兩種測定蛋白質(zhì)含量方法的比較

1、 兩種測定蛋白質(zhì)含量方法的實驗比較兩種測定蛋白質(zhì)含量方法的實驗比較 目的要求目的要求 （1）學(xué)習(xí)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的原理和方法。）學(xué)習(xí)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的原理和方法。 （2）學(xué)習(xí)紫外吸收法測定蛋白質(zhì)的原理和方法。）學(xué)習(xí)紫外吸收法測定蛋白質(zhì)的原理和方法。 （3）比較兩種測定蛋白質(zhì)方法的優(yōu)缺點。）比較兩種測定蛋白質(zhì)方法的優(yōu)缺點。實驗原理實驗原理 一、雙縮脲法：一、雙縮脲法： 具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)合物其最大光吸收在合物其最大光吸收在5

2、40540nmnm處。處。 蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與能與CuCu2+2+形成紫紅色絡(luò)合物。其顏色深淺與蛋形成紫紅色絡(luò)合物。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無關(guān)，酸的組成無關(guān)，該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍適該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于于110110mg /mLmg /mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測定。測定。紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為：二、紫外吸收法：二、紫外吸收法： 蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在

3、280nm波長處有最大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測定。 紫外線吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速，簡便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測。 此法的缺點是：（1）對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中核酸等吸收紫外線的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。 不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，測定結(jié)果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據(jù)。該法可測定蛋白范圍應(yīng)在0.11.0mg /mL。 試劑和器材試劑和器材 試劑：試劑： 雙

4、縮脲試劑雙縮脲試劑： 材料材料 1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 兩種濃度的結(jié)晶牛血清白蛋白溶液(BSA)。 2. 待測蛋白質(zhì)溶液 人血清（稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測試范圍內(nèi)。） 操作方法操作方法 一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 二、樣品測定二、樣品測定三、計算三、計算取兩組測定的平均值計算：血清樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100mL）= 其中,Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)得濃度（mg/mL），N為稀釋倍數(shù)，V為血清樣品所取的體積（mL），c為樣品原濃度（mg/mL）。Y x NV （1 1）須于顯色后）須于顯色后3030minmin內(nèi)比色測定。各管由顯色到比色的內(nèi)比色測定。各管由顯色到比色的時間應(yīng)盡可能一致

5、。時間應(yīng)盡可能一致。（2 2）有大量脂肪性物質(zhì)同時存在時，會產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混）有大量脂肪性物質(zhì)同時存在時，會產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混合物，這時可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液合物，這時可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測定。再測定。（3 3）由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯）由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時也會影響紫外吸收法測定蛋蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時也會影響紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。注意事項注意事項 思考題思考題1干擾雙縮脲實驗的因素有哪些？干擾雙縮脲實驗的因素有哪些？ 2若樣品中含有核酸類雜質(zhì)