷酸的尾巴，利用它可以迅速的將mRNA從細(xì)胞總的混合物中分離出來，將寡聚脫氧胸腺嘧啶共價交聯(lián)在纖維素分子上，制成親和層析柱，然后將細(xì)胞總的RNA混合物上層析柱分離，mRNA會掛在層析住上，后洗脫即可分離10. 簡述PCR技術(shù)的基本原理，PCR反應(yīng)體系的主要成分與主要程序是怎樣的？PCR技術(shù)的基本原理：類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。過程：PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至9

25、3左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。11.

26、 什么是基因組文庫？其構(gòu)建方法是怎樣的？是指將某種生物的全部基因組的遺傳信息貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時能夠隨時應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因遺傳信息的材料，就稱為基因文庫又稱DNA文庫?；蚪M文庫構(gòu)建的一般步驟 載體的選擇和制備。 高純度、大分子量基因組 DNA 的提取。 基因組 DNA 的部分酶切與分級分離。 載體與DNA片段的連接。 轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。篩選鑒定基因組及保存。12. 基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件： 重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力 載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因

27、被分 隔克隆。 克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以 利于克隆排序。 克隆片段易于從載體分子上完整卸下。 重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選?；蛭膸斓臉?gòu)建通常采用鳥槍法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原則 1.DNA片段之間要有一定的重疊序列 2.DNA片段大小要均一14.cDNA文庫構(gòu)建的步驟 細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離 第一鏈cDNA合成 第二鏈cDNA合成 雙鏈cDNA的分級分離 雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖 重組體的篩選與鑒定第四章 基因在大腸桿菌、酵母的高效表達(dá) 1. 啟動子 啟動子：是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并 能起始轉(zhuǎn)錄的序列，

28、其大小在20300個堿基， 是控制基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控元件。在一定條件下 mRNA的合成速率與啟動子的強(qiáng)弱密切相關(guān)，而 轉(zhuǎn)錄又在很大程度上影響基因的表達(dá)。 啟動子的特征：序列特異性方向性位置特 性種屬特異性 2.啟動子類型 組成型啟動子：是指在該類啟動子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。 組織特異啟動子：又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。 誘導(dǎo)型啟動子：是指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。目前已經(jīng)分離了光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子、

29、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動子等。 3.終止子終止子：是位于結(jié)構(gòu)基因下游的一段DNA序列，基因轉(zhuǎn)錄時，該序列被轉(zhuǎn)錄為mRNA的一部分，并形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，由此終止基因的轉(zhuǎn)錄。4.SD序列 SD序列：mRNA中起始密碼子上游8-13個核苷酸處有一段富含嘌呤核苷酸的順序，它可以與30S亞基中的16S rRNA 3端富含嘧啶的尾部互補(bǔ)，形成氫鍵結(jié)合，有助于mRNA的翻譯從起始密碼子處開始5.密碼子不同生物對密碼子的偏愛性1.生物體基因組中的堿基含量2.密碼子與反密碼子的相互作用的自由能3.細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量6. 密碼子偏愛性對外源

30、基因表達(dá)的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因7. 包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體8. 包涵體的形成機(jī)理 折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)集聚作用。 非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)集聚作用 蛋白折疊中間體的集聚作用。9. 包涵體的分離檢測 包涵體的分離主要包括菌

31、體破碎、離心收集以及清洗三大操作步驟。10. 分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將 蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將 細(xì)菌的抗菌蛋白（細(xì)菌素）分泌到培養(yǎng)基中，這一 過程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi) 膜上的磷酸酯酶A，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大 因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個 合適的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此 時，用另一種攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的 基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并 使用相同性質(zhì)的啟動子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，則可 實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。11融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)

32、建原則： 受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物 可以通過親和層析進(jìn)行特異性簡單純化。 外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融 合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需 要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能避免融合 蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，為目的 蛋白分離回收創(chuàng)造條件。 兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要， 它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。 兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架。12.理想變性劑的特點(diǎn)1.變形溶解速度快2.對包含體中殘留細(xì)胞碎片的分離沒有干擾3.無溫度依賴性4.對蛋白酶沒有抑制作用5.對蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)無化學(xué)反應(yīng)活性 13. 哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法1.磷酸鈣共沉淀法2.電擊轉(zhuǎn)化法3.脂質(zhì)體介導(dǎo)法4.顯微注射法 第五章 基因治療 1. 基因治療的概念與策略是什么？基因治療：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實(shí)施相應(yīng)的策略?；蛑委煵呗裕褐苯踊蛑委熀烷g接基因治療2. 基因治療的基本程序是怎樣的？基因治療包括基因診斷、基因分離、載體構(gòu)建和基因轉(zhuǎn)移四項(xiàng)基本內(nèi)容。3. 基因治療的分子機(jī)制 正?；颍簭慕】等梭w內(nèi)分離克隆，它或通過同源重組方式置換病變基因，或依靠其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)病變基因的非功能性蛋白的生理作用。這類基因通常用于矯正各種基因缺陷型