兩種測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較

1、 兩種測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的實(shí)驗(yàn)比較兩種測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的實(shí)驗(yàn)比較 目的要求目的要求 （1）學(xué)習(xí)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法。）學(xué)習(xí)雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法。 （2）學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法。）學(xué)習(xí)紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理和方法。 （3）比較兩種測(cè)定蛋白質(zhì)方法的優(yōu)缺點(diǎn)。）比較兩種測(cè)定蛋白質(zhì)方法的優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 一、雙縮脲法：一、雙縮脲法： 具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)在堿性溶液中雙縮脲與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的紫好色復(fù)合物其最大光吸收在合物其最大光吸收在5

2、40540nmnm處。處。 蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與能與CuCu2+2+形成紫紅色絡(luò)合物。其顏色深淺與蛋形成紫紅色絡(luò)合物。其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸的組成無關(guān)，酸的組成無關(guān)，該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍適于于110110mg /mLmg /mL。雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速雙縮脲法常用于蛋白質(zhì)的快速測(cè)定。測(cè)定。紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)為：二、紫外吸收法：二、紫外吸收法： 蛋白質(zhì)分子中所含酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)在

3、280nm波長(zhǎng)處有最大吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。 紫外線吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速，簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，廣泛應(yīng)用在柱層析分離中蛋白質(zhì)洗脫情況的檢測(cè)。 此法的缺點(diǎn)是：（1）對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中核酸等吸收紫外線的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。 不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外線吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，測(cè)定結(jié)果也還存在一定的誤差。但是可作為初步定量的依據(jù)。該法可測(cè)定蛋白范圍應(yīng)在0.11.0mg /mL。 試劑和器材試劑和器材 試劑：試劑： 雙

4、縮脲試劑雙縮脲試劑： 材料材料 1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 兩種濃度的結(jié)晶牛血清白蛋白溶液(BSA)。 2. 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液 人血清（稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試范圍內(nèi)。） 操作方法操作方法 一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 二、樣品測(cè)定二、樣品測(cè)定三、計(jì)算三、計(jì)算取兩組測(cè)定的平均值計(jì)算：血清樣品蛋白質(zhì)含量（mg/100mL）= 其中,Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)得濃度（mg/mL），N為稀釋倍數(shù)，V為血清樣品所取的體積（mL），c為樣品原濃度（mg/mL）。Y x NV （1 1）須于顯色后）須于顯色后3030minmin內(nèi)比色測(cè)定。各管由顯色到比色的內(nèi)比色測(cè)定。各管由顯色到比色的時(shí)間應(yīng)盡可能一致

5、。時(shí)間應(yīng)盡可能一致。（2 2）有大量脂肪性物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混）有大量脂肪性物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，會(huì)產(chǎn)生渾濁的反應(yīng)混合物，這時(shí)可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液合物，這時(shí)可用乙醇或石油醚使溶液澄清后離心，取上清液再測(cè)定。再測(cè)定。（3 3）由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯）由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時(shí)也會(huì)影響紫外吸收法測(cè)定蛋蛋白溶液中存在核酸或核苷酸時(shí)也會(huì)影響紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。白質(zhì)含量的準(zhǔn)確性。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 思考題思考題1干擾雙縮脲實(shí)驗(yàn)的因素有哪些？干擾雙縮脲實(shí)驗(yàn)的因素有哪些？ 2若樣品中含有核酸類雜質(zhì)